Name: 有效转录控制质粒表达系统，用于研究原发性奥子拉皮细胞中mRNA笔录稳定性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学习利用可诱导表达系统与微量移液器电穿孔技术研究原代肺泡上皮细胞中mRNA转录后调控机制。该方法对细胞生理影响极小，适用于分析3'非翻译区对mRNA稳定性的作用。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Francis Migneault 获得了魁北克呼吸健康网络和加拿大卫生研究院（CIHR）肺部培训项目提供的博士后奖学金，以及来自 FRSQ 和蒙特利尔大学研究生与博士后学院的博士生奖学金支持。本研究得到了 Gosselin-Lamarre 临床研究讲席和加拿大卫生研究院 [YBMOP-79544] 的资助。

所有动物实验均按照加拿大动物护理委员会的指南进行，并已获得蒙特利尔大学医院研究中心（CRCHUM）机构动物护理委员会的批准。
1. 表达目的基因（GOI）的响应质粒的设计与构建
<ol>
	<li>使用可诱导的四环素关闭型载体，例如 pTRE-Tight。</li>
	<li>分析目的基因（GOI）序列和载体的多克隆位点（MCS），以确定 MCS 中存在但目的基因内部不存在的限制性酶切位点。</li>
	<li>按照先前描述的方法19,20，从雄性 Sprague-Dawley 大鼠肺中分离原代肺泡上皮细胞。</li>
	<li>采用标准方法（如酚/氯仿抽提法或基于硅胶膜的 RNA 离心柱法）提取肺泡上皮细胞的总 RNA。</li>
	<li>使用 oligo(dT) 引物和高保真逆转录酶将 mRNA 逆转录为互补 DNA（cDNA）。</li>
	<li>使用高保真 Taq 聚合酶和标准重叠 PCR 技术，通过设计的引物在目的基因两侧引入两个选定的限制性酶识别位点。
	<ol>
		<li>正向引物应包含 Kozak 共识核糖体结合位点21，以提高表达水平，便于同时研究蛋白表达与 mRNA 稳定性。在目的基因上游需包含编码 V5 表位的序列，以区分转染的目的基因表达与内源性表达（表 1）。</li>
		<li>反向引物应在终止密码子后包含一个多聚腺苷酸化信号序列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可通过连续缺失的方法构建突变体，以研究不同 3' 非翻译区（UTR）对目的基因 mRNA 稳定性的影响，使用编码多聚腺苷酸化位点的反向引物逐步删除目的基因 3' UTR 的 3' 端（图 6）。或者，可采用 PCR 定向突变技术靶向 3' UTR 中特定感兴趣区域22。</li>
	<li>用先前选定的限制性内切酶在适宜温度下消化诱导型载体和插入片段 1 小时，随后在载体反应中加入磷酸酶处理 30 分钟，以防止自连。</li>
	<li>通过 1-1.5% 琼脂糖凝胶电泳（浓度根据插入片段大小确定）分离经酶切的载体和插入片段。</li>
	<li>使用刀片和紫外灯切下含有目标插入片段和载体的 DNA 条带并收集。 
	注意：此步骤可暂停。</li>
	<li>使用基于硅胶膜的 PCR 纯化试剂盒从琼脂糖凝胶中回收收集的 DNA 片段，并在 260 nm 处通过分光光度法测定其浓度。</li>
	<li>使用 T4 DNA 连接酶将目的基因与诱导型载体连接，载体与插入片段的摩尔比为 1:3，以提高连接效率。在室温（RT）下孵育反应 3 小时。</li>
	<li>将连接产物转化至感受态大肠杆菌（E. coli）DH5α 中。
	<ol>
		<li>将 1-10 ng 的载体和基因加入含有 100 µL 感受态细胞的离心管中。冰上孵育 30 分钟，然后 42 °C 热激 45 秒。再次置于冰上 2 分钟，加入 900 µL 室温 LB 培养基。在 37 °C 下以 225 rpm 振荡培养 1 小时。</li>
		<li>取 100 µL 转化液涂布于含适当抗生素的 LB 琼脂平板（例如 pTRE-Tight 载体使用 100 µg/mL 氨苄青霉素）上，以筛选转化菌落。37 °C 过夜培养。</li>
		<li>用接种环或 20 µL 枪头挑取单菌落，接种至含适当抗生素的 5 mL LB 培养基中，37 °C 振荡培养过夜。转化后的细菌可按 LB 培养基与甘油 400:600 的比例制成甘油菌，于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用基于硅胶膜的质粒纯化柱提取质粒 DNA，并在 260 nm 处通过分光光度法测定其浓度。通过限制性酶切分析确认目的基因的插入，并通过测序验证其方向及排除 RT-PCR 过程中可能引入的突变。</li>
</ol>
2. 将表达目的基因（GOI）的报告质粒转染至原代肺泡上皮细胞
<ol>
	<li>从大鼠肺组织中分离Ⅱ型肺泡上皮细胞。</li>
	<li>将细胞以 1 × 106 个细胞/cm2 的密度接种于含完全最低必需培养基（完全 MEM）的 100 mm 培养皿中。完全 MEM 指在 MEM 基础上添加 10% 胎牛血清（FBS）、0.08 mg/L 妥布霉素、复方新诺明（3 µg/mL 甲氧苄啶和 17 µg/mL 磺胺甲噁唑）、0.2% NaHCO3、0.01 M HEPES（pH = 7.3）以及 2 mM L-谷氨酰胺。将细胞置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养 24 小时。</li>
