Name: 使用分体路西酶测定系统识别 HBx-DDB1 相互作用的抑制剂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: 学习使用分体路西酶测定系统筛选HBx-DDB1相互作用抑制剂的方法。该技术可实时检测蛋白相互作用，无需细胞裂解，有助于发现抗HPV新型治疗药物并提高抗病毒研究筛选效率。

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本研究得到了日本文部科学省科研经费（#19H03430 和 #17K09405，授予 M.O.；#19J11829，授予 K.S.）、日本文部科学省创新领域研究经费（#18H05024，授予 M.O.）、日本医疗研究开发机构（AMED）肝炎研究项目（授予 M.O.，#JP19fk021005）、AMED 乙型肝炎新药创新开发与应用项目（#JP19fk0310102，授予 K.K.）、日本应用酶学基金会和小林癌症研究基金会的资助（授予 M.O.）、GSK 日本研究基金 2018（授予 K.S.）以及宫川纪念研究基金会基金（授予 K.S.）的支持。

注意：分裂荧光素酶检测的示意图见图1A，检测流程见图1B。该方法可在无需裂解细胞的情况下实时测量相互作用动力学。
1. 细胞准备
<ol>
	<li>在含有10% v/v胎牛血清（FBS）、1×青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、20% O2和5% CO2条件下培养HEK293T细胞。</li>
	<li>将5 × 106个细胞接种至100 mm培养皿中，加入10 mL DMEM，于37 °C孵育过夜。</li>
	<li>按照以下方法，将1 µg HBx和DDB1与分裂荧光素酶共同瞬时转染入细胞。 
	注意：转染质粒DNA的用量可能取决于所使用的转染试剂。分裂荧光素酶与目标蛋白融合的最佳位置需预先确定。本实验中，将LgBit融合至HBx的C末端（HBx-LgBit），将SmBit融合至DDB1的N末端（SmBit-DDB1）时结果最佳（即产生最强的荧光素酶信号）。该方法此前已有详细报道7。
	<ol>
		<li>将表达HBx-LgBit的DNA质粒1 µg和表达SmBit-DDB1的DNA质粒1 µg（材料表）用DNA浓缩缓冲液（材料表）稀释至终体积300 µL。</li>
		<li>加入16 µL增强剂溶液（材料表），涡旋混匀1秒。</li>
		<li>室温孵育样品3分钟。</li>
		<li>向样品中加入60 µL转染试剂（材料表），涡旋混匀10秒。</li>
		<li>室温孵育样品8分钟。</li>
		<li>孵育期间，吸除步骤1.2中准备的培养皿中的培养基，用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，吸除PBS后加入7 mL DMEM。</li>
		<li>向含有转染复合物的离心管中加入3 mL DMEM，用移液器吹打混匀，然后将转染复合物加入10 cm培养皿的细胞中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞置于含5% CO2的培养箱中，于37 °C孵育10小时。</li>
	<li>按照以下方法，将细胞以每孔5 × 104个细胞、每孔50 µL培养基的密度重新接种至白色96孔板中。
	<ol>
		<li>移除用过的细胞培养基，用5 mL PBS洗涤细胞。</li>
		<li>吸除PBS，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育5分钟以使细胞脱落。</li>
		<li>加入4 mL DMEM，反复吹打细胞层表面使细胞悬液分散均匀，将细胞悬液转移至离心管中。</li>
		<li>室温下以500 × g离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL PBS中。</li>
		<li>室温下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用补充了10% FBS的缓冲细胞培养基（材料表）将细胞沉淀稀释至接种密度为1.0 × 106个细胞/mL。</li>
		<li>每孔加入50 µL细胞悬液至96孔板中，将细胞放回培养箱继续培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞置于5% CO2环境中，于37 °C孵育10小时。</li>
</ol>
2. 化合物筛选
<ol>
	<li>孵育期间，将筛选化合物（材料表）和溶剂（二甲基亚砜 [DMSO]）稀释至13.5倍浓度。例如，若母液浓度为10 mM，筛选浓度为10 µM，则将1 µL母液加入73.1 µL缓冲细胞培养基中。</li>
	<li>向每孔加入12.5 µL发光底物（材料表），室温孵育5分钟。 
	注意：作为阴性对照，板的两端孔（即第1列和第12列）不应加入发光底物。</li>
	<li>使用发光仪（材料表）测定基础发光值。</li>
	<li>在初始测定后立即向每孔加入5 µL步骤2.1中稀释好的化合物及对照DMSO。 
	注意：最终浓度为10 µM。</li>
	<li>每30分钟测定一次发光值，持续2小时。 
	注意：该板应在室温避光条件下孵育。</li>
	<li>将信号归一化至基础值后，与对照DMSO处理组比较，计算抑制效应。 
	注意：每个化合物进行双复孔或三复孔筛选可减少变异。</li>
</ol>

