Name: 利用活体中鸡胆膜研究妇科和泌尿癌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 了解利用鸡胚绒毛尿囊膜模型进行妇科和泌尿肿瘤研究的体内实验方法。该技术可在免疫耐受环境中快速培养肿瘤细胞，用于评估新型治疗策略的疗效。

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作者感谢 Fuyuhiko Tamanoi 博士和 Binh Vu 在本方法初始培训中提供的帮助。与 Eva Koziolek 博士的讨论对优化该方法起到了关键作用，作者对此深表感谢。本研究的开展离不开以下资助方的支持：烟草相关疾病研究计划博士后奖学金（27FT-0023，授予 ACS）、美国国防部（DoD）卵巢癌研究计划（W81XWH-17-1-0160）、NCI/NIH（1R21CA216770）、烟草相关疾病研究计划高影响力试点奖项（27IR-0016），以及加州大学洛杉矶分校（UCLA）的机构支持，包括琼森综合癌症中心（JCCC）种子基金（NCI/NIH P30CA016042）和副校长研究办公室授予 LW 的 3R 基金。

本研究中所有实验均经加州大学洛杉矶分校（UCLA）相应的伦理委员会审查和批准。使用去标识化的原代人类肿瘤已获得UCLA机构审查委员会的批准（方案编号：17-000037、17-001169 和 11-001363）。在UCLA，使用鸡胚的实验无需经过动物研究委员会审查；仅当鸡蛋将被孵化时才需要获得方案批准。然而，研究人员遵循了最佳实践规范，例如《美国兽医协会动物安乐死指南》（AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals），以确保对鸡胚进行人道处理，并尽可能避免其遭受疼痛。建议研究人员在开展使用CAM模型的研究之前，核实所在机构的相关监管要求。
1. 准备卵子
<ol>
	<li>在接收鸡蛋之前，按照制造商的说明将孵化箱组装并预热至37.8 °C（100 °F），湿度保持在60-70%。 
	注意：为尽量减少污染风险，可使用经高压灭菌的水来控制湿度。</li>
	<li>从经认证的实验级蛋品供应商处收到受精的罗得岛红鸡鸡蛋后，用纸巾干擦蛋壳表面。如有必要，可使用略微湿润的纸巾去除附着物，随后立即擦干。 
	注意：使用低于43.3 °C的液体润湿蛋壳可能将细菌带入蛋内。若需清洗或消毒鸡蛋，液体温度必须控制在43.3-48.9 °C之间；温度过高可能导致蛋内内容物受热变性。消毒剂的选择应根据所关注的微生物种类而定。</li>
	<li>使用铅笔或标记笔在蛋壳上标注日期，此日记为发育第0天。</li>
	<li>将鸡蛋放入孵化箱中，持续孵化至少7天，并保持定期翻转以促进绒毛尿囊膜（CAM）发育。可使用自动翻蛋装置，或每日人工翻蛋180°，2-3次。</li>
</ol>
2. 孵化卵子
注意：应在绒毛尿囊膜（CAM）完全发育后进行卵壳 opening，通常在发育第7天或第8天进行。
<ol>
	<li>使用70%乙醇对生物安全柜进行消毒。同样地，将蛋架、照蛋灯、记号笔、配备碳化硅研磨石和圆形切割轮的无线旋转工具、18号针头、带1/4英寸真空管的移液控制器、封箱胶带、办公剪刀、弯头剪刀、Semken（或类似）镊子、棉球以及6 cm × 7 cm的透明薄膜敷料消毒后放入生物安全柜中。尽可能使用无菌、一次性或经高压灭菌的器械。</li>
	<li>关闭蛋旋转器。将约1–3枚蛋放置于生物安全柜内的蛋架上。在暗处将照蛋灯紧贴蛋壳，以识别气室位置，并用记号笔标记气室所在区域。 
	注意：照蛋灯的光照强度对于观察蛋内结构至关重要。若始终难以看清气室或血管系统，可尝试更换照蛋灯电池。</li>
	<li>移动照蛋灯在蛋壳表面寻找较大的血管网络。必要时旋转蛋体。理想的血管系统应位于蛋的中部并呈分支状。使用记号笔描出拟用于移植的血管区域。</li>
	<li>打开生物安全柜的照明灯。使用配备碳化硅研磨石的无线旋转工具，在气室中心正上方的蛋壳上钻一个小孔。钻至大部分蛋壳被去除，但白色内膜保持完整。 
	注意：在定位血管系统前先在气室上方钻孔，有助于确定该枚蛋在气室区域的蛋壳厚度，而非绒毛尿囊膜（CAM）和血管区域的厚度。若CAM或血管系统受损，则该蛋不可用于移植。</li>
	<li>在拟打开血管窗的位置，参照步骤2.4的方法钻开并打开另一个小孔。</li>
	<li>使用18号针头，轻轻刺穿气室和血管区域上方的白色内膜。若无法穿透，可小心继续钻取少许。确保整个钻孔区域的白色内膜（但不包括CAM）均被破坏，无需取出膜片。 
	注意：若在此步骤中损伤了CAM或血管系统，应弃用该蛋。若钻孔处有血液或蛋清渗出，则表明已造成损伤。</li>