	<li>次日，向新的 12 孔板每孔加入 500 µL 不含抗生素的完全 MEM，并在 37 °C 预热 30 分钟。此步骤中，应使用无四环素污染或四环素含量极低、不足以干扰诱导表达的胎牛血清。</li>
	<li>在 1.5 mL 离心管中分别加入可诱导的目的基因质粒（GOI 质粒）和调控载体（如 pTet-Off），每孔各加入 1 µg GOI 质粒和 1 µg 调控载体，于室温下配制。若需进行与 RNA 结合蛋白（RBP）共表达的实验，则在 DNA 混合物中额外加入 1 µg 表达目标 RBP 的组成型表达载体（如 pcDNA3）（图 7）。</li>
	<li>吸除培养基，用预热至 37 °C 的不含钙镁离子的 PBS 轻柔冲洗细胞。</li>
	<li>加入 5 mL 预热至 37 °C 的 0.05% 胰蛋白酶，孵育至细胞脱落（2–4 分钟）。加入 10 mL 不含抗生素的完全 MEM 以中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>将细胞悬液收集至 50 mL 离心管中，用 4 mL 培养基冲洗培养皿以尽可能回收残留细胞，随后将细胞悬液于 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>轻柔吸除上清液，将沉淀用 1 mL PBS 重悬。使用血细胞计数板计数并计算细胞数量。</li>
	<li>以 300 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液，将沉淀用重悬缓冲液重悬至浓度为 4 × 107 个细胞/mL。取步骤 2.4 中配制的 1.5 mL 管中的细胞，按每孔 400,000 个细胞的量加入，并用移液器轻柔吹打混匀。</li>
	<li>将离心管放入电穿孔装置中，并加入 3.5 mL 电解缓冲液。</li>
	<li>将镀金电极头插入移液器枪头，完全压下活塞。轻柔混匀 1.5 mL 管中的内容物，小心用移液器吸取细胞悬液。注意避免气泡进入枪头，否则在电穿孔过程中会产生电弧，导致转染效率下降。</li>
	<li>将移液器插入电穿孔仪，直至听到“咔哒”声。</li>
	<li>选择适用于肺泡上皮细胞的电穿孔程序，对应脉冲电压为 1,450 V，2 次脉冲，脉宽 20 ms，然后在触摸屏上按下 开始。</li>
	<li>转染后立即取出移液器，将细胞转移至预先加入已预热至 37 °C 的不含抗生素完全 MEM 的孔中。</li>
	<li>对剩余样品重复步骤 2.11–2.14。</li>
	<li>轻柔振荡培养板，使细胞均匀分布于孔底表面。将细胞置于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育。两天后，更换为含抗生素的完全 MEM。</li>
	<li>通过荧光显微镜观察 eGFP 表达或使用表达 eGFP 的对照载体进行流式细胞术分析，确认转染成功（图 1）。 
	注意：此步骤为可选，需额外进行一次转染，使用表达 eGFP 的不同质粒（如 pcDNA3-EGFP）。</li>
</ol>
3. 诱导目的基因的转录抑制
注意：可在强力霉素诱导前对细胞进行所需的处理，以评估这些处理对 mRNA 稳定性的影响（图 5）。
<ol>
	<li>用去离子水配制浓度为 1 mg/mL 的多西环素储备液。将储备液于 -20 °C 避光保存。多西环素是一种四环素衍生物，因其半衰期比四环素长（2 倍），故优先选用。此外，完全失活 tet 操纵子所需的多西环素浓度也更低23。 
	注意：多西环素可能影响内源性目的基因（GOI）的 mRNA 表达。为验证这一点，应检测多西环素处理 24 小时后对肺泡细胞的影响，以确认目的基因表达无任何变化（图 2）。</li>
	<li>转染后 72 小时，在完全 MEM 培养基中新鲜配制 1 µg/mL 的多西环素溶液，并将其预热至 37 °C。</li>
	<li>每孔加入 1 mL 含 1 µg/mL 多西环素的完全 MEM 培养基，替换原有培养基，以抑制目的基因的转录。</li>
	<li>将多个孔板置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育不同时间（15 分钟至 6 小时），以评估目的基因 mRNA 的半衰期。</li>
	<li>处理结束后，用预冷的 PBS 洗涤细胞，然后每孔加入 500 µL 裂解缓冲液，使用商品化的苯酚-氯仿 RNA 提取试剂盒裂解细胞，并轻轻振荡培养板以充分匀浆。</li>
	<li>按照试剂盒说明书提取 RNA。通过分光光度法在 230、260 和 280 nm 波长下测定 RNA 产量和纯度。当 RNA 样品的 260:230 和 260:280 比值分别为 1.8 和 2.0 时，视为纯度合格。 
	注意：此步骤可暂停。</li>
</ol>
4. 确定目的基因mRNA的稳定性
<ol>
	<li>用无RNA酶的DNA酶I（扩增级）处理1 µg总RNA，以去除可能干扰后续DNA扩增的质粒DNA残留。
	<ol>
