Name: 热通菌膜-双磷酶抑制剂的筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 了解利用钼蓝反应在96孔板中筛选Thermotoga maritima膜结合焦磷酸酶抑制剂的方法。该方案成本低廉、操作简便，可在高磷脂浓度条件下稳定显色，为抗寄生虫药物研发提供可靠工具。

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本工作获得了Jane和Aatos Erkko基金会以及英国生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC，项目号BB/M021610）向Adrian Goldman提供的资助，芬兰科学院向Keni Vidilaseris（项目号308105）、Henri Xhaard（项目号310297）和Jari Yli-Kauhaluoma（项目号265481）提供的资助，以及赫尔辛基大学研究基金向Gustav Boije af Gennäs提供的资助。作者感谢Bernadette Gehl在项目期间提供的技术协助。

1. 蛋白质制备
注意：TmPPase 的表达与纯化方法已在其他文献中描述13。
<ol>
	<li>配制10 mL重激活缓冲液，其中含有20 mM 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）pH 6.5、3.5%（v/v）甘油、2 mM二硫苏糖醇（DTT）和0.05%十二烷基麦芽糖苷（DDM）。</li>
	<li>配制10 mL反应混合液，其中含有200 mM Tris-Cl pH 8.0、8.0 mM MgCl2、333 mM KCl和67 mM NaCl。 
	注意：Mg2+用于螯合焦磷酸盐（mPPase的底物），K+可增强酶活性，因为TmPPase是一种依赖钾离子的膜结合型焦磷酸酶，而Na+则在TmPPase介导的钠离子转运过程中对酶活性具有必要作用。</li>
	<li>制备30 mg/mL脂质体用于酶重激活。
	<ol>
		<li>将0.3 g大豆来源的L-α-磷脂酰胆碱加入10 mL含1 mM DTT的20 mM Tris-HCl pH 8.0溶液中。</li>
		<li>将脂质体置于冰上，以1秒脉冲间隔超声处理1分钟，暂停1分钟，重复操作直至溶液变为透明黄色。</li>
		<li>分装脂质体，液氮中速冻后于-80 °C保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行酶的重激活。
	<ol>
		<li>将40 µL脂质体溶液与22.5 µL 20% DDM混合。</li>
		<li>在55 °C加热15分钟，随后冷却至室温。</li>
		<li>加入36.5 µL重激活缓冲液，混匀，再加入1 µL浓缩蛋白（13 mg/mL），使终浓度达到0.13 mg/mL。 
		注意：蛋白通常在纯化后以10 µL分装冷冻保存，使用前置于冰上解冻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取20 µL重激活后的酶液加入1,480 µL反应混合液中，轻轻混匀。 
	注意：重激活后的酶液应在使用前立即加入反应混合液中。</li>
</ol>
2. 化合物制备
<ol>
	<li>根据化合物的可获得性，将化合物溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成50−200 µL、25−100 mM的储备液。 
	注意：本实验所用的所有化合物（图2A）此前已有报道9。若化合物溶解度较低，可相应调整储备液浓度。</li>
	<li>将每种化合物用水配制三种不同浓度。 
	注意：反应体系中的终浓度分别为：易溶化合物1、5和50微摩尔，难溶化合物1、5和20微摩尔。
	<ol>
		<li>在微量离心管中，用蒸馏水将储备液稀释至1 mL，得到易溶化合物浓度为2 µM、10 µM和100 µM，或难溶化合物浓度为2 µM、10 µM和40 µM。</li>
		<li>稀释后立即涡旋振荡化合物溶液，确保充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用浊度计检测化合物是否发生聚集。 
	注意：该实验在96孔板中进行，每种浓度设三个重复，浓度分别为1 µM、5 µM和20 µM，并以空白对照组进行归一化处理。
	<ol>
		<li>使用多通道移液器将75 µL反应混合液加入各孔中。</li>
		<li>向各孔中加入75 µL不同浓度的化合物溶液（空白对照孔加入75 µL水），并通过上下吹打5次混匀。</li>
		<li>使用微孔板浊度计在300 V条件下测定各孔的浊度值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 检测准备所需的试剂
<ol>
	<li>配制亚砷酸盐-柠檬酸盐溶液。
	<ol>
		<li>称取 5 g 亚砷酸钠和 5 g 柠檬酸三钠二水合物。 
		警告：亚砷酸钠具有毒性，因此须使用适当的防护装备并特别小心操作。作为预防措施，在未阅读并理解所有必要的安全注意事项之前，请勿进行操作。仅可在通风橱中操作，以避免吸入该化合物或其溶液的粉尘/蒸气。若不慎吸入，请立即转移至空气新鲜处并寻求医疗救助。佩戴合适的化学防护护目镜、防护手套和防护服，避免吞食及眼睛或皮肤接触。若不慎吞咽，请立即联系中毒控制中心或医生。若接触皮肤或眼睛，请用大量清水冲洗，并立即就医。</li>
		<li>溶于100 mL水中。</li>
		<li>加入5 mL冰醋酸，混匀，加水至250 mL。</li>
		<li>室温避光保存。 
		注意：该溶液可稳定保存一年以上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制溶液A和溶液B。
	<ol>
		<li>将10 mL冰冻的0.5 M HCl加入0.3 g抗坏血酸中，配制成溶液A。通过涡旋振荡溶解抗坏血酸。</li>
		<li>对于溶液B，将1 mL冰水加入70 mg四水合七钼酸铵中，涡旋振荡至溶解。 
		注意：两种溶液均需在使用前置于冰上保存。为保证检测结果的一致性，两种溶液在冰上保存的时间最长不得超过一周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备磷酸盐（Pi标准品的浓度 0 µM, 62.5 µM, 250 µM 和 500 µM 用于校准。
