使用分体路西酶测定系统识别 HBx-DDB1 相互作用的抑制剂
2019年12月21日
在这里，我们提出了一种使用裂解荧光素酶检测系统来抑制HBx-DDB1相互作用的抗乙型肝炎病毒药物的方法。该系统易于检测蛋白质-蛋白质相互作用，适用于识别此类相互作用的抑制剂。
HBX-DDB1相互作用是促进从ccDNA进行HPV转录的关键步骤，因此该协议可能成为发现HPV功能治疗新治疗剂的关键资产。我们的程序很简单，只需很短的时间进行筛选。我混合的相互作用可以实时检测，而无需细胞解解。
此外，筛选质量令人满意，Z等分高。HBX-DDB1 相互作用的抑制导致 Smc5/6 的恢复，从而抑制 HPV 转录、蛋白质表达和 ccDNA 生产。这种新型的抗病毒作用机制可以克服目前HPV疗法的不足。
蛋白质-蛋白质相互作用是药物靶点的重要类别。此处描述的基于分裂-荧光酶的酸，针对病毒和有S蛋白之间的相互作用，可能为开发其他传染病的治疗方法提供一种新的策略。尽管我们的协议简单易懂，但如果没有可视化演示，某些步骤可能很难重现。
因此，可视化演示对理解我们的协议有很大的帮助。首先将5倍10至第5个 HEK293T 细胞播种到 100 毫米的培养皿中，并孵育在 37 摄氏度下过夜。第二天，稀释每微克的HBx-LgBit和SmBit-DDB1表达DNA质粒和DNA凝结缓冲液，总体积为300微升。
加入16微升增强剂溶液，通过涡流混合管一秒钟。在室温下孵育样品三分钟，然后加入60微升转染试剂。旋转管10秒钟，再孵育样品8分钟。
同时，用细胞从培养皿中吸出介质，用五毫升PVS洗涤。吸升PVS并添加7毫升DMEM。将三毫升DMEM加入导管，用转染复合物，上下移液器混合，并将混合物加入细胞中。
然后，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育细胞10小时。孵育后，取出已花的培养培养，用五毫升PVS清洗细胞。在0.25%的尝试素EDTA的一毫升下取出PVS，并在37摄氏度下孵育细胞以分离它们。
接下来，加入四毫升DMEM，通过多次在细胞层表面移液来分散介质，并将悬浮液转移到管中。将细胞在500次G下离心5分钟，然后丢弃上最后一代，并在PVS的一毫升中重新悬浮细胞颗粒。重复四分法并丢弃上经剂。
然后，用缓冲细胞培养培养剂重新悬浮细胞颗粒，辅以10%FBS，使每毫升100万个细胞的种子密度。将50微升的细胞悬浮液放入96井板的每个井中，将细胞返回37摄氏度的培养箱10小时。当细胞孵育时，将筛选化合物和溶剂稀释至13.5 X浓度。
在每个井中加入12.5微升的发光基板，并在室温下孵育板5分钟。使用发光计测量基线亮度，并在后立即将化合物的五微升和受控的 DMSO 添加到每个井中。每30分钟测量一次发光两小时，然后计算与DMSO处理相比化合物的抑制作用。
测量了基线发光信号，计算信号与背景比大于80。Z 等数值大于 0.5，表明此检测系统可接受高通量筛选。通过将阈值设置为大于 40% 的抑制比与仅 DMSO 控制相比，硝基多糖胺被确定为候选药物。
我们之前通过用这种方法筛选反应性小规模化合物库，将硝氮氧化物确定为HBX-DDB1相互作用的抑制剂。使用硝基多糖酰胺，我们确认抑制HBX-DDB1相互作用，减少病毒转录，以及随后的病毒产品水平。必须事先确定分裂荧光素酶与目标蛋白质融合的最佳部分。
在这种情况下，HPX 在 HPX 的 C 终点与大位融合，DDB1 的末元位将 DDB1 的 DDB1 融合到小位，提供了最佳结果。
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概述
本研究提出了一种方法，通过分裂荧光酶检测系统筛选抑制HBx-DDB1相互作用的抗乙肝病毒药物。该协议允许在不进行细胞裂解的情况下实时检测蛋白-蛋白相互作用，有助于发现HPV功能治疗的新型药物。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 病毒学
- 药理学
背景
- HBX-DDB1相互作用对于HPV从cccDNA的转录至关重要。
- 现有的HPV疗法存在不足，该方法旨在解决这些问题。
- 通过抑制HBX-DDB1恢复Smc5/6可以抑制HPV转录。
- 分裂荧光酶检测系统提供了高Z prime分数以保证筛选质量。
研究目的
- 开发一种方法来识别HBX-DDB1相互作用的抑制剂。
- 促进HPV新型治疗药物的发现。
- 提高抗病毒研究中的筛选效率和质量。
所用方法
- 分裂荧光酶检测系统用于检测蛋白-蛋白相互作用。
- 在不进行细胞裂解的情况下实时监测相互作用。
- 使用Z prime分数评估筛选质量。
- 评估针对HBX-DDB1的抗病毒机制。
主要结果
- 该方法成功实时检测了HBX-DDB1相互作用。
- 抑制HBX-DDB1导致Smc5/6恢复。
- 观察到HPV转录和cccDNA产生的抑制。
- 该方法可能提供了一种新的抗病毒作用机制。
结论
- 该方法为发现新的HPV疗法提供了一个有前景的途径。
- 它通过针对HBX-DDB1解决了现有治疗方法的局限性。
- 分裂荧光酶检测是未来抗病毒研究的宝贵工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
Targeting the HBx-DDB1 interaction addresses a critical mechanistic bottleneck in hepatitis B virus (HBV) drug discovery, enabling direct intervention at the level of viral protein expression. The split luciferase assay system provides real-time, quantitative readouts for inhibitor screening, supporting predictive confidence in early-stage target validation. This platform strengthens portfolio triage by enabling high-throughput identification of compounds with novel antiviral mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of the HBx-DDB1 protein-protein interaction central to HBV pathogenesis.
- Supports biological de-risking by linking inhibition to restoration of Smc5/6 and suppression of viral transcription.
- Facilitates predictive confidence in target engagement through real-time, live-cell measurement.
Screening & Assay Development
- Delivers a validated, high Z prime assay suitable for high-throughput compound screening.
- Provides robust, quantitative luminescence outputs for reliable compound ranking.
- Enables reproducible, scalable workflows for screening libraries against protein-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms by targeting viral protein expression from cccDNA.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by linking molecular inhibition to functional outcomes.
- Reduces translational risk by focusing on a mechanistically validated antiviral target.
Pipeline & Workflow Integration
This split luciferase assay system integrates at the early discovery and lead identification stages, bridging target validation and high-throughput screening for HBV and potentially other viral targets.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing of protein-protein interaction inhibitors in live cells.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility with high signal-to-background and Z prime metrics.
- Analytics: Generates quantitative inhibition data to compare compound efficacy and selectivity.
- Translational Research: Connects molecular inhibition to restoration of host restriction factors and suppression of viral transcription.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other protein-protein interaction targets in infectious disease research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for HBV drug discovery.
- Operational Value: Standardizes and accelerates screening workflows with robust, reproducible outputs.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of novel antiviral candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds with unique mechanisms of action.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein-protein interaction assays and live-cell luminescence measurements.
- Needs access to cell culture, transfection reagents, and plate-based luminometry infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data analysis for reproducibility.
- May require optimization of fusion protein constructs for different target pairs.
- Visual protocol demonstration aids reproducibility for complex assay steps.