		<li>在0.2 mL的PCR管中，加入1 µg总RNA、1 µL 10x DNase I反应缓冲液、1 µL DNase I（1 U/µL），并用RNase-free水补足至总体积为10 µL。</li>
		<li>在室温下孵育反应20分钟。</li>
		<li>通过向10 µL反应体系中加入1 µL 25 mM EDTA来灭活DNA酶I，并在70 °C孵育反应体系10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用市售的cDNA合成试剂盒，结合oligo(dT)和随机六聚体引物，将去除了DNA的总RNA逆转录为cDNA，以提高逆转录效率。
	<ol>
		<li>简言之，向11 µL去除了DNA的总RNA混合物中加入4 µL 5x反应混合液、1 µL逆转录酶和4 µL无RNase的水，使总反应体积达到20 µL。用移液器反复吹打充分混匀反应体系。</li>
		<li>在25 °C孵育反应5分钟，随后在46 °C孵育20分钟，最后在95 °C孵育1分钟以终止反应。每个反应可产生50 ng/µL的cDNA产物。</li>
		<li>将20 µL cDNA反应体系加入180 µL分子生物学级水，稀释至浓度为5 ng/µL。cDNA产物可于-80 °C保存，或立即用于进行实时定量PCR（qPCR）。 
		注意：此处可暂停本实验方案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设计针对目的基因（GOI）的特异性qPCR正向和反向引物。
	<ol>
		<li>由于细胞中存在目的基因（GOI）的内源性表达，引物设计必须能够扩增出与目的基因（GOI）相连的V5表位的一段100–150 bp的扩增片段（表1).</li>
		<li>内参基因引物也必须用作归一化对照。通常，看家基因如β-actin和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1）基因被用作参考基因。然而，由于转染效率存在差异，这些基因不能在此诱导系统中使用。取而代之的是，通过检测tTA-Ad转录本的表达来进行归一化，因为该转录本在细胞中由巨细胞病毒（cytomegalovirus）启动子驱动，呈组成型表达。通过qPCR检测到的其表达水平的任何变化均可代表转染效率（引物：上游5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3'，下游5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3'；扩增产物长度为129 bp），从而可用于对转染克隆的表达水平进行归一化处理图3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 SYBR Green 染料预混液，每个 qPCR 反应设置三个复孔。
	<ol>
		<li>使用分子生物学级水将5 ng/µL的cDNA混合液稀释至1.25 ng/µL的浓度。</li>
		<li>将 5 µL SYBR Green 染料预混液（2x）、0.1 µL 分子生物学级水、0.45 µL 7.5 µM 正向引物、0.45 µL 7.5 µM 反向引物以及 4 µL 1.25 ng/µL cDNA 混合，得到总体积为 10 µL 的反应体系。在 96 孔 PCR 板中通过上下吹打充分混匀。使用光学粘性封膜确保板盖密封，防止污染和蒸发。</li>
		<li>短暂离心反应混合物，然后将反应板放入qPCR仪中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用以下qPCR条件扩增V5标签的GOI和tTA-Ad扩增子：95 °C变性10 min，随后进行40个循环，每个循环为95 °C 10 s、58 °C 15 s、72 °C 20 s。扩增循环结束后必须生成高分辨率熔解曲线，以评估目标扩增子的特异性熔解温度，并确保无非特异性扩增产物峰。
	<ol>
		<li>在qRT-PCR中设置阴性对照，包括以RNA为模板但不加逆转录酶进行qPCR，以检测是否存在质粒DNA污染；同时在qPCR反应体系中不添加cDNA进行qPCR，以确保无引物二聚体或污染物存在。</li>
		<li>目的基因（GOI）的最佳cDNA浓度、引物效率及引物浓度需通过标准曲线实验进行优化。为此，使用未处理细胞（未添加多西环素培养）的cDNA进行系列稀释。标准曲线通过将Cq值对cDNA稀释倍数的对数作图生成，扩增效率（E）根据标准曲线的斜率，按以下公式计算： 
		E = 10-1/斜率 
		注意：扩增效率应在0.9至1.05之间。否则，必须重新设计引物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用比较Cq法分析qPCR数据，通过将目的基因（GOI）的表达值归一化至tTA-Ad的表达水平，计算目的基因的相对表达量，并以同一动物来源细胞在起始时间点（t = 0）时目的基因mRNA表达水平的百分比形式报告其表达量图4).</li>
	<li>半衰期通过以下公式，由目的基因（GOI）mRNA降解曲线的速率常数（K）确定： 
	t1/2 = ln 2/K。</li>
</ol>