	<li>关闭生物安全柜的照明灯。使用照蛋灯确认气室已从蛋的一端转移至血管区域上方。如有必要，将连接至移液控制器的真空管置于原气室孔口周围，短时轻柔抽吸，以移动气室位置。</li>
	<li>使用记号笔在气室–CAM边界内约0.5 cm处标出新气室的轮廓。将一段封箱胶带贴于新气室上方。如有需要，可用普通办公剪刀将胶带修剪至合适大小。 
	注意：胶带可能阻碍蛋壳通气，因此其尺寸不应超过完全覆盖气室所需的最小范围。</li>
	<li>将蛋放回孵育箱中，在不旋转的条件下预热，确保新气室朝上。对剩余待开窗的蛋重复步骤2.2–2.9。 
	注意：本方案可在此暂停。若对CAM发育质量存疑，可先让少量蛋进行至步骤2.16，再决定是否打开其余蛋。</li>
	<li>将约1–3枚已完成气室重定位的蛋放置于生物安全柜内的蛋架上。 
	注意：应避免将污染物带入已打开的蛋中。因此，务必在生物安全柜内操作，并尽可能使用无菌器械和设备。</li>
	<li>使用配备圆形切割轮的无线旋转工具，沿步骤2.8中标记的气室边界上方切割一条小线。确保切割位置位于实际气室–CAM边界内约0.5 cm处，以避免损伤CAM或血管系统。完全切穿蛋壳，但注意深度，避免损伤CAM或血管系统。</li>
	<li>使用弯头剪刀沿剩余的气室边缘剪开，形成蛋壳窗口。 
	注意：若移除的蛋壳上附着血液或膜状物，则该蛋不适合用于移植。若多数蛋未能干净开窗，建议至少再等待1天再打开其余蛋，以促进更成熟的CAM形成。若其余蛋的蛋壳尚未穿孔，应恢复孵育箱内蛋的旋转。</li>
	<li>验证胚胎的存活状态。存活胚胎应表现出广泛的血管网络、清澈的蛋清、胚胎活动或可见的心跳。</li>
	<li>使用Semken镊子从无菌棉球上撕取小块棉絮，轻轻擦拭CAM表面，去除蛋壳粉尘和碎屑。 
	注意：碎屑清除必须在开窗当天完成。</li>
	<li>用1/4片6 cm × 7 cm的透明薄膜敷料覆盖蛋壳开口。</li>
	<li>将蛋放回孵育箱。确保蛋体稳固，开窗面朝上，且CAM不接触透明薄膜敷料。对于容易滚动的蛋，可使用蛋架部件、蛋旋转器边缘或其他合适物品进行支撑。</li>
	<li>对所有剩余待开窗的蛋重复步骤2.10–2.16。 
	注意：开窗操作无需与移植在同一天完成。至少等待1天有助于淘汰因开窗操作而活力受损的蛋。</li>
</ol>
3. 准备用于移植的癌细胞悬液（选项1）
注意：此步骤应在移植前立即完成，移植最好在第7至第10天之间进行。有关移植日期的更多信息，请参见步骤5或步骤6开头的说明。所有细胞系及培养的肾癌肿瘤组织消化液均采用该方法。
<ol>
	<li>将细胞外基质溶液置于冰上解冻。</li>
	<li>采用机械和/或酶消化方法，根据拟移植细胞类型的特性选择合适的方法制备单细胞悬液。</li>
	<li>将拟移植的全部细胞重悬于适合移植的培养基中。通常每枚鸡胚移植 1–2 × 106 个细胞。 
	注意：细胞系移植所用培养基通常为该细胞常规培养所用的完全培养基，含有胎牛血清（FBS）或血清替代物。肿瘤组织消化后的移植通常使用同类型癌症细胞系培养所用的完全培养基。但可根据实验需要对培养基成分进行调整，其对肿瘤发育和生长的影响需通过实验确定。</li>
	<li>根据所用细胞类型选择适当的离心速度和时间进行细胞沉淀。通常离心速度为 250–300 ×g，时间为 5–10 分钟。</li>
	<li>用移液器吸除细胞沉淀中的上清液。通过轻弹管壁或吹打，将细胞在残留的少量培养基中机械性重悬。置于冰上冷却。使用适当规格的移液器测量细胞与培养基的总体积。</li>
	<li>计算移植体积，使每枚鸡胚中植入 1–2 × 106 个细胞，总体积为 20–100 μL，且最终细胞外基质蛋白浓度为 2.7–4 mg/mL。根据该计算结果加入培养基、所需生长因子或其他添加剂以及细胞外基质溶液。配制完成后置于冰上，待移植时使用。 
	注意：在步骤 3.3 和 3.6 的计算中，应额外增加至少相当于半枚鸡胚移植体积的量，以确保整组实验鸡胚均有足够的移植液。对于卵巢癌细胞系（如 SKOV3 和 ID8），每枚鸡胚植入 106 个细胞；对于肾细胞癌细胞系 RENCA、来源于消化后人原发性肾细胞癌的培养细胞、前列腺癌细胞系（如 CWR、C4-2 和 MyC-CaP）以及膀胱癌细胞系（如 HT-1376 和 T24），每枚鸡胚植入 2 × 106 个细胞。</li>
</ol>
4. 准备受体移植的肿瘤组织（方案2）
注意：此步骤应在移植前立即完成，移植最好在第7至第10天之间进行。有关移植日期的更多信息，请参见步骤5或步骤6开头的说明。原发性卵巢癌和膀胱癌以肿瘤组织块的形式进行移植。
<ol>
	<li>将细胞外基质溶液在冰上解冻。用含有所需生长因子或添加剂的适当培养基将其稀释至终蛋白浓度为 2.7–4 mg/mL。保持在冰上。
	 
