Name: 超结构保存细胞内膜蛋白定位电子显微镜分析的CryoAPEX方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: 学习cryoAPEX方法，利用APEX2标签和冷冻固定技术在HEK293细胞中精确定位膜蛋白，同时保存细胞超微结构。该技术对研究病毒复制机制和细胞生物学具有重要价值。

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本方案源自 Sengupta 等人发表于《细胞科学杂志》（Journal of Cell Science）的研究，132 (6), jcs222315 (2019)48。本研究获得了美国国立卫生研究院资助项目 R01GM10092（授予 S.M.）和 AI081077（授予 R.V.S.）、印第安纳临床与转化科学研究所资助项目 CTSI-106564（授予 S.M.）以及普渡大学炎症、免疫与传染病研究所资助项目 PI4D-209263（授予 S.M.）的支持。

1. 细胞培养与转染
<ol>
	<li>将 HEK-293T 细胞接种于直径 60 mm 或更大的组织培养皿中，在 37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中培养至 60%–90% 汇合度。</li>
	<li>使用转染试剂（见材料表），按照生产商说明书将 APEX2 标记的哺乳动物表达质粒转染细胞。</li>
	<li>转染后 12–15 小时，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次，再用 PBS 轻柔冲洗使细胞脱离培养皿。若特定细胞类型需要，可使用胰酶等解离试剂。在 500 x g 条件下离心 5 分钟，形成细胞沉淀。</li>
</ol>
2. 化学固定与过氧化物酶反应
<ol>
	<li>小心移除上清液，并将沉淀物重悬于 2 mL 含 2% 戊二醛（v/v）的 0.1 M 柠檬酸钠缓冲液（pH 7.4）中，室温下操作。将样品置于冰上，孵育 30 分钟。在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，收集沉淀物。从此时起至步骤 2.3.3，所有样品和溶液均需保持在冰上，离心操作也需在 4 °C 下进行。 
	注意：戊二醛和含砷的柠檬酸钠缓冲液均有毒性，操作时应遵循适当的安全规程并佩戴个人防护装备。含有戊二醛和/或柠檬酸钠缓冲液的废液应作为危险化学废物处理。</li>
	<li>用 2 mL 的 0.1 M 柠檬酸钠缓冲液洗涤沉淀物 3 次，每次 5 分钟。在本步骤及后续所有洗涤步骤中，均应轻柔地将细胞沉淀重悬于所需溶液中，然后以 500 × g 离心 5 分钟，小心移除并弃去上清液。重复沉淀和重悬操作时应格外小心，以尽量减少样品损失。</li>
	<li>进行过氧化物酶反应
	<ol>
		<li>配制新鲜溶液：将 1 mg/mL 的 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）溶于 0.1 M 柠檬酸钠缓冲液中。通过剧烈涡旋 5–10 分钟使 DAB 充分溶解。 
		注意：DAB 具有毒性且为潜在致癌物，操作时应采取适当的安全措施并佩戴个人防护装备。含 DAB 的溶液应作为危险化学废物处理。</li>
		<li>将沉淀物用 3 mL DAB 溶液重悬，随后以 500 × g 离心 5 分钟，收集沉淀。</li>
		<li>将沉淀物重悬于 3 mL DAB 溶液中，并加入过氧化氢，使其终浓度达到 5.88 mM。室温孵育 30 分钟。沉淀物会明显变为棕色，表明不溶性的 DAB 反应产物已生成。 
		注：DAB 孵育时间可能需要根据每种样品进行优化。可在光学显微镜下监测颜色变化。根据我们的经验，大多数蛋白的孵育时间为 15–45 分钟即可。过氧化氢应使用新开封的瓶装试剂，或使用后密封保存良好的试剂。</li>
		<li>离心收集细胞，随后用 0.1 M 柠檬酸钠缓冲液洗涤 2 次，每次 5 分钟，再用 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）或所选细胞培养基洗涤一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 500 µL 含 10% 胎牛血清和 15% 牛血清白蛋白的 DMEM（或其他所选细胞培养基）冷冻保护液中。再次离心收集沉淀，若在较黏稠的冷冻保护液中难以形成沉淀，可适当提高离心速度（略高于 500 × g）。弃去大部分上清液，确保留有足够液体以防止沉淀干燥。将细胞沉淀转移至高压冷冻仪中。</li>
</ol>
3. 高压冷冻
<ol>
	<li>用液氮（LN₂）填充高压冷冻机的储液罐2）并启动泵，用液氮填充样品室2. 