	<ol>
		<li>添加 0 µL, 25 µL, 50 µL，以及 100 µL 5 mM Na2HPO4 二水合物至四个含有 370 µL 反应混合物的</li>
		<li>加水至1 mL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
单个96孔板的活性检测实验
注意：参见图1以了解该检测方法的示意图工作流程。
<ol>
	<li>将1 mL溶液B加入10 mL溶液A中，涡旋混匀，并将溶液置于冰上保存。 
	注意：该溶液应为透明黄色。溶液A + B在使用前需在冰上保存至少30分钟。但应在3小时内使用，因长期储存会导致溶液变质。</li>
	<li>使用多通道移液器，将0 µM、62.5 µM、250 µM和500 µM的Pi标准品各40 µL以每组三个复孔的方式加入管条中。 
	注意：未添加Pi的反应混合物将作为空白对照。</li>
	<li>使用多通道移液器向管条中加入25 µL化合物溶液。 
	注意：每种化合物设置三个不同浓度，每个浓度设三个复孔，足以初步估算半数最大抑制浓度（IC50）。如需更精确测定IC50，可使用八个不同浓度。对于未抑制的酶，用等体积水替代化合物溶液。阳性对照使用2.5 µM、25 µM和250 µM的咪唑二磷酸钠盐（IDP）。</li>
	<li>使用多通道移液器向管条中加入15 µL mPPase溶液混合物（Pi标准品管除外）。</li>
	<li>用粘性封口膜密封管条。将封口膜剪开，使每条管条相互分离。</li>
	<li>将样品在71 °C预孵育5分钟。将各管条以20秒间隔依次放置于加热块上，以尽量减少后续步骤中的时间差异。</li>
	<li>对每条管条，打开粘性封口膜，使用多通道移液器加入10 µL 2 mM焦磷酸二钠溶液，并上下吹打5次混匀。再次使用同一封口膜密封管条。 
	注意：此步骤最初可能难以在20秒内完成，但经过几次实验后会变得更容易。</li>
	<li>在71 °C孵育5分钟。</li>
	<li>将各管条以20秒间隔依次放置于冷却装置上。冷却10分钟，但在冷却5分钟后对每条管条短暂离心，以去除封口膜下方的冷凝水珠，然后放回冷却装置并移除封口膜。 
	注意：冷却装置可通过将一个96孔PCR板置于盛有水的聚苯乙烯培养皿（尺寸150 mm × 15 mm）中，冷冻至少1小时制得。实验开始前约5分钟应将装置从冰箱中取出。切勿在样品冷却前立即取出冷却装置，否则会导致反应混合物冻结，影响显色。</li>
	<li>冷却10分钟后，向每条管条中加入60 µL溶液A + B，上下吹打5次混匀，并将管条继续置于冷却装置上10分钟。</li>
	<li>加入90 µL亚砷酸盐-柠檬酸溶液，在室温下静置至少30分钟，以产生稳定的蓝色。 
	注意：由于亚砷酸钠具有毒性，所有含亚砷酸钠的溶液均需始终格外小心操作。因此，亚砷酸盐-柠檬酸溶液的添加应在通风橱中进行。</li>
	<li>将各反应混合物180 µL分别转移至透明的96孔聚苯乙烯微孔板中。</li>
	<li>使用微孔板分光光度计在860 nm波长下测定每孔的吸光度。</li>
</ol>
5. 结果分析
<ol>
	<li>对每个样本的三个重复值取平均值，并计算 Pi 标准品。然后减去空白对照以消除背景信号。</li>
	<li>通过绘制吸光度（A860) 值相对于P的量的变化曲线i 标准（nmol），并使用以下公式进行线性回归以获得趋势线函数： 
	<img alt="吸光度方程 A&lt;sub&gt;860&lt;/sub&gt; = mP&lt;sub&gt;i&lt;/sub&gt; + b，光谱分析公式。" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ01a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"></li>
	<li>根据上述线性回归公式计算酶促反应释放的磷酸盐量（nmol）。</li>
	<li>使用以下公式计算比活性： 
	<img alt="酶特异性活性方程；酶动力学；酶活性测定公式" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ02a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2"> 
	其中 nPi 是反应中释放的磷酸盐量（nmol）， t 是反应时间（min），以及 mTmPPase 是用于测定的纯化TmPPase的量（mg）。</li>
	<li>使用以下公式计算每种抑制剂浓度下的活性百分比： 
	<img alt="百分比活性公式；% 活性 = (SAi/SAun) × 100%；生化分析方程" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ03a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 3"> 
	其中 SAi i含抑制剂样品的比活性 SA未 是未抑制样品的比活性。</li>
	<li>计算 logIC50 （估算）和 IC50 （估算）采用以下公式，通过四参数剂量-反应曲线的非线性回归拟合进行计算： 
	<img alt="Logistic回归公式，Y = Bottom + (Top - Bottom) / (1 + 10^((logIC50 - X) * HillSlope))。" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ04a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 4"> 
	其中 X 为浓度的对数值（ µM），Y 为活性（%），Top 和 Bottom 分别为与 Y 同单位的平台值（分别为 100% 和 0%），logIC50 与 X 具有相同的对数单位，而 HillSlope = 斜率因子或希尔斜率，无单位。 
	注意：软件（材料表) 用于拟合。使用浓度为 0.01 µM （而不是 0.00 µM由于未加抑制剂的样本中零的对数无定义，因此无法计算。</li>
</ol>