<ol><li>Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hepatitis+B+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Chronic hepatitis B infection: a review.</a> The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).</li>
<li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+pathogenesis%3A+Fresh+insights+into+hepatitis+B+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA.</a> World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).</li>
<li>Slagle, B. L., Bouchard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+X+and+regulation+of+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402(2016).</li>
<li>Murphy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+Virus+X+Protein+Promotes+Degradation+of+SMC5%2F6+to+Enhance+HBV+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication.</a> Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).</li>
<li>Decorsière, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+X+protein+identifies+the+Smc5%2F6+complex+as+a+host+restriction+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor.</a> Nature. 531, 386-389 (2016).</li>
<li>Niu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smc5%2F6+complex+restricts+HBV+when+localized+to+ND10+without+inducing+an+innate+immune+response+and+is+counteracted+by+the+HBV+X+protein+shortly+after+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection.</a> PLoS One. 12, e0169648(2017).</li>
<li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HBV+Transcription+From+cccDNA+With+Nitazoxanide+by+Targeting+the+HBx-DDB1+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).</li>
<li>Eggers, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection%3A+Methods+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Proteomics.+2014%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection: Methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648(2014).</li>
<li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robotic+Platform+for+Quantitative+High-Throughput+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).</li>
<li>Skwarczynska, M., Ottmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions as drug targets.</a> Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).</li>
<li>de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-host+interactomics%3A+New+insights+and+opportunities+for+antiviral+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery.</a> Genome Medicine. 6, 115(2014).</li>
<li>Prasad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-Host+Interactions%3A+New+Insights+and+Advances+in+Drug+Development+Against+Viral+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens.</a> Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们开发了一种利用分裂荧光素酶检测技术筛选HBx-DDB1结合抑制剂的便捷方法。该方法可在活细胞中实时检测相互作用动态，无需裂解细胞。抑制HBx-DDB1相互作用可恢复Smc5/6的功能，从而抑制病毒转录、蛋白表达以及cccDNA的产生7。这种新型抗病毒作用机制有望克服现有乙型肝炎病毒（HBV）疗法的不足。
尽管已有多种方法可用于研究活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用，但检测这些相互作用仍然具有挑战性10。我们的实验流程简单，筛选一块96孔板仅需较短时间。此外，筛选质量令人满意，具有较高的Z'分数，这是高通量筛选的金标准质量指标9。我们的检测方法可能适用于机器人自动化11，是药物发现的一种高效检测手段。
尽管本实验方案中采用HEK293T细胞系是因其具有较高的转染效率和增殖能力，适用于高通量筛选，但该筛选方法无需修改即可应用于其他细胞系（例...

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球主要的公共卫生问题，据估计每年有2.4亿人患有慢性HBV感染，约9万人死于由该感染引起的并发症，包括肝硬化和肝细胞癌（HCC）1。尽管目前的抗HBV治疗药物——核苷（酸）类似物——能够有效抑制病毒的逆转录过程，但极少能实现病毒蛋白的清除，而后者正是长期临床治疗的目标。这类药物在病毒蛋白清除方面效果不佳，原因在于其对肝细胞核内病毒游离型共价闭合环状DNA（cccDNA）微染色体的病毒转录过程无直接作用2。
乙型肝炎病毒（HBV）的转录由HBV调节蛋白X（HBx）激活3。近期研究表明，HBx通过劫持DDB1-CUL4-ROC1 E3泛素连接酶复合物，降解染色体结构维持蛋白5/6（Smc5/6）——一种可阻断从共价闭合环状DNA（cccDNA）进行HBV转录的宿主限制因子4,5,6。因此，促进cccDNA上病毒转录的关键步骤被认为是HBx与DDB1之间的相互作用。能够抑制HBx与DDB1结合的化合物可能阻断病毒转录，事实上，通过本实验室建立的筛选系统已鉴定出硝唑尼特（nitazoxanide）为HBx-DDB1相互作用的抑制剂7。
本文介绍了我们用于筛选HBx-DDB1相互作用抑制剂的便捷筛选系统，该系统采用分裂荧光素酶互补检测法7,8。分裂的荧光素酶亚基分别与HBx和DDB1融合表达，当HBx与DDB1发生相互作用时，可使两个亚基靠近并形成具有功能的酶，从而产生强烈的发光信号。由于亚基之间的结合是可逆的，该系统能够检测快速解离的HBx-DDB1蛋白复合物（图1）。利用该系统可方便地对大规模化合物库进行筛选，有望发现能够高效抑制HBx-DDB1相互作用的新型化合物。