<ol><li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li>
<li>Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The transcription stress response.</a> Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).</li>
<li>Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">mRNA stability in mammalian cells.</a> Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li>
<li>Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serum+response+element+can+mediate+induction+of+c-fos+by+growth+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).</li>
<li>Harkin, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+GADD45+and+JNK%2FSAPK-dependent+apoptosis+following+inducible+expression+of+BRCA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.</a> Cell. 97 (5), 575-586 (1999).</li>
<li>Formisano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+isoforms+of+the+Na%2B%2FCa2%2B+exchanger%2C+NCX1+and+NCX3%2C+constitute+novel+additional+targets+for+the+prosurvival+action+of+Akt%2Fprotein+kinase+B+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway.</a> Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).</li>
<li>Yin, D. X., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+expression+delays+drug-induced+apoptosis+but+does+not+increase+clonogenic+survival+after+drug+treatment+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells.</a> Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).</li>
<li>Johnstone, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+leukemia+protein+ELL%3A+evidence+for+a+role+in+the+regulation+of+cell+growth+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).</li>
<li>Olotu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+inhibits+purinergic+signaling+and+promotes+purinergic+receptor+P2Y2+internalization+in+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).</li>
<li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+alveolar+epithelial+cells+type+II+are+capable+of+TGFbeta-dependent+epithelial-mesenchymal-transition+and+collagen-synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 138(2018).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+ameliorates+the+human+alveolar+epithelial+A549+cell+apoptosis+induced+by+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emodin+suppresses+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+alveolar+epithelial+cells+through+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).</li>
<li>Cooper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Term+Culture+of+the+A549+Cancer+Cell+Line+Promotes+Multilamellar+Body+Formation+and+Differentiation+towards+an+Alveolar+Type+II+Pneumocyte+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype.</a> PLoS One. 11 (10), e0164438(2016).</li>
<li>Hirakata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culture+systems+with+respiratory+epithelial+cells+for+evaluation+of+bacterial+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Tohoku+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+functions+of+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Regulatory functions of 3'UTRs.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).</li>
<li>Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lengthening+of+3%27UTR+increases+with+morphological+complexity+in+animal+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution.</a> Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).</li>
<li>Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+epithelial+sodium+channels+to+alveolar+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease.</a> Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).</li>
<li>Boncoeur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+epithelial+sodium+channel+activity+by+lipopolysaccharide+in+alveolar+type+II+cells%3A+involvement+of+purinergic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).</li>
<li>Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+alveolar+epithelial+Type+I+and+Type+II+cells+from+rat+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).</li>
<li>Ke, S. H., Madison, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-directed+mutagenesis+by+single-tube+%27megaprimer%27+PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGossen%2C+M+%22Tetracyclines+in+Biology%2C+Chemistry+and+Medicine%22">Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine</a>. Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. , Birkhäuser. Basel. (2001).</li>
<li>Migneault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-Transcriptional+Modulation+of+aENaC+mRNA+in+Alveolar+Epithelial+Cells%3A+Involvement+of+its+3%27+Untranslated+Region%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).</li>
<li>Migneault, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Modulation+de+la+stabilit%C3%A9+de+l%27ARNm+alphaENaC+dans+les+cellules+%C3%A9pith%C3%A9liales+alv%C3%A9olaires%3A+d%C3%A9termination+du+r%C3%B4le+des+s%C3%A9quences+3%27+non+traduites%22">Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites</a>. , Université de Montréal. (2015).</li>
<li>Grzesik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+to+primary+alveolar+epithelial+cells+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).</li>
<li>Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+doxycycline-induced+cytotoxicity+on+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells.</a> Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).</li>
<li>Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+impairs+neutrophil+migration+to+the+airspaces+of+the+lung+in+mice+exposed+to+intratracheal+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation-London%22%5BJournal%5D)">Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide.</a> Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31(2012).</li>
<li>Hovel, H., Frieling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+doxycycline%2C+mezlocillin+and+clotrimazole+in+cell+culture+media+as+contamination+prophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Biological+Standardization%22%5BJournal%5D)">The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis.</a> Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).</li>
<li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+pathways+of+RNA+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li>
<li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

