从高致病性H5N1病毒和禽流感病毒中生产含有包络糖蛋白的高蒂特感染性流感伪型颗粒
January 15th, 2020
该协议描述了一个实验过程，以产生高蒂特传染性病毒伪型颗粒（pp），包络糖蛋白从两个流感A毒株，以及如何确定其传染性。该协议具有很强的适应性，可开发具有不同包络糖蛋白的任何其他类型的包络病毒的pps。
这种产生流感病毒PP并确定其感染率的技术可以简化BSL-2城市流感病毒的研究。我们根据 PPS 的 qRT-PCR 数据对感染的 PPS 进行规范化。对两个糖蛋白表达质粒进行编码，可以简化病毒再感染的研究。
细胞播种后一天，在倒置的光显微镜下检查细胞形态和密度。理想情况下，细胞在转染时应大约为85%的汇合。每井用一毫升无血清DMEM代替介质，然后将盘子放回培养箱中。
对于每一个细胞的转染井，稀释8微升的转染试剂到150微升的体积与减少血清介质。轻轻混合溶液，让它在室温下坐五分钟。同时，将2.5微克质粒DNA稀释成158微升的血清介质。
经过5分钟的孵育，将稀释的DNA与稀释的转染试剂混合，轻轻混合溶液，在室温下保持15分钟。将脱氧核糖核酸脂复合物加入到相应的孔中，与无血清介质中的细胞一起加入。然后来回摇晃，轻轻混合盘子。
在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育4至6小时。孵育后，取出介质，每井用两毫升DMEM代替。然后再孵育36至48小时。
每井1万个细胞和96个井板播种每种类型的易感细胞。然后在37摄氏度和5%的二氧化碳孵化器中过夜。在转染后的第三天，检查应浅粉色或微橙色的介质颜色，并在 440 至 460 纳米波长下用倒置荧光生物显微镜检查细胞。
转染后38至48小时，通过0.45微米聚乙烯氟化物滤芯将pseuotype颗粒或PPS通过，将其清除细胞碎片，然后将其分成小体积的等分物，储存在零下80摄氏度。为了量化PPS，将30微升纯化病毒颗粒转移到1.5微升无RNase管中，并加入1微升的苯松酶核酸酶。在37摄氏度下孵育管子一小时，以消除任何DNA和RNA污染。
孵育后，将样品冷冻至零下70摄氏度，以活性核酸酶，并加入两微升蛋白酶K.孵育混合物30分钟，消化包络蛋白并释放CMV-GFP RNA。然后在100摄氏度下使蛋白酶K处于非活性状态3分钟。使用文本手稿中指定的底图和探针中的通用探头一步 RT-qPCR 套件使用定量逆转录RTPCR量化PPS。
将PPS归化为每毫升10至5个RNA拷贝的4倍。然后将TPCK-trypsin加入到含有H7N9下凝素的PPS中，最终浓度为每毫升10微克。在37摄氏度下孵育PPS一小时，形成功能亚单位HA1和HA2。
将规范化的PPS与DMEM介质以一比一的比例混合，然后将含有易感细胞的板带到生物安全柜。吸上一液，用100微升预热PBS洗涤细胞一次。在每个井中加入100微升的PPS-DMEM混合物，将每种PPS的感染性测试三分到一个易感细胞系。
在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育4至6小时。然后吸制上一液，并更换100微升DCM孵化板再孵化24至36小时，然后进行感染检测。我们的结果是PPS现在被认为是传染性的人。
因此，建议采取必要的安全防护程序，如戴口罩和在生物安全柜中进行感染性检测。该协议产生10种类型的伪型颗粒或PPS与两组血凝素和神经氨酸囊性口腔炎病毒G糖蛋白或无包糖蛋白。用透射电子显微镜对PPS进行成像，并在两个细胞系，A549和MDCK中评价了其感染率。
在H5的PPS组，H5N1、H5加N9和H5的感染率在细胞系A549和40%5%和5%的MDCK中分别约为90%18%和10%。在H7的PPS组，H7N9、H7加N1和H7的感染率在细胞系A549和8%4%和1%的MDCK中分别约为10%7%和1%。A549和MDCK细胞的感染性约为21%和16%。
而三角洲包络糖蛋白PP没有表现出感染性。请记住，PP 生产商 HEK-293T/17 细胞构成此程序的基础。因此，最佳生长教我们 HEK-293T/17 细胞是最重要的。
按照此过程或其他一些测试（如 L2）可接受边界测定。这种测定几乎可以消除受体偏好的生物特性，该模式将揭示PPS的tropism。自从他们从流感病毒中克隆出的糖蛋白被克隆成两个加最大值。
HA和NA蛋白可以单独研究，因此我们在它们之间重新分类。突变体和成熟效应可以探索。
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概述
该协议描述了一种使用来自两种流感A病毒株的包膜糖蛋白的方法，用于生产高滴度的感染性病毒伪型颗粒（pp）。它还概述了如何评估其感染性，使其适用于其他包膜病毒。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 传染病
- 病毒遗传学
背景
- 病毒伪型颗粒（pp）的生产对于研究病毒感染性至关重要。
- 该技术可以在BSL-2实验室环境中进行。
- 了解这些颗粒的感染性有助于流感病毒研究。
- 糖蛋白表达质粒用于促进病毒重排研究。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来生成感染性病毒伪型颗粒。
- 使用qRT-PCR数据评估这些颗粒的感染性。
- 提供一个可以适用于其他包膜病毒的协议。
使用的方法
- 在倒置光学显微镜下进行细胞接种和形态评估。
- 用糖蛋白表达质粒转染细胞。
- 用无血清DMEM培养基替换培养基以获得最佳条件。
- 基于qRT-PCR标准化伪型颗粒以进行感染。
主要结果
- 成功生产高滴度的感染性病毒伪型颗粒。
- 通过qRT-PCR分析证明了颗粒的感染性。
- 确认了该协议可以适用于其他包膜病毒。
- 细胞形态和密度适合转染。
结论
- 该协议提供了一种研究流感病毒感染性的简化方法。
- 它允许通过操纵糖蛋白来探索病毒重排。
- 该方法适用于各种包膜病毒，增强了病毒学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables safe, BSL-2-compatible study of highly pathogenic influenza envelope glycoproteins, supporting target validation and mechanistic de-risking in antiviral and vaccine development. By generating infectious pseudotyped particles with H5N1 and H7N9 HA/NA proteins, researchers can assess receptor tropism, neutralizing antibody efficacy, and reassortment potential without handling live virions. The system provides quantitative infectivity readouts via qRT-PCR, facilitating predictive confidence in early-stage therapeutic screening and lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional analysis of HA and NA glycoproteins as therapeutic targets for neutralizing antibody screening.
- Operational Value: Supports reassortment studies by allowing independent variation of HA and NA combinations to predict emergent strain risks.