	注意：肿瘤组织块的移植通常使用该癌症类型细胞系培养所用的完全培养基。然而，可根据实验需要对培养基成分进行调整。其对肿瘤移植和生长的影响需通过实验确定。</li>
	<li>使用手术刀或剪刀从新鲜肿瘤组织上切取组织块。理想大小为每边 2–5 mm。在准备移植前，保持组织浸没于培养基中。</li>
</ol>
5. 使用防粘环进行植入（选项1）
注意：如果绒毛尿囊膜（CAM）已完全发育，可在发育第7天开始植入细胞。植入可在孵化前的任何时间进行，只要留有足够时间用于肿瘤发育和完成目标实验即可，但需注意胚胎的免疫细胞大约在受精后第10天开始出现27。肿瘤生长速度因细胞类型而异，需针对感兴趣的细胞类型通过实验经验确定。卵巢癌和前列腺癌细胞采用防粘连环法进行植入。请注意，若无防粘连环，可将移液器吸头剪裁至类似大小后使用。
<ol>
	<li>使用70%乙醇对生物安全柜及所有所需工具进行消毒：蛋架、弯头虹膜镊、防粘环（1/4英寸内径）、玻璃搅拌棒、适当体积的移液器及吸头、6 cm × 7 cm透明薄膜敷料、办公剪刀以及记号笔或铅笔。应尽可能使用无菌、一次性或经高压灭菌的工具。</li>
	<li>将待植入的鸡蛋放置于生物安全柜内的蛋架上。选择适量的鸡蛋，通常不超过六个。操作过程中应避免鸡蛋过度冷却。</li>
	<li>通过将透明薄膜敷料的边缘向开口处滚动的方式将其从蛋壳上移除，以避免撕下蛋壳碎片。检查鸡蛋是否具有活性且健康。理想的鸡蛋在开口区域中央应有一条主血管，并有较小的血管从其分支延伸。</li>
	<li>使用弯头虹膜镊将无菌防粘环放置于血管上方的绒毛尿囊膜（CAM）上，理想位置为分支点处。用无菌玻璃搅拌棒轻轻刮擦绒毛尿囊膜。</li>
	<li>将步骤3.6中获得的细胞悬液移取至防粘环中心。或者，使用镊子将步骤4.2中获得的肿瘤组织块置于防粘环中心，并加入20–50 μL步骤4.1中制备的细胞外基质溶液覆盖。</li>
	<li>用一块四分之一大小的6 cm × 7 cm透明薄膜敷料封闭开口。用适当的植入编号标记鸡蛋。 
	注：对同组鸡蛋进行编号有助于进行纵向观察。</li>
	<li>将鸡蛋放回培养箱。确保蛋壳开口朝上，并固定稳妥。 
	注：鸡蛋可放回孵化箱中且无需旋转。或者，也可使用37–38 °C的细胞培养箱（关闭CO2，并使用湿度计监测湿度，湿度应维持在50%–80%），以获得较高的植入后存活率。</li>
</ol>
6. 无防粘连环植入（选项2）
注意：如果绒毛尿囊膜（CAM）已完全发育，最早可在发育第7天开始植入细胞。只要在孵化前留有足够的时间用于肿瘤生长和完成目标实验，植入可在任何时间进行，但需注意胚胎的免疫细胞大约在受精后第10天开始出现27。本方法曾用于肾细胞癌细胞和膀胱癌细胞的植入。
<ol>
	<li>使用70%乙醇对生物安全柜及所有所需工具进行消毒：适当体积的移液器和吸头、无菌10 cm组织培养皿、蛋架、6 cm × 7 cm透明薄膜敷料、办公剪刀和标记笔。</li>
	<li>用适当大小的移液器吸头吸取第3.6步制备的细胞悬液接种量（通常为200 μL）。握住吸头顶端部分，小心弹出移液器吸头，并水平放置于无菌的10 cm组织培养皿中。</li>
	<li>对每组内的所有样品重复步骤6.2，每组使用一个培养皿。</li>
	<li>将吸头放入37 °C培养箱中孵育15–30分钟，使细胞外基质部分聚合。</li>
	<li>孵育15分钟后，开始检查聚合情况。当吸头放置在培养皿上时，通常会有少量液体从吸头流出。该液体的聚合情况可用于估计吸头内部液体的聚合程度。</li>
	<li>将待植入的鸡蛋放置于生物安全柜内的蛋架上。选择适量的鸡蛋，通常最多六个。操作过程中应避免鸡蛋明显降温。</li>
	<li>通过将透明薄膜敷料边缘向开口处滚动的方式将其从蛋壳上去除，以避免撕下蛋壳碎片。</li>
	<li>检查鸡蛋是否存活且健康。理想的鸡蛋在开口区域中央应有一条主血管，并有较小的分支血管从其延伸而出。</li>
	<li>将一个移液器吸头装到合适大小的移液器上，按下活塞，将部分聚合的细胞悬液接种到CAM（绒毛尿囊膜）上较大的、发育良好的血管处，理想位置为分支点上方。</li>
	<li>用四分之一片6 cm × 7 cm透明薄膜敷料封闭开口。</li>
	<li>用适当的植入编号标记鸡蛋。 
	注意：对组内鸡蛋进行编号有助于进行纵向观察。</li>
	<li>将鸡蛋放回培养箱。确保蛋壳开口朝上，且鸡蛋放置稳固。 
	注意：鸡蛋可放回专用蛋培养箱中且无需翻转。或者，也可使用37–38 °C的细胞培养箱（关闭CO2供应），并配备湿度计监测湿度（应维持在50%–80%），以获得较高的植入后存活率。</li>
</ol>
7. 萤火虫荧光素酶标记肿瘤的生物发光成像
注意：如果移植的细胞已通过稳定转导携带编码萤火虫荧光素酶或其他成像因子的基因，则可利用生物发光成像技术对所形成的肿瘤进行可视化观察。由于蛋壳会产生较强的背景信号，因此不建议对完整鸡蛋进行荧光成像。此为终点分析，因为打开蛋壳会显著降低胚胎存活率。可根据实验需求及肿瘤生长速度，在任何合适的时间点进行肿瘤成像。然而，鸡蛋通常在受精后21天孵化，因此第18天是避免意外孵化的合适终点时间。
<ol>
	<li>如有必要，将鸡蛋运送至成像设施。用胶带将鸡蛋固定在10厘米组织培养皿上，并放回37.8 °C（100 °F）的孵卵器中，孵卵器的旋转装置应已移除或关闭。运输和成像过程中湿度并非关键因素。</li>
	<li>使用弯头虹膜镊子轻轻将绒毛尿囊膜（CAM）从蛋壳推开，直至CAM与蛋清及胚胎齐平。使用宽头镊子将蛋壳碎片逐步去除，以充分扩大蛋壳开口，便于肿瘤观察。</li>
	<li>向鸡蛋蛋清中注射至少50 μL的30 mg/mL D-荧光素。也可将类似体积的D-荧光素用移液器加入防粘环内或植入细胞所在区域的CAM表面，以确保在血管供应不理想的情况下仍能获得最佳生物发光信号。孵育8分钟。</li>
	<li>向鸡蛋蛋清中注入20–50 μL异氟烷，以麻醉胚胎。继续孵育额外2分钟。或者，也可将鸡蛋置于含有2–2.5%气化异氟烷的诱导室中。当胚胎活动停止时，表明已达到足够的麻醉深度。 
	注意：使用较大剂量异氟烷（100 μL）可用于处死胚胎。</li>
	<li>将鸡蛋放入生物发光成像仪中，根据制造商说明设置合适的成像参数进行成像。本研究中采用1分钟的曝光时间。</li>
	<li>为对剩余的CAM和胚胎进行成像，需将鸡蛋打开并置于10厘米组织培养皿中。
	<ol>
		<li>用双手手指托住鸡蛋底部近中部位置，双侧拇指置于蛋壳开口两侧。</li>
		<li>用拇指轻轻将蛋壳两半分开，同时用手指轻压鸡蛋内部。</li>
		<li>当蛋壳与CAM及胚胎分离约一半时，将鸡蛋翻转，倒扣于10厘米组织培养皿上方。</li>
		<li>继续分离蛋壳两半。若CAM粘附于蛋壳内壁，可用手指轻轻将其推离。</li>
		<li>如有需要，可将胚胎翻入另一个培养皿中。</li>
		<li>如有必要，可按照步骤7.4的方法追加异氟烷。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 肿瘤收获
注意：可根据实验需求和肿瘤生长速度在任何合适的时间点收获肿瘤。然而，卵通常在受精后21天孵化。因此，发育第18天是一个合适的实验终点，以避免不必要的孵化。
<ol>
	<li>用镊子夹住肿瘤。使用剪刀（弹簧虹膜剪效果较好）或手术刀，小心地将肿瘤从绒毛尿囊膜（CAM）上切除。</li>
	<li>如果肿瘤已转导萤火虫荧光素酶基因，可重新成像以确认难以观察的肿瘤是否被成功切除。 
	注意：切除的肿瘤可根据特定实验需求采用任何适当方法进行分析。肿瘤也可重新移植到CAM或小鼠体内。为确认肿瘤身份，可将肿瘤组织固定、石蜡包埋，并进行苏木精-伊红染色或免疫组织化学染色检查。</li>
</ol>