原代培养的肺泡上皮细胞转染效率低，一直是应用 Tet-Off 系统评估这些细胞中 mRNA 稳定性的严重限制因素。然而，通过移液管电穿孔技术克服了这一限制，实现了 25–30% 的转染效率（图 1 和 图 3）26。
转录本稳定性的测定对于理解特定mRNA的调控机制及其对细胞稳态和代谢的影响至关重要。目的基因（GOI）生物可利用性的变化可能改变翻译效率，并直接影响该基因在细胞内的表达水平。因此，已发展出多种技术用于测定mRNA的半衰期。如上所述，这些技术均存在一定的局限性和约束条件，限制了对目标转录本的准确研究。与其他方法相比，本文所建立的TET-off模型具有可在任意实验条件下估算特定mRNA半衰期的优势。然而，该模型无法直接研究内源性转录本的稳定性。为尽可能克服这一局限，建议在质粒中包含该转录本的5'非翻译区（5' UTR）和3'非翻译区（3' UTR）序列，使构建的表达载体尽可能接近内源性转录本。V5表位的引入...

已开发出多种技术用于测定mRNA的半衰期。脉冲-追踪降解技术利用标记的mRNA，可在细胞干扰最小的情况下同时评估大量mRNA的稳定性。然而，该方法无法直接估算单个基因转录本的半衰期，也不能用于研究在生长因子、活性氧（ROS）、警报素或炎症刺激后mRNA的转录后调控过程1。
使用转录抑制剂（如放线菌素D和α-鹅膏蕈碱）是一种相对简单的方法，可用于随时间测量mRNA的降解动力学。与先前的技术（例如脉冲-追踪法）相比，该方法的一个主要优势在于能够直接估算特定转录本的半衰期，并比较不同处理条件对其降解动力学的影响。然而，转录抑制剂对细胞生理状态具有显著的有害影响，这是该方法的主要缺点2。事实上，这些药物对全细胞转录组的抑制会带来负面副作用，干扰参与mRNA稳定性的关键组分的合成，例如微小RNA（miRNA），以及RNA结合蛋白的表达与合成，而这些蛋白在mRNA降解和稳定性中起重要作用。因此，这些药物对基因转录的严重干扰可能会人为地改变转录本的降解曲线。
启动子诱导系统是测定特定mRNA半衰期的第三种方法。该方法测定特定mRNA降解的方式与使用转录抑制剂的方法类似。常用的诱导系统有两种：血清诱导的c-fos启动子3和Tet-Off可诱导系统4。使用c-fos系统时，无需使用可能对细胞有毒性的转录抑制剂。然而，该方法需要进行细胞周期同步化，从而无法评估转录本在间期的真实稳定性5。相比之下，Tet-Off系统可在合成型四环素调控启动子的控制下实现目的基因（GOI）的强表达。该系统需要两个元件共转染细胞后才能发挥功能。第一个质粒（pTet-Off）表达调控蛋白tTA-Adv，这是一种由原核阻遏蛋白TetR（来自大肠杆菌Escherichia coli）与三个来自病毒蛋白HSV VP16的转录激活结构域融合而成的杂合型合成转录因子。目的基因被克隆至pTRE-Tight质粒中，受控于一个合成启动子（PTight），该启动子包含巨细胞病毒（CMV）启动子的最小序列，并融合了七段tetO操纵子序列的重复片段。位于PTight下游基因的转录依赖于TetR与tetO的相互作用。当存在四环素或其衍生物多西环素（doxycycline）时，TetR阻遏蛋白对tetO操纵子的亲和力丧失，导致转录终止4。Tet-Off系统的特性使其成为研究真核细胞中特定mRNA表达的理想模型，同时避免了因真核细胞中缺乏原核调控序列而可能产生的多效性影响6。通常，采用双稳定Tet-Off细胞系（如HEK 293、HeLa和PC12）与该系统联用，以便将调控质粒和响应质粒整合入基因组，从而实现对基因表达的便捷调控7,8,9。
已采用多种肺泡上皮细胞的体外培养模型来研究肺泡上皮的细胞与分子生物学特性。多年来，研究人员广泛使用人或啮齿类动物的原代细胞10,11，以及永生化细胞系，如人源A549细胞或大鼠RLE-6TN细胞12,13。尽管原代培养的肺泡上皮细胞通常增殖能力较低，且培养和转染难度较大，但在生理和病理条件下研究肺泡上皮功能与功能障碍方面，它们仍是金标准。事实上，永生化细胞系（如A549细胞）并不具备原代细胞复杂的特性和表型，而原代培养的肺泡上皮细胞则能重现肺泡上皮的主要特性，尤其是形成极化且紧密屏障的能力14,15。然而，这些细胞对常规转染技术（如脂质体介导的转染）具有很强的抗性，使得使用Tet-Off等启动子诱导系统变得极为困难。
mRNA 的转录后调控是快速调节转录本基因表达的最有效方法之一16。mRNA 的 3' 非翻译区（3' UTR）在这一机制中起着重要作用。研究表明，与 5' UTR 不同，3' UTR 的长度与生物体的细胞复杂性和形态复杂性之间存在指数相关性。这种相关性表明，3' UTR 与 mRNA 编码区一样，在进化过程中经历了自然选择，从而实现了日益复杂的转录后调控17。3' UTR 包含多个蛋白质和 miRNA 的结合位点，这些位点可影响转录本的稳定性和翻译效率。
在本研究中，我们开发了一种工具，用于研究目的基因（GOI）3'非翻译区（3' UTR）中高度保守结构域在转录本稳定性调控中的作用。我们重点关注上皮钠通道α亚基（αENaC），该蛋白在肺泡上皮生理过程中发挥关键作用18。通过原代培养的肺泡上皮细胞，成功瞬时转染了Tet-Off系统的两个组分，该系统可在对细胞生理和代谢影响最小的情况下，研究3' UTR在mRNA稳定性中的作用，相较于其他方案中使用转录抑制剂的方法更具优势。我们设计了一种克隆策略，利用非内源性表达的表位（V5）来区分目的基因与内源基因的表达。随后，采用移液器电穿孔技术将应答质粒和调控质粒导入肺泡上皮细胞。接着，通过在不同时间点用多西环素处理细胞，检测转录本的表达水平。采用经转染的tTA-Ad mRNA产物作为归一化参照，结合改良的Cq法进行RT-qPCR分析，评估转录本的半衰期。通过本实验方案，我们提供了一种便捷的方法，用于在不同条件下研究转录本的转录后调控机制，并更深入地界定非翻译区的参与作用。