<table><tbody><tr><td>细胞培养微孔板，96孔，聚苯乙烯，平底</td><td>Greiner-Bio-One GmbH</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3176</td><td></td></tr><tr><td>Effectene 转染试剂</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td>包含DNA浓缩缓冲液、增强溶液和转染试剂</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Nichirei</td><td>175012</td><td></td></tr><tr><td>GloMax 96 微孔板发光检测仪</td><td>Promega</td><td>E6521</td><td></td></tr><tr><td>HBx&amp;ndash;LgBit 表达质粒DNA</td><td>本实验室</td><td></td><td>可根据要求提供</td></tr><tr><td>HEK293T细胞</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT 蛋白相互作用起始系统</td><td>Promega</td><td>N2015</td><td>包含Nano-Glo活细胞试剂</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td>在文稿中描述为&quot;缓冲细胞培养基&quot;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Takara</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Screen-Well FDA批准药物库 V2 版本 1.0</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-2841</td><td>本研究中使用的化合物如下：对苯二酚单甲醚、巯嘌呤水合物、美司钠、戊诺醇、甲硫醇喘宁半硫酸盐、间羟胺酒石酸盐、美他沙酮、甲酰胆碱氯化物、甲乙唑胺、马尿酸甲氧胺、甲氯芬那酸、甲氨蝶呤、补骨脂素、甲溴东莨菪碱、甲琥乙酰脲、氢氯噻嗪、氨基酮戊酸甲酯盐酸盐&amp;middot;HCl、马来酸甲麦角新碱、美托拉宗、美替拉酮、盐酸美西律&amp;middot;HCl、米卡芬净、咪康唑、盐酸米多君&amp;middot;HCl、米格列醇、盐酸米那普仑&amp;middot;HCl、米氮平、米托坦、盐酸莫昔普利&amp;middot;HCl、糠酸莫米松、莫匹罗星、纳多洛尔、萘夫西林钠&amp;middot;Na、盐酸萘替芬&amp;middot;HCl、盐酸那拉曲坦&amp;middot;HCl、制霉菌素、盐酸奈必洛尔&amp;middot;HCl、奈拉滨、 Nepafenac、奈韦拉平、烟酸、尼古丁、尼洛替尼、尼鲁米特、硝唑尼特、尼替西农、呋喃妥因、尼扎替丁、盐酸去甲替林&amp;middot;HCl、柳氮磺吡啶钠&amp;middot;Na、奥利司他、氧苯唑嗪、三羟甲基氨基甲烷、氯化奥昔布宁、盐酸土霉素&amp;middot;HCl、帕利哌酮、盐酸帕洛诺司琼&amp;middot;HCl、硫酸巴龙霉素、盐酸帕唑帕尼&amp;middot;HCl、培美曲塞二钠、培米罗司特钾、青霉胺、青霉素G钾、喷他脒异烟酸盐、喷司他丁、培哚普利叔丁胺、氯菊酯、奋乃静、苯乙肼硫酸盐、去氧肾上腺素、植物甲萘醌、匹美克莫司、匹伐他汀钙，以及鬼臼毒素</td></tr><tr><td>SmBit&amp;ndash;DDB1 表达质粒DNA</td><td>本实验室</td><td></td><td>可根据要求提供</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

利用分裂荧光素酶检测系统筛选hbx-ddb1相互作用抑制剂

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

乙型肝炎病毒（HBV）感染迫切需要新的治疗药物。尽管目前可用的核苷（酸）类似物能有效抑制病毒复制，但它们对由病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）转录的病毒蛋白表达并无直接作用。由于高病毒抗原负荷可能在慢性感染及HBV相关致癌过程中发挥重要作用，因此HBV治疗的目标是清除病毒蛋白。HBV调控蛋白X（HBx）通过与宿主DNA损伤结合蛋白1（DDB1）相互作用，导致染色体结构维持蛋白5/6（Smc5/6）降解，从而激活来自cccDNA的病毒转录。本文中，我们利用分裂荧光素酶互补检测系统，建立了一套全面的化合物筛选体系，用于鉴定HBx-DDB1相互作用的抑制剂。本方案可在活细胞内实时、便捷地检测该相互作用的动力学变化。该技术有望成为发现新型HBV感染治疗药物的关键检测方法。