<ol><li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li>
<li>Jackson, S. J., Thomas, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue+models+in+cancer+research%3A+looking+beyond+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Human tissue models in cancer research: looking beyond the mouse.</a> Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 939-942 (2017).</li>
<li>Cheon, D. J., Orsulic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Models+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%3A+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Mouse Models of Cancer.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6 (1), 95-119 (2011).</li>
<li>Howlader, N., et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2016. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. https://seer.cancer.gov/csr/1975_2016/ (2018).</li>
<li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+chorioallantoic+membrane+angiogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model.</a> Methods Molecular Biology. 843, 47-57 (2012).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology%2C+medicine+and+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li>
<li>Lokman, N. A., Elder, A. S., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+assay+as+an+in+vivo+model+to+study+the+effect+of+newly+identified+molecules+on+ovarian+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis.</a> International Journal of Molecular Science. 13 (8), 9959-9970 (2012).</li>
<li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+Chorioallantoic+Membrane+Assay%3A+A+3D+Animal+Model+for+Study+of+Human+Nasopharyngeal+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chick Chorioallantoic Membrane Assay: A 3D Animal Model for Study of Human Nasopharyngeal Carcinoma.</a> PLoS ONE. 10 (6), e0130935(2015).</li>
<li>Deryugina, E. I., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+model+systems+to+study+and+visualize+human+tumor+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1119-1130 (2008).</li>
<li>Shoin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+Embryo+Assay+as+Chemosensitivity+Test+for+Malignant+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chick Embryo Assay as Chemosensitivity Test for Malignant Glioma.</a> Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).</li>
<li>Kavaliauskaitė, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Sodium+Valproate+on+the+Glioblastoma+U87+Cell+Line+Tumor+Development+on+the+Chicken+Embryo+Chorioallantoic+Membrane+and+on+EZH2+and+p53+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">The Effect of Sodium Valproate on the Glioblastoma U87 Cell Line Tumor Development on the Chicken Embryo Chorioallantoic Membrane and on EZH2 and p53 Expression.</a> BioMed Research International. 2017, 12(2017).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Histone+Methyltransferase+EZH2+Mediates+Tumor+Progression+on+the+Chick+Chorioallantoic+Membrane+Assay%2C+a+Novel+Model+of+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma.</a> Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).</li>
<li>Rudy, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Wnt+pathway+inhibition+of+human+squamous+cell+carcinoma+growth+and+metastasis+in+the+chick+chorioallantoic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Otolaryngology+-+Head+%26+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">In vivo Wnt pathway inhibition of human squamous cell carcinoma growth and metastasis in the chick chorioallantoic model.</a> Journal of Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 45 (1), 26(2016).</li>
<li>Canale, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-27+inhibits+pediatric+B-acute+lymphoblastic+leukemia+cell+spreading+in+a+preclinical+model%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Interleukin-27 inhibits pediatric B-acute lymphoblastic leukemia cell spreading in a preclinical model.</a> Leukemia. 25, 1815(2011).</li>
<li>Loos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino-functionalized+nanoparticles+as+inhibitors+of+mTOR+and+inducers+of+cell+cycle+arrest+in+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amino-functionalized nanoparticles as inhibitors of mTOR and inducers of cell cycle arrest in leukemia cells.</a> Biomaterials. 35 (6), 1944-1953 (2014).</li>
<li>Rovithi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+bioluminescent+chick+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+models+for+primary+pancreatic+cancer+cells%3A+a+platform+for+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of bioluminescent chick chorioallantoic membrane (CAM) models for primary pancreatic cancer cells: a platform for drug testing.</a> Scientific Reports. 7, 44686(2017).</li>
<li>Majerník, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Insights+into+the+Effect+of+Hyperforin+and+Photodynamic+Therapy+with+Hypericin+on+Chosen+Angiogenic+Factors+in+Colorectal+Micro-Tumors+Created+on+Chorioallantoic+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Novel Insights into the Effect of Hyperforin and Photodynamic Therapy with Hypericin on Chosen Angiogenic Factors in Colorectal Micro-Tumors Created on Chorioallantoic Membrane.</a> International Journal of Molecular Science. 20 (12), 3004(2019).</li>
<li>Swadi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimising+the+chick+chorioallantoic+membrane+xenograft+model+of+neuroblastoma+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optimising the chick chorioallantoic membrane xenograft model of neuroblastoma for drug delivery.</a> BMC Cancer. 18 (1), 28(2018).</li>
<li>Klingenberg, M., Becker, J., Eberth, S., Kube, D., Wilting, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+chorioallantoic+membrane+as+an+in+vivo+xenograft+model+for+Burkitt+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The chick chorioallantoic membrane as an in vivo xenograft model for Burkitt lymphoma.</a> BMC Cancer. 14 (1), 339(2014).</li>
<li>Avram, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+A375+human+melanoma+models+on+chicken+embryo+chorioallantoic+membrane+and+Balb%2Fc+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Standardization of A375 human melanoma models on chicken embryo chorioallantoic membrane and Balb/c nude mice.</a> Oncology Reports. 38 (1), 89-99 (2017).</li>
<li>Zabielska-Koczywas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+chick+embryo+chorioallantoic+membrane+model+as+an+in+vivo+model+to+study+morphological+and+histopathological+features+of+feline+fibrosarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">3D chick embryo chorioallantoic membrane model as an in vivo model to study morphological and histopathological features of feline fibrosarcomas.</a> BMC Veterinary Research. 13 (1), 201(2017).</li>
<li>Skowron, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+the+chicken+embryo+chorioallantoic+membrane+assay+to+study+treatment+approaches+in+urothelial+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Urologic+Oncology%3A+Seminars+and+Original+Investigations%22%5BJournal%5D)">Applying the chicken embryo chorioallantoic membrane assay to study treatment approaches in urothelial carcinoma.</a> Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 35 (9), e511-e523 (2017).</li>
<li>Jefferies, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+imaging+of+engineered+human+tumors+in+the+living+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Non-invasive imaging of engineered human tumors in the living chicken embryo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4991(2017).</li>
<li>Taizi, M., Deutsch, V. R., Leitner, A., Ohana, A., Goldstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+rapid+in+vivo+system+for+testing+therapeutics+on+human+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">A novel and rapid in vivo system for testing therapeutics on human leukemias.</a> Experimental Hematology. 34 (12), 1698-1708 (2006).</li>
<li>Strojnik, T., Kavalar, R., Barone, T. A., Plunkett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+model+and+immunohistochemical+comparison+of+U87+human+glioblastoma+cell+xenografts+on+the+chicken+chorioallantoic+membrane+and+in+rat+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Experimental model and immunohistochemical comparison of U87 human glioblastoma cell xenografts on the chicken chorioallantoic membrane and in rat brains.</a> Anticancer Research. 30 (12), 4851-4860 (2010).</li>
<li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+model+for+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology.</a> Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Non-integrating+Lentiviral+Approach+Overcomes+Cas9-Induced+Immune+Rejection+to+Establish+an+Immunocompetent+Metastatic+Renal+Cancer+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