<table><tbody><tr><td>放线菌素D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td></td></tr><tr><td>亮线血细胞计数板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>氯仿 - 分子生物学级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>环己酰亚胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>DM IL LED 倒置显微镜，配备相差功能</td><td>Leica</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DNase I，扩增级</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td></td></tr><tr><td>盐酸多西环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;不含钙和镁的D-磷酸盐缓冲液（D-PBS）</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 - 分子生物学级</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Excella E25 恒温振荡培养箱</td><td>Eppendorf</td><td>1220G76</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7.3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>51026420</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA合成试剂盒</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇 - 分子生物学级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤（Lennox）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤加琼脂（Lennox）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>铜绿假单胞菌的脂多糖10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9143</td><td></td></tr><tr><td>MEM，粉末</td><td>Gibco</td><td>61100103</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 光学 96 孔反应板</td><td>应用生物系统公司</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 光学粘性膜</td><td>应用生物系统公司</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>MSC-Advantage II级生物安全柜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>51025413</td><td></td></tr><tr><td>Mupid-exU 电泳系统</td><td>Takara Bio</td><td>AD140</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统 10 &amp;micro;L 型试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025</td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统入门装</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td></td></tr><tr><td>One Shot OmniMAX 2 T1R 化学感受态 E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C854003</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3 载体</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>V790-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-EGFP 质粒</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>PlatinumTaq DNA聚合酶 高保真</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>pTet-Off Advanced 载体</td><td>Takara Bio</td><td>631070</td><td></td></tr><tr><td>pTRE-Tight 载体</td><td>Takara Bio</td><td>631059</td><td></td></tr><tr><td>纯化的肺泡上皮细胞</td><td>无可用数据</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II 琼脂糖凝胶回收试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN 质粒大提试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 和 7 Flex 实时荧光定量 PCR 系统软件</td><td>Applied Biosystems</td><td>无可用数据</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex 实时荧光定量 PCR 系统，96 孔快速板</td><td>Applied Biosystems</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>重组大鼠TNF-α蛋白</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>510-RT-010</td><td></td></tr><tr><td>Septra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2487</td><td></td></tr><tr><td>重组虾碱性磷酸酶（rSAP）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1725270</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV 逆转录酶</td><td>Invitrogen</td><td>18090010</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>四环素系统认证胎牛血清</td><td>Takara Bio</td><td>631367</td><td></td></tr><tr><td>妥布霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>水，分子生物学级</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-EL</td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究原代肺泡上皮细胞中mrna转录本稳定性的高效转录调控质粒表达系统

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

研究转录后调控对于理解特定信使RNA（mRNA）的调控机制及其对细胞稳态和代谢的影响至关重要。事实上，转录本表达水平的波动可能改变翻译效率，最终影响转录本的细胞功能。已有多种实验方法被开发用于研究mRNA的半衰期，但其中一些方法存在局限性，限制了对转录后调控的准确研究。启动子诱导系统可在合成型四环素调控启动子的控制下表达目的基因，该方法能够在不干扰细胞稳态的前提下，在任意实验条件下估算特定mRNA的半衰期。该方法的一个主要缺点是需要对细胞进行转染，这限制了其在原代分离细胞中的应用，因为这些细胞通常对常规转染技术具有高度抗性。原代培养的肺泡上皮细胞已被广泛用于研究肺泡上皮的细胞与分子生物学特性。由于原代肺泡细胞具有独特的特性和表型，因此在这些细胞中研究目的基因的转录后调控显得尤为必要。因此，我们的目标是开发一种新工具，用于在原代培养的肺泡上皮细胞中研究目的mRNA的转录后调控。我们设计了一种快速且高效的瞬时转染方案，将转录可控的质粒表达系统导入原代肺泡上皮细胞。该克隆策略利用病毒表位对构建体进行标记，从而可轻松区分外源构建体的表达与内源mRNA的表达。通过改进的ΔΔ定量循环（Cq）方法，可在不同时间点定量检测转录本的表达水平，以测定其半衰期。我们的数据表明，这种新方法在研究原代肺泡上皮细胞多种病理生理条件下转录后调控方面具有高效性和实用性。

本方案已成功用于构建 Tet-Off 转录调控型质粒表达系统，以评估 αENaC 3' 非翻译区（UTR）不同片段在原代肺泡上皮细胞中对转录本稳定性的调控作用。
实施该系统的第一步是建立一种快速、简便且高效的原代培养肺泡上皮细胞转染技术，这类细胞通常难以转染。如图1所示，移液管电穿孔技术可实现25–30%的转染效率，该数据通过荧光显微镜和流式细胞术检测到的表达eGFP的细胞比例得出。
在应用由四环素及其衍生物控制的该诱导系统之前，首先验证了该药物对目的基因（GOI）表达的影响。肺泡上皮细胞经处理后 1.0 µg/mL 多西环素处理以评估其对内源性 αENaC mRNA 表达的影响。如图所示，经过 1–24 小时的处理，对内源性转录本的表达无显著影响。 <strong cla...

