用于研究原代肺泡上皮细胞中mRNA转录本稳定性的高效转录调控质粒表达系统

因此，我们的模型可用于研究原代培养的肺泡上皮细胞在生理和病理生理条件下对特定转录本的转录后调控。原代肺泡上皮细胞的瞬时转染对细胞生理和代谢的影响极小，相较于使用转录抑制剂的经典方案具有明显优势。为了构建表达目的基因的响应质粒，需要分析目的基因的序列以及诱导型载体的多克隆位点，以确定多克隆位点中在目的基因内部不存在的识别序列。

使用高保真Taq DNA聚合酶和标准的重叠PCR技术，通过设计引物在目的基因两侧引入两个选定的限制性内切酶识别位点。为了区分转染基因的表达与内源性表达，必须在目的基因上游包含编码V5表位的序列。可通过连续缺失的方法构建突变体，利用编码多聚腺苷酸化位点的反向引物逐步删除非翻译区的3'端，以研究不同3'非翻译区对目的基因mRNA稳定性的影响。

最终，可通过限制性酶切分析确认目的基因的插入。通过测序可验证基因的方向性以及排除在反转录PCR过程中可能引入的突变。对于原代大鼠肺Ⅱ型肺泡上皮细胞的转染，需将细胞以每平方厘米1×10⁶个细胞的密度接种于100毫米的培养皿中，并加入完全最低必需培养基。

在37摄氏度、5%二氧化碳及湿度条件下培养24小时。次日，向新的12孔板的每个孔中加入500微升不含抗生素的完全培养基，并在37摄氏度预热30分钟。在此孵育期间，为每个孔准备一个1.5毫升离心管，每管中加入1微克报告质粒和1微克调控载体。

用每孔10毫升、37摄氏度、不含钙和镁的PBS洗涤肺泡上皮细胞，然后在细胞培养孵育箱中加入每孔5毫升、37摄氏度、0.05%的胰蛋白酶处理2至4分钟。细胞脱落后，用每孔10毫升不含抗生素的完全培养基中和胰蛋白酶，并将细胞收集至新的50毫升离心管中。用4毫升新鲜培养基冲洗培养皿以收集残留细胞，然后通过离心沉淀细胞。

将沉淀重悬于1毫升PBS中用于计数，并再次离心细胞。用重悬缓冲液将沉淀重悬至每毫升含4×10⁷个细胞的密度，取4×10⁵个细胞加入至每管质粒和载体中，轻轻混匀。取一管放入电穿孔仪中，并向管内加入3.5毫升电转缓冲液。

完全压下活塞，将镀金电极头插入移液枪头，轻轻混匀管内物质。用移液枪小心吸取细胞，并将移液枪插入电穿孔仪中，直至听到咔嗒声。选择适用于肺泡上皮细胞的电穿孔程序，然后按下触摸屏上的“开始”按钮。

转染后立即移除移液器，并将细胞转移至预热的12孔板中的一个孔内。当所有细胞完成电穿孔并接种后，将培养板放入细胞培养箱中，在两天后用含抗生素的完全培养基替换每孔中的上清液。通过荧光显微镜或使用对照载体进行流式细胞术观察EGFP的表达，可验证转染是否成功。

为了抑制目的基因的转录，在转染后72小时，将每孔上清液更换为1毫升含1微克/毫升新鲜配制的阿多西环素的完全培养基。为了评估目的基因mRNA的半衰期，将培养板放回细胞培养箱中孵育，时间从15分钟至6小时不等。在每个实验时间点，用1毫升预冷的PBS洗涤一个孔，随后加入500微升商品化苯酚-氯仿RNA提取试剂盒中的裂解缓冲液，轻柔振荡裂解细胞。

然后，根据试剂盒说明书分离RNA，并在230、260和280纳米波长下通过分光光度法测定RNA的产量和纯度。为评估所分离RNA的稳定性，首先将每个样本的1微克总RNA用无RNase的DNase I处理，以去除任何质粒DNA残留。使用市售的cDNA合成试剂盒，结合oligo dT和随机六聚体引物，以提高逆转录效率，按照制造商说明书将去除DNA后的总RNA逆转录为cDNA。

向20微升反应混合物中加入180微升分子生物学级水，将cDNA反应稀释至每微升5纳克的浓度，随后立即用新鲜的分子生物学级水进一步稀释cDNA混合物，使其达到每微升1.25纳克的浓度。取5微升SYBR Green染料预混液，加入0.1微升分子生物学级水、0.45微升7.5微摩尔的正向引物、0.45微升7.5微摩尔的反向引物以及4微升浓度为每微升1.25纳克的cDNA，混合后总体积为10微升。将样品放入qPCR仪中，按照指定的qPCR条件扩增目标V5标签基因和四环素转录激活因子增强型扩增子，并生成高分辨率熔解曲线，以评估目的扩增子的特异性熔解温度，并确保无非特异性扩增子峰的存在。

这种移液电穿孔技术可实现25%至30%的转染效率，该结果通过荧光显微镜和流式细胞术检测EGFP阳性细胞的比例得出。在治疗期间的任何时间点，以每毫升1微克的浓度处理肺泡上皮细胞，对内源性αENaC mRNA的表达均无显著影响。如本实验所示，采用转录调控的质粒表达系统，可通过四环素反式激活因子的信号对V5标记的αENaC信号进行标准化，从而利用双Δ定量循环法（double delta quantification cycle method）确定转染效率。

在四环素关闭系统存在的情况下，α ENaC mRNA的半衰期比放线菌素D处理时最多短七倍，证实放线菌素D会导致α ENaC mRNA稳定性的假象。此外，环己酰亚胺和肿瘤坏死因子α处理显著降低了该转录本的稳定性，而脂多糖则无此作用。根据3'非翻译区中被删除或保留的不同区域，可诱导V5标记的α ENaC mRNA稳定性发生显著变化。

此外，特定RNA结合蛋白的过表达与转染空载体pcDNA3质粒相比，会降低5-α ENaC mRNA的稳定性。该工具将有助于探究肺泡上皮功能相关关键基因在生理或病理条件下转录后调控的新机制。