用于研究肿瘤-斯特罗马相互作用和药物发现的新型斯特罗姆纤维细胞-模组3D肿瘤球体模型

我们开发了一种新型的3D球体模型，它提供了一个平台，用于研究癌症-频闪相互作用和测试癌症治疗。在我看来，这个3D系统结合了癌细胞在频闪成纤维细胞，以更好地模仿真正的肿瘤条件，因此，可以是一个非常强大的工具，药物发现。此外，该模型不限于研究黑色素瘤。

它可以用来研究其他类型的癌症。演示这个程序的将是我实验室的高级科学家肖红伟博士。对于人类黑色素瘤细胞培养，在传统的粘附细胞培养条件下投掷细胞，在37摄氏度的二氧化碳中完成W489培养。

当细胞达到90%汇合时，以一到五的比例分裂细胞。对于小鼠皮肤成纤维细胞培养，在培养标本之前清洗PBS中收获的组织颗粒，用10%的胎儿牛血清和1%的青霉素链霉素在细胞培养箱中补充。当细胞达到 90% 的汇合时，以一到两的比例分割细胞。

在建立共培养之前，种子成纤维细胞以浓度达到100毫米的培养皿，使细胞汇合在第二天达到约60%。第二天早上，用一到三到五浓度的GP取代上能，用普通培养基的库存稀释的扁病毒，并辅以每毫升多纤维素四微克。将细胞放入细胞培养箱6小时，然后用新鲜培养培养剂替换上一液。

两天后，在荧光显微镜上观察来自细胞的GP信号。当两个细胞培养物被稳定地转染时，从0.25 trypsin-EDTA分离出两个细胞培养物，通过中分收集单细胞悬浮液。以共培养中等浓度每毫升2倍10至4细胞重新悬浮细胞，以1比1的比例混合黑色素瘤细胞和成纤维细胞。

然后看到两毫升的细胞到每个井的24井板和三升每个条件，并放置该板在细胞培养箱4小时，让细胞连接到板底部。对于黑色素瘤细胞独奏培养评估2D细胞簇的形成，见两次10至第四黑色素瘤细胞进入每个孔的24孔板和培养细胞7至10天的细胞培养孵化器。然后根据标准的荧光显微镜在倒置荧光显微镜上拍摄细胞。

如果时间推移成像系统关闭，请至少在成像前一小时将其打开。当系统准备就绪时，小心地将培养板转移到显微镜的舞台上，滑动培养箱并牢固地锁上门。打开时间推移成像系统的软件，点击添加容器选择板型和制造商，使显微镜能够准确地定位扫描区域。

选择 10 倍的客观透镜和感兴趣的孔，并设置扫描区域的参数、扫描之间的间隔时间以及开始和结束时间。然后记录从 4 到 52 小时的时间推移成像。在图像录制结束时，使用时差成像系统软件检索数据并导出收集的视频或图像集。

对于共聚焦显微镜成像，请将板放在倒置荧光显微镜的舞台上，然后选择红色和绿色的激光束。观察5倍或10倍目标下的细胞，然后选择球体开始扫描。使用一微米 z 步进，从球体底部扫描到顶部。

然后使用适当的图像处理软件处理数据，以重建可进一步旋转并保存为 3D 影片的 3D 图像。在这里，显示了由共培养黑色素瘤细胞和成纤维细胞形成的多细胞3D球体的图像。在没有成纤维细胞的情况下培养黑色素瘤细胞不会形成典型的3D球体，尽管一些黑色素瘤细胞形成具有扩展培养的2D簇。

使用时间推移成像，可以观察到成纤维细胞和肿瘤细胞在共培养中相互作用，从球体开始约36小时。在这部电影中，可以观察到单培养黑色素瘤细胞聚集形成的动态过程，从4到52小时的培养。在这里，在培养七天后，共和显微镜可以观察到3D球体结构，而在这部电影中，2D细胞集群可以可视化。

3D球体在培养中保持悬浮状态，并且是移动的，而二D肿瘤细胞簇往往附着在培养板上，并且不动。此 3D 模型是研究肿瘤-频闪相互作用的独特平台。例如，用于阐明细胞间缺口1信号通路活性和癌症相关成纤维细胞如何调节癌症的干细胞和启动细胞和球类形成。

此外，该模型可用于测试癌症干细胞和启动细胞的药物反应。虽然这种方法简单而直接，但注意使用正确的细胞密度和细胞比，并使用适当的培养板，如所证明的。此 3D 模型还可用于用于对癌症干细胞的表型进行筛选关键的细胞内信号通路活性，以及筛选癌症干细胞高度敏感的小分子化合物。