利用 CAM 模型进行肿瘤扩展和移植，相较于现有的体内动物模型，可实现更快速且可直接观察的肿瘤生长。此外，在完成设备的初始购置后，其成本显著降低，尤其与免疫缺陷小鼠的使用成本相比更为经济。鸡胚先天的免疫缺陷状态使其能够 readily接受人源和鼠源组织的移植。尽管具有上述优势，CAM 模型仍存在局限性。其较短的实验周期在某些情况下是优势，但若需开展长期治疗研究时，则可能成为限制因素。CAM 模型的免疫缺陷或免疫耐受状态可能使肿瘤-免疫相互作用的研究变得复杂。对于此类研究，可能需要共移植特定的免疫细胞，甚至需对免疫组分进行补充。此外，尽管我们所展示的所有肿瘤类型均可在 CAM 模型中成功移植，但其生长程度各不相同。例如，肾细胞癌可迅速形成较大的肿瘤，而卵巢癌肿瘤若无生物发光成像技术的辅助则难以观察。因此，需针对特定肿瘤类型评估其生长情况和生长速度，以确定 CAM 模型是否适合作为实验模型。
成功的肿瘤移植需要仔细完成方案中的特定步骤。首先，鸡蛋必须在理想的条件下孵育，以确保胚胎在移植前具有最佳的存活率和绒毛尿囊膜（CAM）的正常形成。由于不同批次之间存在天然差异，我们建议从特定的鸡蛋...