<ol><li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+research+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li>
<li>Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li>
<li>Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+pyrophosphatases%3A+a+novel+drug+target+for+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens.</a> AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).</li>
<li>Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrophosphate-Fueled+Na%2B+and+H%2B+Transport+in+Prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).</li>
<li>Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B-PPases%3A+yesterday%2C+today+and+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">H+-PPases: yesterday, today and tomorrow.</a> IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuolar-H%2B-pyrophosphatase+%28TgVP1%29+is+required+for+microneme+secretion%2C+host+cell+invasion%2C+and+extracellular+survival+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).</li>
<li>Lemercier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyrophosphatase+regulating+polyphosphate+metabolism+in+acidocalcisomes+is+essential+for+Trypanosoma+brucei+virulence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).</li>
<li>Belogurov, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+pyrophosphatase+of+Thermotoga+maritima+requires+sodium+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity.</a> Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).</li>
<li>Vidilaseris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetry+in+catalysis+by+Thermotoga+maritima+membrane-bound+pyrophosphatase+demonstrated+by+a+nonphosphorus+allosteric+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor.</a> Science Advances. 5 (5), (2019).</li>
<li>Lin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+membrane-embedded+H%2B-translocating+pyrophosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase.</a> Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).</li>
<li>Fiske, C. H., Subbarow, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+colorimetric+determination+of+phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The colorimetric determination of phosphorus.</a> Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).</li>
<li>Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molybdenum+blue+reaction+for+the+determination+of+orthophosphate+revisited%3A+Opening+the+black+box%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box.</a> Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).</li>
<li>Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+and+purification+of+membrane-bound+pyrophosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases.</a> Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).</li>
<li>Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+orthophosphate+determination+of+thermostable+membrane-bound+pyrophosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity.</a> Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).</li>
<li>He, Z. Q., Honeycutt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+molybdenum+blue+method+for+orthophosphate+determination+suitable+for+investigating+enzymatic+hydrolysis+of+organic+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+in+Soil+Science+and+Plant+Analysis%22%5BJournal%5D)">A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates.</a> Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).</li>
<li>Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorinated+tyrosine+phosphates+to+probe+the+substrate+specificity+of+the+low+molecular+weight+phosphatase+activity+of+calcineurin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).</li>
<li>Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+strategy+to+determine+the+dependence+of+membrane-bound+pyrophosphatases+on+K%2B+as+a+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor.</a> Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文报道了一种基于Vidilaseris等人14方法的详细实验方案，用于在96孔板体系中简便筛选来自T. maritima的膜结合型焦磷酸酶抑制剂。该方法成本低廉，基于正磷酸盐与钼酸盐在酸性条件下生成12-磷钼酸，并被还原为具有明显蓝色的磷钼酸还原物12。相较于其他方法（如灵敏度更高的孔雀绿法16），本方法具有优势，因为在TmPPase复活所需的高磷脂浓度条件下，本方法不会产生干扰信号14。
筛选流程的工作流程如图1所示，整个过程可在1小时内完成。本方案针对TmPPase优化，其最适工作温度为71 °C，反应时间为5分钟。由于在此温度下反应混合物中的水会蒸发，因此使用粘性密封膜（裁剪至合适尺寸以覆盖排管）防止蒸发14，蒸发的水分可通过离心重新收集。选择5分钟的孵育时间，...