本文介绍了一种工具，可用于通过诱导型表达系统结合移液管电穿孔技术，研究转录后水平对原代肺泡上皮细胞中转录本的调控作用。

用于研究原代肺泡上皮细胞中mRNA转录本稳定性的高效转录调控质粒表达系统

研究转录后调控对于理解特定信使RNA（mRNA）的调控机制及其对细胞稳态的影响至关重要……

因此，我们的模型可用于研究原代培养的肺泡上皮细胞在生理和病理生理条件下对特定转录本的转录后调控。原代肺泡上皮细胞的瞬时转染对细胞生理和代谢的影响极小，相较于使用转录抑制剂的经典方案具有明显优势。为了构建表达目的基因的响应质粒，需要分析目的基因的序列以及诱导型载体的多克隆位点，以确定多克隆位点中在目的基因内部不存在的识别序列。使用高保真Taq DNA聚合酶和标准的重叠PCR技术，通过设计引物在目的基因两侧引入两个选定的限制性内切酶识别位点。为了区分转染基因的表达与内源性表达，必须在目的基因上游包含编码V5表位的序列。可通过连续缺失的方法构建突变体，利用编码多聚腺苷酸化位点的反向引物逐步删除非翻译区的3'端，以研究不同3'非翻译区对目的基因mRNA稳定性的影响。最终，可通过限制性酶切分析确认目的基因的插入。通过测序可验证基因的方向性以及排除在反转录PCR过程中可能引入的突变。对于原代大鼠肺Ⅱ型肺泡上皮细胞的转染，需将细胞以每平方厘米1×10⁶个细胞的密度接种于100毫米的培养皿中，并加入完全最低必需培养基。在37摄氏度、5%二氧化碳及湿度条件下培养24小时。次日，向新的12孔板的每个孔中加入500微升不含抗生素的完全培养基，并在37摄氏度预热30分钟。在此孵育期间，为每个孔准备一个1.5毫升离心管，每管中加入1微克报告质粒和1微克调控载体。用每孔10毫升、37摄氏度、不含钙和镁的PBS洗涤肺泡上皮细胞，然后在细胞培养孵育箱中加入每孔5毫升、37摄氏度、0.05%的胰蛋白酶处理2至4分钟。细胞脱落后，用每孔10毫升不含抗生素的完全培养基中和胰蛋白酶，并将细胞收集至新的50毫升离心管中。用4毫升新鲜培养基冲洗培养皿以收集残留细胞，然后通过离心沉淀细胞。将沉淀重悬于1毫升PBS中用于计数，并再次离心细胞。用重悬缓冲液将沉淀重悬至每毫升含4×10⁷个细胞的密度，取4×10⁵个细胞加入至每管质粒和载体中，轻轻混匀。取一管放入电穿孔仪中，并向管内加入3.5毫升电转缓冲液。完全压下活塞，将镀金电极头插入移液枪头，轻轻混匀管内物质。用移液枪小心吸取细胞，并将移液枪插入电穿孔仪中，直至听到咔嗒声。选择适用于肺泡上皮细胞的电穿孔程序，然后按下触摸屏上的“开始”按钮。转染后立即移除移液器，并将细胞转移至预热的12孔板中的一个孔内。当所有细胞完成电穿孔并接种后，将培养板放入细胞培养箱中，在两天后用含抗生素的完全培养基替换每孔中的上清液。通过荧光显微镜或使用对照载体进行流式细胞术观察EGFP的表达，可验证转染是否成功。为了抑制目的基因的转录，在转染后72小时，将每孔上清液更换为1毫升含1微克/毫升新鲜配制的阿多西环素的完全培养基。为了评估目的基因mRNA的半衰期，将培养板放回细胞培养箱中孵育，时间从15分钟至6小时不等。在每个实验时间点，用1毫升预冷的PBS洗涤一个孔，随后加入500微升商品化苯酚-氯仿RNA提取试剂盒中的裂解缓冲液，轻柔振荡裂解细胞。然后，根据试剂盒说明书分离RNA，并在230、260和280纳米波长下通过分光光度法测定RNA的产量和纯度。为评估所分离RNA的稳定性，首先将每个样本的1微克总RNA用无RNase的DNase I处理，以去除任何质粒DNA残留。使用市售的cDNA合成试剂盒，结合oligo dT和随机六聚体引物，以提高逆转录效率，按照制造商说明书将去除DNA后的总RNA逆转录为cDNA。向20微升反应混合物中加入180微升分子生物学级水，将cDNA反应稀释至每微升5纳克的浓度，随后立即用新鲜的分子生物学级水进一步稀释cDNA混合物，使其达到每微升1.25纳克的浓度。取5微升SYBR Green染料预混液，加入0.1微升分子生物学级水、0.45微升7.5微摩尔的正向引物、0.45微升7.5微摩尔的反向引物以及4微升浓度为每微升1.25纳克的cDNA，混合后总体积为10微升。将样品放入qPCR仪中，按照指定的qPCR条件扩增目标V5标签基因和四环素转录激活因子增强型扩增子，并生成高分辨率熔解曲线，以评估目的扩增子的特异性熔解温度，并确保无非特异性扩增子峰的存在。这种移液电穿孔技术可实现25%至30%的转染效率，该结果通过荧光显微镜和流式细胞术检测EGFP阳性细胞的比例得出。在治疗期间的任何时间点，以每毫升1微克的浓度处理肺泡上皮细胞，对内源性αENaC mRNA的表达均无显著影响。如本实验所示，采用转录调控的质粒表达系统，可通过四环素反式激活因子的信号对V5标记的αENaC信号进行标准化，从而利用双Δ定量循环法（double delta quantification cycle method）确定转染效率。在四环素关闭系统存在的情况下，α ENaC mRNA的半衰期比放线菌素D处理时最多短七倍，证实放线菌素D会导致α ENaC mRNA稳定性的假象。此外，环己酰亚胺和肿瘤坏死因子α处理显著降低了该转录本的稳定性，而脂多糖则无此作用。根据3'非翻译区中被删除或保留的不同区域，可诱导V5标记的α ENaC mRNA稳定性发生显著变化。此外，特定RNA结合蛋白的过表达与转染空载体pcDNA3质粒相比，会降低5-α ENaC mRNA的稳定性。该工具将有助于探究肺泡上皮功能相关关键基因在生理或病理条件下转录后调控的新机制。