小鼠作为研究人类疾病（包括恶性肿瘤）的经典模式生物，因其哺乳动物特性而与人类具有诸多相似之处。小鼠与人类基因组高度相似，使得通过转基因技术对小鼠基因组进行操控成为可能，从而极大地增进了人们对人类疾病遗传调控机制的理解1。由于在小鼠饲养和实验操作方面积累了丰富的经验，小鼠已成为生物医学研究的首选模型。然而，除了涉及小鼠模型的伦理和科学问题外，其使用往往成本高昂且耗时较长2,3。肿瘤的形成可能需要数周甚至数月时间，仅在典型机构中维持实验动物饲养的费用就可能高达数百至数千美元。卵巢癌便是这一缺陷的典型例子，因其在小鼠模型中的生长过程通常需要数月。研究进展的延迟可能直接影响卵巢癌患者的预后，该病患者的5年生存率长期处于仅47%的低水平（即过去30年中生存率仅提高了10%）4。同样，泌尿系统癌症（包括肾癌、前列腺癌和膀胱癌）在美国占所有癌症病例的19%，占癌症相关死亡的11%4。因此，若能开发一种新颖的体内研究方法用于妇科和泌尿系统癌症的研究，即使仅用于初步筛选实验，也可能为实验室节省大量时间、人力和经费。此外，研究进程的加速有望显著影响每年约17.7万名被诊断患有此类癌症的患者。
鸡胚尿囊膜（CAM）模型具有多种优势，可解决上述问题。该模型被广泛用于研究血管生成5,6、肿瘤细胞侵袭7,8和转移7,9，已被应用于研究多种癌症，包括胶质瘤10,11,12、头颈部鳞状细胞癌13,14、白血病15,16、胰腺癌17和结直肠癌18。此外，已有研究建立了神经母细胞瘤19、伯基特淋巴瘤20、黑色素瘤21和猫科动物纤维肉瘤22的CAM模型。先前的研究还报道了膀胱癌23和前列腺癌细胞系24的移植，但相关实验方案细节有限。鸡蛋不仅比小鼠便宜得多，而且实验结果具有高度可重复性25,26。鸡胚血管系统发育迅速，肿瘤移植可在数天内完成，并可通过打开的窗口进行纵向观察。从受精到孵化的21天时间窗口，使得实验可在数周内完成。此外，由于成本低、饲养需求少、体积小，非常适合开展大规模实验，而这类实验若使用小鼠则难以实现。
因此，我们致力于优化鸡胚尿囊膜模型，以促进妇科和泌尿系统肿瘤的移植。由于早期鸡胚具有免疫缺陷特性27，小鼠和人类细胞均可被顺利植入。基于此，我们已成功移植了卵巢、肾、前列腺和膀胱肿瘤。对于上述每种肿瘤类型，鸡胚尿囊膜均可有效接受已建立的小鼠和/或人类肿瘤细胞系。重要的是，新鲜获取的原代人类肿瘤组织，无论是经消化处理的细胞还是固体组织碎片，均可实现高成功率的移植。上述各类肿瘤及细胞来源均需进行优化，本文中我们将分享相关优化方案。

<table><tbody><tr><td>-010 聚四氟乙烯（PTFE）白色 55 邵氏 D 硬度 O 型圈</td><td>The O-Ring Store</td><td>TEF010</td><td>用于细胞接种的不粘环。1/4&quot;ID × 3/8&quot;OD × 1/16&quot;CS 聚四氟乙烯（PTFE）。</td></tr><tr><td>C4-2</td><td>ATCC</td><td>CRL-3314</td><td>人前列腺癌细胞系。</td></tr><tr><td>CWR22Rv1</td><td></td><td></td><td>CWR 细胞系由南加州大学凯克医学中心 David Agus 博士惠赠。</td></tr><tr><td>细胞角蛋白 8/18 抗体（C-51）</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-44929-0.02mg</td><td>用于人卵巢 CAM 肿瘤免疫组织化学分析，稀释比例为 1:100。</td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐（来自萤火虫）</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>精细手术剪；弯型；尖-尖；30 mm 刀刃长度；总长 4-3/4 英寸</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS6703</td><td>此为示例。任何类似的弯剪均可使用。</td></tr><tr><td>Dremel 8050-N/18 微型 8V Max 工具套装</td><td>Dremel</td><td>8050-N/18</td><td>该套装包含所有必需工具。</td></tr><tr><td>受精鸡卵（罗得岛红羽 - 棕色，实验级）</td><td>AA Lab Eggs Inc.</td><td>N/A</td><td>需自行寻找本地蛋品供应商，因该供应商仅限区域配送。</td></tr><tr><td>HT-1376</td><td>ATCC</td><td>CRL-1472</td><td>人膀胱癌细胞系。</td></tr><tr><td>Hovabator Genesis 1588 豪华型孵蛋器组合套装</td><td>Incubator Warehouse</td><td>HB1588D-NONE-1102-1588-1357</td><td>可使用其他孵蛋器，但需验证其可靠性。植入后也可使用关闭 CO2 功能的细胞培养箱。</td></tr><tr><td>ID8</td><td></td><td></td><td>非商业化产品，请参见 PMID: 10753190。</td></tr><tr><td>Incu-Bright 冷光源照蛋灯</td><td>Incubator Warehouse</td><td>1102</td><td>可使用其他照蛋灯，但经测试本产品为首选。该照蛋灯包含于上述孵蛋器套装中。</td></tr><tr><td>虹膜镊，10 cm，弯型，带齿，0.8 mm 尖端</td><td>World Precision Instrument</td><td>15915</td><td>此为示例。任何类似的弯型镊子均可使用。本方法已使用多个品牌产品。</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Clipper Distributing</td><td>0010250</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II 活体成像系统</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基底膜基质 HC；无病原体（LDEV-Free）</td><td>Corning</td><td>354248</td><td>细胞外基质溶液</td></tr><tr><td>MyC-CaP</td><td>ATCC</td><td>CRL-3255</td><td>小鼠前列腺癌细胞系。</td></tr><tr><td>便携式 Pipet-Aid XP 移液控制器</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td>任何类似的移液控制器均可适用。</td></tr><tr><td>PrecisionGlide 皮下注射针头</td><td>BD</td><td>305196</td><td>此为示例。任何 18G 针头均可达到类似效果。</td></tr><tr><td>RENCA</td><td>ATCC</td><td>CRL-2947</td><td></td></tr><tr><td>Semken 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td>此为示例。任何类似镊子或符合研究人员偏好的其他类型均可适用。</td></tr><tr><td>SKOV3</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>人卵巢癌细胞系。</td></tr><tr><td>标本镊</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72914</td><td>此为示例。用于移除蛋壳以进行生物发光成像的镊子长度约为 12.8 cm，尖端宽度为 3 mm。</td></tr><tr><td>无菌棉球</td><td>Fisherbrand</td><td>22-456-885</td><td>此为示例。任何无菌棉球均可满足要求。</td></tr><tr><td>带橡胶刮头的搅拌棒；直径 5 mm，长度 6 英寸</td><td>United Scientific Supplies</td><td>GRPL06</td><td>此为示例。任何类似的玻璃搅拌棒均可使用。</td></tr><tr><td>T24</td><td>ATCC</td><td>HTB-4</td><td>人膀胱癌细胞系。</td></tr><tr><td>Tegaderm 透明敷料原框式 2 3/8&quot; × 2 3/4&quot;</td><td>Moore Medical</td><td>21272</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿，直径 10 cm</td><td>Corning</td><td>353803</td><td>此为示例。任何类似的无菌 10 cm 培养皿均可使用。无需组织培养处理。</td></tr><tr><td>Tygon 透明实验室管路 - 1/4 × 3/8 × 1/16 管壁（50 英尺）</td><td>Tygon</td><td>AACUN017</td><td>此为示例。任何尺寸相似的管路均可使用。</td></tr></tbody></table>