- Predictive Value: Quantifies infectivity across cell lines (A549, MDCK) to model tropism and cross-species transmission potential.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces normalized, quantifiable pseudotyped particles via RT-qPCR for consistent infectivity testing across experimental conditions.
- Reproducibility: Standardizes particle production and normalization to 4×10⁵ RNA copies/mL, enabling reliable comparison of glycoprotein variants.
- Scalability: Compatible with 96-well formats and triplicate testing, supporting medium-throughput screening of inhibitors or immune sera.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses glycoproteins from zoonotic H5N1 and H7N9 strains to model pandemic-threat viruses in preclinical efficacy studies.
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage glycoprotein characterization with preclinical evaluation of vaccine candidates or entry inhibitors.
- Risk Mitigation: Allows de-risking of antigenic drift or shift variants by testing mismatched HA/NA combinations under controlled conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through glycoprotein functional assays and informing lead identification by quantifying neutralization susceptibility. It enables assay development for antiviral screening by providing a reproducible, BSL-2-safe proxy for viral entry. The workflow integrates with downstream analytics via qRT-PCR quantification and infectivity scoring, enhancing data consistency across discovery and preclinical teams.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on receptor binding, fusion efficiency, and glycoprotein reassortment impacts on infectivity.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable pseudotyped particles for evaluating entry inhibitors or neutralizing antibodies in a high-confidence format.
- Analytics: Generates qRT-PCR-based RNA copy normalization and infectivity percentages, enabling statistical comparison of glycoprotein variants.
- Translational Research: Connects HA/NA functional data to preclinical model selection by defining tropism and cross-reactivity profiles.
- Enterprise Reuse: Platform adaptability allows reuse across enveloped virus studies, reducing redevelopment costs for future pandemic preparedness programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in influenza entry studies by isolating HA and NA contributions to infectivity.
- Operational Value: Enables BSL-2 workflows for high-risk glycoproteins, improving lab safety and throughput.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions on antiviral or vaccine candidates by predicting neutralization escape via reassortment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on quantified infectivity and antibody sensitivity across glycoprotein variants.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection, and biosafety practices for pseudotyped particle handling.
- Dependent on qRT-PCR infrastructure and RNase-free workflows for accurate particle quantification and normalization.
- Necessitates standardization of trypsin activation for H7N9 HA cleavage to ensure functional subunit formation.
- Involves optimization across cell lines (e.g., A549, MDCK) to capture differential tropism of glycoprotein pseudotypes.
- Limited to envelope glycoprotein studies; does not replicate full viral lifecycle or intracellular replication stages.
