超结构保存细胞内膜蛋白定位电子显微镜分析的CryoAPEX方法

这种方法结合了膜蛋白染色的能力，同时保留了膜的完整性和亚细胞结构。因此，它对于精确定位膜相关蛋白非常强大。该技术的主要优点是，它结合了使用强大的基因可克隆标签，APEX2，与最先进的方法在细胞保存电子显微镜，包括冷冻修复和冷冻替代。

总之，这些允许在保存完好的细胞内精确定位蛋白质。该协议可用于剖析病毒在宿主细胞内复制的机制。病毒通常会在感染过程中劫持宿主蛋白质。

病毒是小基因组，它们利用这些宿主细胞内部复制。最近，我们已经能够在未发布的数据中，利用这种技术标记这些蛋白质，以了解病毒是如何复制的。这项技术在最近一项有关细菌毒素的合作研究中被证明是非常关键的，这种研究会导致高尔吉分解。

使用低温APEX，我们能够精确定位毒素与碎片的戈尔吉片，这是很难看到，否则使用正常的免疫荧光技术。展示这项技术的将是伊莱恩·米赫尔克，一个研究生，和研究员，斯蒂芬妮·安吉尔，从我们的实验室。在培养皿中播种 HEK293 细胞后，使用 APEX2 标记哺乳动物表达质粒的细胞根据制造商的指示使用转染试剂转染细胞。

转染后12-15小时，用PBS清洗细胞一次。然后，用PBS将细胞从培养皿中洗入15毫升的圆锥管中。以 500 x g 离心五分钟。

小心地去除上流剂，并在室温下在 pH 7.4 下将颗粒重新悬浮在两毫升的 2%谷胱甘肽和 0.1 摩尔钠二甲酸酯缓冲液中。将样品放在冰上孵育30分钟。然后，在 4 摄氏度下以 500 x g 的样品对样品进行 5 分钟。

在4摄氏度下离心，用两毫升0.1摩尔钠二甲酸酯缓冲液将颗粒清洗5分钟。。离心后，取出上经剂。要进行过氧化物酶反应，在 DAB 溶液中重新悬浮三毫升，然后以 500 x g 的颗粒进行 5 分钟，清洗颗粒。

然后，用5.88毫摩尔过氧化氢将颗粒重新悬浮在DAB溶液的三毫升中。在室温下孵育30分钟。颗粒明显变成棕色，表明存在不溶性DAB反应产品。

根据手稿，在DMEM中再次用仙人掌钠缓冲液清洗后，将含有10%胎儿牛血清和15%牛血清白蛋白的DMEM低温保护溶液的500微升中的细胞颗粒重新悬浮。将细胞悬浮液转移到0.5毫升微离心管。再次丸，稍微提高离心机速度从500x g。

丢弃大部分上清液，确保留下足够的液体，使颗粒不会干涸。使用实验室抹布或纸巾的一角，将细胞颗粒中剩余的液体吸走。让足够的液体保持，颗粒形成一个糊状物，在一致性上类似于牙膏。

吸气细胞颗粒的两到三微升，并沉积到膜载体上。完全填充膜托架的孔，使表面张力在顶部产生轻微的圆顶。将膜托架滑入墨盒并固定。

将墨盒放入已准备和加底的 HPF 机器中，然后按开始冻结。使墨盒浸入液氮中，从墨盒中取出膜托架。放入塑料胶囊中，将塑料胶囊放入充满液氮的克里夫。

在化学罩中，在克里维亚尔的丙酮中，用量坦酸和5%DI水制备溶液溶液中0.2%重量的毫升。将它们放入液氮中冻结。将冷冻替代混合物一个小瓶和含有冷冻细胞颗粒的冷冻体放入冷冻替换单元样品室。

将含有膜载体的内胶囊从液氮小瓶转移到包含冷冻替代混合物的相应小瓶中。在 90 摄氏度下启动冻结替换协议。24小时后，暂停冷冻替代，用已冷却到90摄氏度的丙酮洗样品三次，5分钟。