利用鸡绒毛尿囊膜体内模型研究妇科和泌尿系统癌症

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

小鼠模型是体内癌症研究的基准实验方法。然而，由于成本、时间和伦理方面的考虑，人们呼吁采用替代性的体内癌症模型。鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）模型提供了一种经济、快速的替代方案，可直接观察肿瘤发育过程，并适用于活体成像。因此，我们致力于建立一种将妇科和泌尿系统肿瘤移植到该模型中的优化方案，本文即对此进行介绍。受精约7天后，将气室转移至蛋的血管化一侧，并在蛋壳上开一个开口，随后可将来自小鼠和人类细胞系以及原代组织的肿瘤移植其中。这些肿瘤通常被接种于细胞外基质与培养基的混合物中，以防止细胞扩散，并在细胞募集到血管供应之前提供营养支持。在孵化前，肿瘤可在膜上继续生长长达14天。通过植入稳定转导了萤火虫荧光素酶的细胞，可利用生物发光成像技术灵敏地检测膜上的肿瘤生长及癌细胞在胚胎内的扩散情况。该模型有望用于研究肿瘤发生、侵袭、转移以及治疗效果。与传统的小鼠模型相比，鸡胚CAM模型所需的时间和经济资源显著减少。由于鸡蛋处于免疫缺陷和免疫耐受状态，理论上可移植来自任何生物体的组织，而无需为移植人类组织而使用昂贵的转基因动物（如小鼠）。然而，该模型的许多优势也可能成为其局限性，例如肿瘤生长时间较短以及免疫缺陷/免疫耐受状态。此外，尽管本文所展示的所有肿瘤类型均可在鸡胚尿囊绒毛膜模型中成功移植，但其肿瘤生长程度存在差异。

迄今为止，我们发现该植入方法在卵巢癌、肾癌、前列腺癌和膀胱癌中均取得了成功。每种癌症类型均经过优化以确定其特定的植入条件，尽管可能存在一定灵活性。在所测试的肿瘤类型中，卵巢癌的生长程度明显较弱，通常在缺乏生物发光成像辅助的情况下不可见。图1）。然而，使用镊子可在植入区域感受到CAM的硬化，这可能有助于在缺乏生物发光成像的情况下识别潜在的肿瘤生长，但还需通过组织学或其他合适方法进一步验证。我们成功移植了人源和鼠源细胞系，其形态学特征与其他体内模型中观察到的结果一致图1A 和 1B）。此外，还可进行肿瘤组织块的移植（图1C，蓝色箭头指示肿瘤）。本例中移植的肿瘤来自一名高级别、转移性卵巢浆液性癌患者。所形成的肿瘤在形态学上与其来源肿瘤相似，并表达人类特异性蛋白（如细胞角蛋白8/18），可易于将其与CA...

