在杜氏肌营养不良症患者样本中评估反义寡核苷酸临床试验中外显子跳跃效率

本方案为在临床前研究和临床试验中制备和处理肌肉组织提供了标准化的方法学，这对于在杜氏肌营养不良症（DMD）领域获得可靠结果至关重要。这些技术适用于DMD的外显子跳跃试验，其主要优势在于，若统一实施，这些方法成熟、可靠且可重复。

这些技术主要针对杜氏肌营养不良症（DMD）中的外显子跳跃，但通过更换引物，相同技术也可应用于其他采用剪接疗法治疗的疾病。这些方法可用于评估外显子跳跃在RNA和蛋白质水平上的效率。进行分析前样品的制备时，首先将等体积的黄蓍胶与水混合，直至胶体变软并具有黏性。

将此混合物装入25毫升注射器中，然后将0.5至1厘米的树胶挤出到各个软木圆片上。在圆片的另一侧进行标记，并将一个装有异戊烷的容器置于液氮中，直至部分液体冻结。将每个标本置于圆片的西黄芪胶上，使每块肌肉的长轴垂直于软木。

在每块肌肉底部周围放置胶状物以帮助固定肌肉，然后用镊子将标本置于低温异戊烷中冷冻。持续移动标本约一分钟，或直至完全冻结，之后暂时放置于干冰上。随后，将标本放入玻璃小瓶中，于 -80 摄氏度保存。

为了对冷冻肌肉组织进行切片分析，将冷冻切片机设置为-25摄氏度的工作温度，并将肌肉组织块固定到持样器上。修整组织块，直至获得平整的切面。用于逆转录PCR和蛋白质印迹分析时，获取厚度为10 µm的切片。

进行免疫组织化学分析时，获取六至八微米厚的切片；进行苏木精和伊红染色时，获取十至十二微米厚的切片。切片完成后，将切片放入二毫升离心管中。将用于PCR和蛋白质印迹分析的样品在零下80摄氏度保存。

此处展示了微芯片电泳系统、逆转录PCR反应的凝胶图像，以及在一项剂量递增的一期临床试验中，两名患者在接受反义寡核苷酸治疗前后，跳跃条带的测序结果。这两名患者均携带缺失突变。正如预期，在治疗前，两名患者均未出现跳跃现象，仅能观察到非跳跃条带。

经过12周治疗后，第二位患者的电泳结果中可见清晰的较低位置跳跃条带，然而第一位患者中仍难以检测到任何跳跃产物。测序结果显示，第二位患者为第47与第54号外显子的连接，第一位患者为第44与第54号外显子的连接。为计算跳跃百分比，将跳跃条带的摩尔浓度除以跳跃条带与未跳跃条带的总摩尔浓度。

正如预期，治疗前通过Western blot未检测到肌营养不良蛋白条带。治疗后，第二位患者检测到一条条带，其分子量低于健康对照组中观察到的条带。然而，第一位患者在治疗后未检测到可测水平的肌营养不良蛋白。

正确处理肌肉组织并以一致的方式将每个样本放置在石黄芪胶上至关重要。组织切片可通过多种不同方法进行分析，包括常规 PCR、数字 PCR、Western 印迹、免疫组织化学以及各类组学技术。这些技术可加速开发针对不同外显子的额外外显子跳跃药物，并可用于基于病毒的疗法及针对杜氏肌营养不良症（DMD）的基因编辑疗法的进一步研发。