采用本实验方案后的代表性结果如图2A,B所示。信噪比大于80，Z'因子9（高通量筛选的黄金标准质量指标）大于0.5，表明该检测系统适用于高通量筛选。以相较于对照组（仅含DMSO）抑制率>40%为阈值，我们筛选出硝唑尼特作为候选药物7。利用该系统，通过筛选其他更大规模的化合物文库，可发现更优的候选药物。
<img alt="使用荧光素酶活性测量发光信号的HBx-DDB1相互作用检测示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60652/60652fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：HBx-DDB1相互作用的分裂荧...

本文介绍了一种利用分裂荧光素酶检测系统筛选抑制HBx-DDB1相互作用的抗乙型肝炎病毒药物的方法。该系统可简便地检测蛋白质-蛋白质相互作用，适用于此类相互作用抑制剂的鉴定。

利用分裂荧光素酶检测系统筛选HBx-DDB1相互作用抑制剂

迫切需要开发针对乙型肝炎病毒（HBV）感染的新型治疗药物。尽管目前可用的核苷（酸）类似物具有强效的抗病毒作用……

HBX-DDB1 相互作用是促进从 cccDNA 进行 HPV 转录的关键步骤，因此本方案可能成为发现 HPV 功能性治愈新型治疗药物的重要工具。我们的操作流程简单，仅需较短时间即可完成筛选。我混合的相互作用可实时检测，无需进行细胞裂解。此外，筛选质量令人满意，Z' 因子得分较高。抑制 HBX-DDB1 相互作用可恢复 Smc5/6 的功能，从而抑制 HPV 的转录、蛋白表达以及 cccDNA 的产生。这种新型的抗病毒作用机制有望克服现有 HPV 疗法的不足之处。蛋白质-蛋白质相互作用是一类重要的药物靶点。本文所述基于分裂荧光素酶的检测方法，旨在靶向病毒与人源 heparan sulfate（hasS）蛋白之间的相互作用，可能为其他传染病的治疗提供新的策略。尽管本实验方案简单易懂，但若无直观的视觉演示，某些步骤可能较难重复。因此，可视化演示将有助于理解本实验方案。首先，将5 × 10⁵个HEK293T细胞接种至含10毫升DMEM的100毫米培养皿中，于37°C孵育过夜。次日，分别取1微克表达HBx-LgBit和SmBit-DDB1的DNA质粒以及DNA浓缩缓冲液，加至总体积为300微升。加入16微升增强剂溶液，通过涡旋振荡1秒混匀各管。室温孵育样品3分钟，然后加入60微升转染试剂。涡旋振荡管子10秒，再将样品孵育8分钟。同时，吸去培养皿中的细胞培养基，加入 5 mL 磷酸盐缓冲液（PVS）洗涤细胞。吸去 PVS，加入 7 mL DMEM 培养基。向含有转染复合物的离心管中加入 3 mL DMEM 培养基，用移液器吹打混匀，然后将混合液加入细胞中。然后，将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育10小时。孵育结束后，弃去用过的培养基，并用5毫升PBS洗涤细胞。弃去PBS，加入1毫升0.25%胰蛋白酶EDTA，于37摄氏度孵育细胞以使其脱落。接下来，加入 4 mL DMEM，通过移液枪在细胞层表面反复吹打数次以分散培养基，然后将悬液转移至离心管中。以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，再用 1 mL PVS 重悬细胞沉淀。重复离心并弃去上清液。然后，用添加了10%胎牛血清（FBS）的缓冲细胞培养基重悬细胞沉淀，调整接种密度至每毫升一百万个细胞。将50微升细胞悬液加入96孔板的每个孔中，并将细胞放回37°C培养箱中孵育10小时。在细胞孵育的同时，将筛选化合物及其溶剂稀释至13.5倍浓度。向每个孔中加入 12.5 µL 发光底物，在室温下孵育 5 分钟。使用化学发光仪测定基础发光值，随后立即向每个孔中加入 5 µL 化合物和对照 DMSO。每 30 分钟测定一次发光值，持续 2 小时，然后与 DMSO 处理组比较，计算化合物的抑制效应。测定基础发光信号，计算得到信噪比大于80。Z'因子大于0.5，表明该检测系统适用于高通量筛选。通过设定相对于仅含DMSO对照组的抑制率阈值为大于40%，筛选出硝唑尼特作为候选药物。我们此前通过使用该方法筛选一个反应性小规模化合物文库，鉴定出硝唑尼特可抑制HBX-DDB1相互作用。利用硝唑尼特，我们证实抑制HBX-DDB1相互作用可降低病毒转录水平及后续病毒产物水平。与靶蛋白融合的分裂荧光素酶的最佳片段必须预先确定。在此情况下，将大片段（Large Bit）融合在HPX的C末端，将小片段（Small Bit）融合在DDB1的末端，获得了最佳结果。