efficient-transcriptionally-controlled-plasmid-expression-system-for

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

有效转录控制质粒表达系统，用于研究原发性奥子拉皮细胞中mRNA笔录稳定性

在活细胞中测定特定基因的RNA聚合酶II转录动力学。通过荧光标记目的基因转录出的mRNA，并利用光漂白后荧光恢复技术（FRAP），获得体内转录延伸的动力学参数。...

单个活细胞中 mRNA 转录动力学的测量

本视频介绍了通过将含有目的基因的质粒和调控质粒共转染培养细胞来调控基因表达的方法。该质粒的表达可由四环素或其合成类似物进行控制，因此该系统是研究可调控基因表达的有用模型。...

可诱导的 Tet-Off 调控系统：利用四环素-关闭系统在培养细胞中进行基因表达调控的体外方法

转基因小鼠或病毒载体已被用于增加肺组织内的蛋白表达。然而，这些技术耗时较长，技术难度较高，且存在脱靶效应，可能干扰实验结果。我们的蛋白转染方案采用基于脂质的转染试剂和超细雾化微喷器，可将活性蛋白均匀递送至肺细胞。...

小鼠肺部蛋白质转染

本文介绍一种基于细胞的报告基因检测方法，该方法可作为筛选通过3’非翻译区（3’...

高通量筛选转录后调控基因的化学调节剂

原代人支气管上皮细胞难以转导。本方案描述了慢病毒的制备与浓缩方法，以及在这些细胞向假复层上皮分化过程中实现高效转导所需的最适培养条件。...

优化慢病毒生产与细胞培养条件以成功转导原代人支气管上皮细胞

通过异源表达系统研究离子通道已成为生物医学研究中的一项核心技术。在本论文中，我们介绍一种高效的时间控制方法，通过在可诱导启动子调控下进行瞬时转染，实现对离子通道表达的精确调控。...

通过可诱导瞬时转染实现离子通道表达的可控调控

巨噬细胞，尤其是原代巨噬细胞，因其专长于识别非自身来源的分子，转染难度较高。本文介绍一种可实现高效转染原代巨噬细胞的方案，所用mRNA由质粒等DNA模板体外转录生成。...

原代巨噬细胞的高效转染使用体外转录mRNA

我们开发了一种可用于细胞的内含子微小RNA（microRNA）生成报告检测方法 体外 使用四种质粒：一种携带内含子miRNA，一种携带靶序列，一种用于过表达调控蛋白，一种用于Renilla荧光素酶。miRNA被加工处理后，可通过结合靶序列来调控荧光素酶的表达。...

一种用于分析哺乳动物细胞中内含子microRNA成熟的报告基因检测方法

本文介绍一种可重复、经济且稳健的方法，用于分离和扩增原代支气管上皮细胞，以实现长期生物样本库保存，并通过气液界面培养生成分化成熟的上皮细胞。...

从切除的肺组织中分离支气管上皮细胞用于生物样本库建设及建立高度分化的气液界面培养模型

本方案介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于从新生、幼年或成年小鼠肺组织（感染或未感染）中分离出有活力的肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECII）。该方法可支持后续对AECII进行分子水平和/或功能研究，以明确其在肺部炎症与感染过程中的作用。...

从新生、幼年及成年小鼠肺组织中分离肺泡II型上皮细胞并适用于感染性实验条件

学习利用可诱导表达系统与微量移液器电穿孔技术研究原代肺泡上皮细胞中mRNA转录后调控机制。该方法对细胞生理影响极小，适用于分析3'非翻译区对mRNA稳定性的作用。

用于研究原代肺泡上皮细胞中mRNA转录本稳定性的高效转录调控质粒表达系统

探索更多视频