大约25%的细胞总蛋白为膜蛋白，其中约60%是药物靶点1,2。膜结合型焦磷酸酶（mPPases）是一种潜在的药物靶点3，属于二聚体酶类，可通过将焦磷酸水解为两个正磷酸盐，驱动质子和/或钠离子跨膜转运4。mPPases存在于多种生物体中5，如细菌、古菌、植物和原生生物寄生虫，但人类和动物中不存在4。在原生生物寄生虫中，例如Plasmodium falciparum、Toxoplasma gondii和Trypanosoma brucei，mPPases对寄生虫的致病性至关重要6，若在这些寄生虫中敲除该蛋白的表达，则会导致其在外界碱性pH环境下无法维持细胞内pH稳态7。由于mPPases具有重要功能且在脊椎动物中无同源蛋白，因此可被视为治疗原生生物性疾病潜在的药物靶点3。
本研究中体外筛选mPPase抑制剂基于TmPPase模型系统。TmPPase是一种来自T. maritima的钠离子泵型、钾离子依赖性mPPase，其最适活性温度为71 °C8。该酶的优势包括易于表达与纯化、良好的热稳定性以及高比活性。TmPPase不仅与原生生物mPPase在催化残基的位置和身份上完全保守且具有高度相似性3,9，还与已解析的绿豆（Vigna radiata）10 mPPase结构高度相似。TmPPase在不同构象下的可用结构也为基于结构的药物设计实验（如虚拟筛选和从头设计）提供了便利。
本文报道了一种在96孔板中筛选TmPPase抑制剂的详细方案（图1）。该方案基于钼蓝比色法，最初由Fiske和Subbarow建立11。该方法的原理是在酸性条件下，正磷酸盐与钼酸盐反应生成12-磷钼酸，随后被还原生成呈特征蓝色的磷钼酸复合物12。

<table><tbody><tr><td>粘性密封膜</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>四水合七钼酸铵</td><td>Merck</td><td>F1412481 636</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95212-250G</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 96孔多联培养皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Merck</td><td>1167431000</td><td></td></tr><tr><td>8联PCR管条（0.2 ml，无盖，120个）</td><td>Nippon genetics</td><td>FG-028</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基麦芽糖苷（DDM）</td><td>Melford</td><td>B2010-100G</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Merck</td><td>1009901001</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Merck</td><td>1000631011</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML</td><td></td></tr><tr><td>亚氨基三磷酸钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0631-1G</td><td></td></tr><tr><td>大豆卵磷脂来源的L-&amp;alpha;-磷脂酰胆碱</td><td>Sigma</td><td>429415-100GM</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8147330500</td><td></td></tr><tr><td>96孔PCR板（多联板）</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9651</td><td></td></tr><tr><td>MultiSkan Go</td><td>Thermo Scientific</td><td>10680879</td><td></td></tr><tr><td>Nepheloskan Ascent（型号750）</td><td>Labsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯培养皿（尺寸150 mm × 15 mm）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5981-100EA</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6 软件</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QBT2 加热模块</td><td>Grant Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>偏亚砷酸钠</td><td>Fisher Chemical</td><td>12897692</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Pi）</td><td>Sigma</td><td>S0876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>焦磷酸氢二钠</td><td>Fluka</td><td>71501-100G</td><td></td></tr><tr><td>二水合柠檬酸三钠</td><td>Fluka</td><td>71404-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