接下来，在化学罩中，制备每样品1毫升的甲氧二氧化氮、0.2%醋酸尿碱和5%DI水，在Cylial中用丙酮进行，并把它们放在液氮中进行冷冻。将冷冻替代混合物中的冷冻液放入冷冻替代单元中，将胶囊从第三丙酮洗涤转移到冷冻替代混合物两瓶中。孵育它们，并在90摄氏度下冷冻22小时，随后在12-18小时内逐渐升温至零摄氏度。

将温度保持在零摄氏度，并将预冷丙酮加入小瓶中，每次清洗三次，每次10分钟。根据制造商的指示，在塑料烧杯中准备选择树脂的树脂混合物，并将 2%4% 和 8% 的树脂加入小瓶中，以浸入胶囊。在零摄氏度下各孵育两小时。

然后，在室温下，在15%30%60%和100%树脂成分的 A、B 和 D 中孵育仅四小时。20小时后，准备树脂成分 A、B、C 和 D 的混合物，孵育 4 小时。将具有细胞颗粒侧的膜载体向上放入扁平嵌入模具中，并填充树脂混合物 A、B、C 和 D。将它们放入烤箱中，在 60 摄氏度下聚合 24-36 小时。

聚合后，从模具中取出块，将样品放在超微原子的垂直夹头中，在那里可以放大图像。将膜载体与块分离，将膜载体上的液氮混合在一起，将金属与塑料分离，并使用剃刀刀片将膜载体周围的树脂切开。分离时，轻轻抬起膜载体，将细胞颗粒圆顶留在块的面上。

将外露细胞颗粒朝上放置到比第一个模具稍深的扁平嵌入模具中，并在 60 摄氏度下填充树脂成分 A、B、C 和 D。使用剃须刀刀片修剪细胞颗粒周围的块。然后将块放在超微原子的切块臂上的样品夹头中。

使用玻璃或金刚石刀，将方块修剪成紧围绕细胞颗粒的梯形形状。使用玻璃或金刚石刀获得 90 纳米超薄的细胞颗粒部分。选取 TEM 网格上的节带。

通过将边缘印在一张滤纸上并将其存储在 TEM 网格存储盒中来干燥网格。将网格安装在 TEM 支架上，然后将支架放入显微镜中。使用 80 千伏的 Tecnai T12 筛选低温APEX样品。

使用 APEX2 标签获取感兴趣的细胞和亚细胞结构的图像。在这项研究中，用传统的APEX方法制备样品，可以明确标记有组织、光滑的内质性内质结构。在高放大率下，堆叠膜出现褶皱，同心膜密度之间存在不均匀的间隙，表明膜保存不良和脂质提取。

CryoAPEX制备的样品也有明确定义的标签，有组织，光滑的内质膜结构，但是，膜是光滑和平行的，很少或没有脂质提取看到。TEM对90纳米薄部分的分析表明，亨廷顿酵母相互作用蛋白E存在于周围内质神经和核包络中。此外，亨廷顿酵母相互作用蛋白E密度被分解成沿发光内质膜的定期空间的foci。

亨廷顿酵母相互作用的蛋白质E分布和foci也可见于用传统固定和脱水制备的样品中。然而，存在广泛的膜破坏和提取，使样品次优。APEX2 标记使用三个细胞标记进行，其中线托-V5-APEX2 仅提供线粒体的特定染色，CAAX-APEX2 仅产生对等离子膜的明显染色。

在细胞内细胞器中未观察到任何标记。戈尔吉流明的染色也评估使用阿尔法 MAN2-APEX2 标记，如我们原来的 Sengupta 等人手稿所述。按照此过程，可以执行三维方法，如电子断层扫描或聚焦离子束扫描电子显微镜，以研究感兴趣的蛋白质的三维分布。

本议定书中使用的许多化学品都是有毒的，因此在使用前应查阅安全数据表，以确保使用适当的个人防护设备处理这些化学品，并按照机构准则进行处置。