我们提出鸡胚尿囊绒毛膜模型作为一种可移植的体内替代模型，用于移植妇科和泌尿系统癌细胞系及患者来源的肿瘤。

小鼠模型是体内癌症研究的基准测试方法。然而，成本、时间和伦理方面的考虑促使人们呼吁采用替代的体内……

将肿瘤移植到鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）上，可用于研究肿瘤发生能力、治疗效果或细胞间相互作用。该方法可在免疫耐受的活体环境中实现快速且成本较低的肿瘤生长。利用CAM模型，可使用细胞系甚至患者肿瘤样本快速测试新的治疗策略。本方案最关键的步骤是确保鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）正常形成，并在打开鸡蛋时避免破坏CAM或其血管系统。在发育第7天或第8天，当CAM已完全发育时，关闭蛋旋转器，并将约1至3枚鸡蛋放入生物安全柜内的蛋架中。关闭灯光后，将照蛋仪紧贴蛋壳，以识别并标记其中一枚鸡蛋的气室位置，然后移动照蛋仪观察蛋壳，寻找具有丰富血管网络的区域，必要时旋转鸡蛋以调整角度。理想的血管系统应位于蛋的中部附近并在此处分支。使用记号笔描出将用于植入的血管系统。在重新打开超净台的光源后，使用装有碳化硅磨头的无线旋转工具，在气室正上方的蛋壳处钻一个小孔。当大部分蛋壳已被去除，但白色内膜仍保持完整时，在即将打开血管窗的位置再钻一个小孔，操作方法如前所述。当第二个孔准备就绪后，使用18号针头轻轻刺破气室和血管区域上方的白色内膜，注意在整个钻孔区域内仅破坏白色内膜，而不要损伤绒毛尿囊膜（CAM）。再次关闭通风橱灯光，使用检卵灯确认气室已从蛋的末端转移至血管区域上方。如有必要，将连接至移液控制器的真空管插入气室上方的孔中，并短时轻柔施加吸力，以移动气室。在 CAM 气室边界的内侧约 0.5 厘米处标记气室新位置的轮廓，并用一块刚好能覆盖新气室上方孔洞的封箱胶带将其封住。按照上述方法准备好另外两个鸡蛋后，将鸡蛋放回培养箱，并按上述方式每次打开一至三个额外的鸡蛋进行实验。 当所有鸡蛋均打开后，将一至三个气室已移位的鸡蛋转移至生物安全柜中的蛋架上，使用装有圆形切割轮的无线旋转工具，在气室边界上方完全切开一条小切口，穿透气室但不破坏绒毛尿囊膜（CAM）或血管系统。用弯头剪刀沿剩余的气室边缘剪开，形成蛋壳窗口，并检查胚胎的存活状态。存活的胚胎会表现出丰富的血管网络、透明的蛋白、胚胎活动和/或可见的心跳。在无活性的胚胎中，尿囊绒毛膜可能呈现不透明状，血管稀少甚至完全缺失，胚胎可能体积微小或缺如，且无运动或心跳。使用Semkin镊子从无菌棉球上取下小块棉絮，轻轻擦拭有活性胚胎的尿囊绒毛膜表面，以去除壳灰和碎屑，然后用一块大小为六厘米乘七厘米透明敷料的四分之一覆盖蛋壳开口，注意不要触碰尿囊绒毛膜，并将蛋放回孵育箱，使开口朝上。对于容易滚动的蛋，可使用蛋架的一部分、蛋旋转器的边缘或其他合适物品将其固定。为制备用于移植的癌细胞悬液，从目标癌细胞培养物中收集细胞，并通过离心沉淀细胞。吸除上清液后，用残留的培养基通过机械方式重悬细胞。将细胞悬液置于冰上，并使用移液器测量细胞在培养基中的体积。然后将细胞重悬于20至100微升培养基中，细胞浓度为每毫升100万至200万个细胞，培养基中需添加2.7至4毫克/毫升的细胞外基质以及任何感兴趣的生长因子或其他添加剂。对于癌细胞移植，使用无粘性环将最多六个待移植的鸡蛋放置于蛋架上，并将透明薄膜敷料的边缘向开口处卷起，以去除蛋壳表面的薄膜。检查鸡蛋是否具有活性且健康状态良好。理想的卵应具有一个主血管，并在打开区域的中央伴有较小的分支血管。使用弯头虹膜镊，将无菌防粘环放置在主血管上方的绒毛尿囊膜（CAM）上，最好覆盖在分支点处。用无菌玻璃搅拌棒轻轻擦伤绒毛尿囊膜，并将癌细胞悬液滴加至环的中央。当所有细胞接种完毕后，用一块大小为六乘七厘米透明敷料的四分之一封住开口，并在蛋壳上贴上适当的移植标记。然后将鸡蛋稳妥地放入培养箱中，使蛋壳的开口朝上。若不使用防粘连环接种癌细胞，可将细胞悬液吸入适当大小的移液器吸头中，小心握住吸头顶部，将吸头内的液体缓缓排出，并将吸头水平放置于无菌的10厘米组织培养皿中。尖端加样完成后，将培养皿放入37摄氏度的培养箱中孵育15至30分钟，并在15分钟后检查是否发生聚合。每个尖端放入培养皿时通常会有少量液体渗出。利用该液体来估计尖端内聚合的程度。当基质准备就绪后，将一个吸头装到适当规格的移液器上，按压移液器推杆，将部分聚合的细胞悬液推至鸡胚尿囊膜（CAM）上，理想位置应位于发育良好、分支明显的较大血管的分叉处。采用这些方法，人和小鼠的卵巢癌细胞系以及原发性肿瘤组织均成功移植并形成肿瘤，其形态学特征与其他体内模型中观察到的结果一致。在所测试的肿瘤类型中，卵巢癌的生长程度明显较弱，通常需要借助生物发光成像才能观察到。还可以利用这些方法测试在植入时添加生长因子或激素的影响。对于肾癌，植入已建立的细胞系来源的透明细胞肾细胞癌细胞或原发性人肾肿瘤组织块，均可快速且稳定地形成肿瘤。此外，已使用多种人源和鼠源前列腺癌细胞系、人源膀胱癌细胞系以及原发性肿瘤组织块，通过该模型成功建立肿瘤。在打开窗口时，必须避免破坏尿囊绒毛膜（CAM）及其血管系统，并确保CAM不与蛋壳粘连。成功移植后，CAM模型可用于评估感兴趣治疗方法的疗效，或研究肿瘤内不同细胞类型之间的相互作用。

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