筛选 thermotoga maritima 膜结合型焦磷酸酶抑制剂

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

膜结合型焦磷酸酶（mPPases）是一类存在于细菌、古菌、植物以及原生生物寄生虫中的二聚体酶。这些蛋白可将焦磷酸裂解为两个正磷酸分子，并同时驱动质子和/或钠离子跨膜转运。由于动物和人体内不存在同源蛋白，mPPases 是设计潜在药物靶点的良好候选。本文介绍了一种利用钼蓝反应在96孔板系统中筛选 mPPase 抑制剂的详细实验方案。我们以嗜热菌 Thermotoga maritima 的膜结合型焦磷酸酶（TmPPase）作为模型酶。该方案操作简便、成本低廉，结果稳定且重复性好。从实验开始到完成吸光度测定，整个活性检测过程仅需约一小时。由于本实验产生的蓝色产物在较长时间内保持稳定，因此可在前一批样品完成后立即开始下一批检测，所有批次的吸光度可统一在后期一次性测定。该方案的缺点是需手动操作，可能较为耗时，并对移液技术和时间控制能力有较高要求。此外，本实验所用的亚砷酸盐-柠檬酸溶液含有剧毒的亚砷酸钠，操作时应采取必要的安全防护措施。

在本实验方案中，测试了八种化合物（1−8）（图2A），同时以焦磷酸酶常用抑制剂IDP作为阳性对照。每种化合物均在三个不同浓度（1 µM、5 µM 和 20 µM）下进行三复孔测试。筛选流程如图1所示，从样品与试剂准备开始，直至在860 nm处进行吸光度测定。
在本实验方案结束时，加入溶液A+B以及亚砷酸盐-柠檬酸盐后，由于磷酸根离子与钼酸盐形成复合物，溶液会呈现出稳定的蓝色，在709 nm和860 nm处具有最大吸收峰14，该现象可被观察到，并表明酶促反应的发生。在本实验中，我们采用860 nm处的吸光度来测定释放的Pi量，因为相较于709 nm处的吸光度，其检测限更低且灵敏度更高15。蓝色在室温孵育30分钟后完全显色，并至少在5小时内保持稳定14。该检测方法的灵敏度可达Pi浓度...