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使用分体路西酶测定系统识别 HBx-DDB1 相互作用的抑制剂

microRNA（miRNA）是基因表达的重要调控因子，已被证明在多种生物学过程中发挥作用。为了更深入地理解miRNA与非翻译区（UTR）之间的相互作用，我们构建了一个全基因组范围的3'...

利用3'非翻译区报告基因构建体和microRNA模拟物在贴壁细胞中使用LightSwitch荧光素酶检测系统鉴定人类microRNA靶标

本视频演示了分裂荧光素酶互补检测法，用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。在该检测中，目标蛋白质分别与荧光素酶的小片段和大片段融合。当蛋白质发生相互作用时，大片段和小片段会结合形成具有活性的酶复合物，在特定底物存在的情况下，该复合物会释放出强烈的发光信号，可被检测和测量。...

双分子荧光素酶互补分析法鉴定特异性蛋白质-蛋白质相互作用

实现对细胞过程的系统水平理解是当代细胞生物学的目标。本文介绍了利用全基因组规模的RNA干扰文库，通过多重荧光素酶报告系统检测多种细胞功能终点以研究基因功能的策略。...

一种基于多重荧光素酶的筛选平台用于在培养细胞中研究癌症相关信号转导

蛋白质之间的相互作用是所有细胞过程的基础。利用生物发光共振能量转移技术，可以在活细胞中实时监测一对蛋白质之间的相互作用。此外，还可以评估潜在致病性突变的影响。...

利用生物发光共振能量转移在活细胞中研究蛋白质-蛋白质相互作用

蛋白质之间会相互作用，而这些相互作用在很大程度上决定了它们的功能。可通过基于二氢叶酸还原酶蛋白片段互补分析法（DHFR-PCA）的酵母适合度检测，在高通量条件下在活体（in...

活细胞中基于蛋白质片段互补分析法（PCA）的全基因组蛋白质-蛋白质相互作用筛选

我们提供一种基于邻近标记技术BioID的蛋白片段互补实验——split-BioID的逐步操作方案。该方法在两个特定蛋白相互作用时被激活，可在天然细胞环境中实现对依赖于特定条件的蛋白复合物进行蛋白质组学分析。该方法操作简便、成本低廉，仅需常规实验室设备即可完成。...

分裂型BioID——在天然细胞环境中对特定情境下蛋白质复合物的蛋白质组学分析

本文介绍了一种基于荧光素酶的生物传感器，用于定量检测大型肿瘤抑制因子（LATS）的激酶活性——LATS是Hippo信号通路中的核心激酶。该生物传感器在基础研究和转化研究中具有广泛的应用前景，可用于研究Hippo信号通路的调控因子。 体外 和 体内.

利用基于荧光素酶的大型肿瘤抑制因子（LATS）生物传感器监测Hippo信号通路活性

我们介绍了一种利用哺乳动物双杂交检测法分析4-羟基他莫昔芬依赖性雌激素受体α配体结合域二聚化活性的方法。...

利用哺乳动物双杂交实验检测雌激素受体α配体结合结构域的二聚化活性

本文介绍了一组用于表征与疾病相关的 RAF 家族激酶突变体的实用且可行的方法，包括体外激酶活性检测、RAF...

利用一套实用且可行的方法表征RAF家族激酶的疾病相关突变体

本文介绍了一种在活细胞中检测eIF4E与eIF4G相互作用的实验方案，该方法可用于在筛选条件下评估药物对eIF4F复合物动态的干扰作用。...

通过活细胞中eIF4E-eIF4G相互作用的检测来监测eIF4F复合物的组装

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