本文介绍了一种基于96孔板中钼蓝反应的筛选方法，用于筛选来自Thermotoga maritima的膜结合型焦磷酸酶抑制剂。

筛选 Thermotoga maritima 膜结合型焦磷酸酶抑制剂

膜结合型焦磷酸酶（mPPases）是存在于细菌、古菌、植物和原生生物寄生虫中的二聚体酶。这些蛋白质可裂解……

本方案可作为筛选抑制膜结合型焦磷酸酶失活化合物的工具，此类抑制剂可用于多种寄生虫病的治疗。该方案成本低廉、操作简便，可长时间产生稳定的显色反应，且在酶复活所需高浓度磷脂存在下无任何干扰。配制10毫升重激活缓冲液，其中包含20毫摩尔/升的M-E-S（pH 6.5）、3.5%（体积分数）甘油、2毫摩尔/升的D-T-T和0.05% D-D-M。另配制10毫升反应混合液，其中包含200毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（pH 8.0）、8毫摩尔/升氯化镁、333毫摩尔/升氯化钾和67毫摩尔/升氯化钠。为制备用于酶再活化的30毫克/毫升脂质体，首先将10毫升pH 8的20毫摩尔Tris盐酸盐溶液（含1毫摩尔D-T-T）加入0.3克大豆来源的L-α-磷脂酰胆碱中。将脂质体置于冰上，以每秒脉冲间隔超声处理1分钟。静置一分钟，重复操作直至溶液变为透明黄色。将脂质体分装为每份100微升，用液氮速冻后于负80摄氏度保存备用。为恢复酶活性，将脂质体溶液在室温下解冻。将40微升脂质体溶液与22.5微升20% D-D-M混合。在55摄氏度下孵育15分钟，然后使其冷却至室温。然后，加入36.5 µL的复性缓冲液，混匀。再加入1 µL浓缩蛋白，使终浓度达到0.13 mg/mL。接着，将20 µL复性后的酶转移至1480 µL反应混合液中。轻柔混合并立即使用。首先，将化合物溶解于DMSO中，配制成50毫摩尔浓度的储备液，体积为200微升。对于可溶性化合物，将储备液用蒸馏水在微量离心管中稀释至1毫升，得到2、10和100微摩尔的浓度。对于每个稀释度，涡旋混匀化合物溶液以确保充分混合。随后，检查化合物是否存在偏差，并使用多通道移液器将75 µL反应混合物加入96孔板的每个孔中。以三复孔形式分别加入75 µL每种化合物及作为对照的水，通过上下吹打五次进行混匀。使用微孔板浊度计在300伏特下测量每个孔。配制亚砷酸盐柠檬酸溶液时，称取五克亚砷酸钠和五克柠檬酸三钠二水合物，将这两种化合物溶解于100毫升水中，然后加入五毫升冰醋酸。混合，并加水至250毫升，于室温避光保存。接下来，通过将10毫升冰浴的0.5摩尔盐酸加入0.3克抗坏血酸中来配制溶液A，通过涡旋使抗坏血酸溶解。通过将1毫升冰浴水加入70毫克四水合四硫代钼酸铵中配制溶液B，并涡旋至溶解。将溶液A和B置于冰上保存。为进行校准，配制浓度为0、62.5、250和500微摩尔的磷酸盐标准溶液。向四个含有370微升反应混合液的微量离心管中，分别加入0微升、12.5微升、50微升和100微升的5毫摩尔/升磷酸二氢钠二水合物溶液。加水定容至1毫升。然后将1毫升溶液B加入10毫升溶液A中，手动混匀，并将混合溶液置于冰上保存。使用多通道移液器，分别向三份试管中加入40微升的0、62.5、250和500微摩尔磷酸盐标准品。然后向每支试管中加入 25 µL 化合物溶液和 15 µL M-P-P-A 溶液混合物，含磷酸盐标准品的试管除外。使用粘性封板膜密封试管条。将密封膜裁剪，以分离每个管条。接下来，将样品在71摄氏度下预孵育5分钟。将样品放置在加热块上，每条管条之间间隔20秒。对于每一条试纸，打开粘性密封。使用多通道移液器，加入 100 微升 2 摩尔的焦磷酸钠二碱。然后通过上下移液 5 次进行混匀。使用相同的封膜重新密封试管条。再次于71摄氏度孵育5分钟。随后，将样品以每条间隔20秒的节奏置于冷却装置上。静置冷却5分钟，然后短暂离心各条带，使封膜下方的水滴沉降至管底。将条带放回冷却装置，移除封膜，再冷却5分钟。随后加入60微升溶液A和B，用移液器上下吹打5次混匀，并将条带继续置于冷却装置中静置10分钟。在通风橱中，加入 90 µL 亚砷酸盐柠檬酸盐溶液，并在室温下放置至少 30 分钟，以产生稳定的蓝色。将每种反应混合物各 180 µL 分装至透明的 96 孔聚苯乙烯微孔板中。使用微孔板分光光度计在860纳米处测定每个孔的吸光度。在本实验方案中，八种化合物与I-D-P一同进行测试，其中I-D-P是一种常见的焦磷酸酶抑制剂，作为阳性对照。加入溶液A和溶液B以及亚砷酸柠檬酸盐后，在室温下孵育30分钟，出现蓝色。三种非抑制性化合物的浓度均显示出相同的蓝色强度，与未添加任何抑制剂的 E-1 至 E-3 结果一致。酶活性随各测试化合物浓度变化的曲线图显示，具有抑制活性的化合物呈现出非线性拟合曲线。作为阳性对照的 I-D-P 曲线明显显示出在较高浓度下活性降低。化合物一、五、六、七和八的抑制曲线其半数最大抑制浓度分别为 1.7 µM、21.4 µM、58.8 µM、239.0 µM 和大于 500 µM。请记住，在实验开始前立即配制 M-P-P-A 溶液。

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了解利用钼蓝反应在96孔板中筛选Thermotoga maritima膜结合焦磷酸酶抑制剂的方法。该方案成本低廉、操作简便，可在高磷脂浓度条件下稳定显色，为抗寄生虫药物研发提供可靠工具。

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