	警告：使用液氮时，应遵循适当的安全操作规程并佩戴个人防护装备。 
	注意：这些步骤专用于 Leica EMPACT2 高压冷冻仪。</li>
	<li>用实验室擦拭纸或纸巾的一角吸去细胞沉淀中残留的液体。应保留足够液体，使沉淀物形成类似牙膏质地的糊状物，其稠度应足以被吸入20 µL移液器吸头中。</li>
	<li>吸弃2–3 µL细胞沉淀，将其转移至膜载体上。充分填充膜载体的孔，使液面张力在顶部形成轻微凸面，但液体不溢出孔外。液体中不得含有气泡。</li>
	<li>将膜载体滑入样品盒并固定。将样品盒放入已准备并预冷的高压冷冻仪中，然后按压 开始 冷冻。</li>
	<li>检查温度随时间变化和压力随时间变化的曲线图，以确认压力在200 ms内达到2100 bar，温度在200 ms内达到-196 °C，并且在600 ms的测量期间内这两个参数均保持稳定。</li>
	<li>重复步骤 3.3 至 3.5，直至用完细胞沉淀或冻存所需数量的样品。</li>
	<li>保持 cartridges 浸没在 LN 中2，从每个卡盒中取出膜载体，放入塑料胶囊中，再将塑料胶囊置于装满液氮的冻存管中2. 
	注意：此处可暂停本方案。含有样品的冻存管可保存在液氮中2 液氮罐中的冻存管或冻存盒。</li>
</ol>
4. 冷冻置换
警告：使用液氮时，必须遵守适当的安全操作规程并佩戴个人防护装备。此外，步骤4中使用的多种化学试剂具有毒性，包括单宁酸、四氧化锇和醋酸铀酰。这些化学品必须按照适当的安全规程进行操作，并作为危险化学废物进行处置。
<ol>
	<li>向自动冷冻置换仪中加入液氮（LN2），并将温度升至 -90 °C。</li>
	<li>配制冷冻置换液1（FS Mix 1）并开始冷冻置换过程。
	<ol>
		<li>在化学通风橱中，配制含0.2%单宁酸（w/v）和5%去离子水的丙酮溶液，并将1 mL分装至每个样品的冻存管中。放入液氮（LN2）中速冻。</li>
		<li>将装有FS Mix 1的冻存管以及含有冷冻细胞沉淀的冻存管放入冷冻置换仪的样品室中。将内含膜载体的内层胶囊从液氮（LN2）冻存管中转移至对应的含有FS Mix 1的冻存管中。</li>
		<li>启动冷冻置换程序，第一步设定为在-90°C下持续24小时。24小时后暂停冷冻置换程序，并用预冷至-90°C的丙酮洗涤样品3次，每次5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制冷冻置换液2（FS Mix 2）并完成冷冻置换过程 
	警告：四氧化锇为高毒性且具有强氧化性的化学品，仅可由受过培训的人员按照既定安全规程操作。必须遵守含锇溶液的储存与处置规程，并对使用四氧化锇的实验区域进行明确标识。四氧化锇应在化学通风橱中操作，佩戴个人防护装备，包括护目镜、可完全覆盖手臂的实验服、双层腈手套，以及可选的呼吸器。
	<ol>
		<li>在化学通风橱中，配制含1%四氧化锇、0.2%醋酸铀酰和5%去离子水的丙酮溶液。将1 mL分装至每个样品的冻存管中，并放入液氮（LN2）中速冻。 
		注：可预先配制单宁酸（10% w/v，丙酮溶液）、四氧化锇（10% w/v，丙酮溶液）和醋酸铀酰（8% w/v，甲醇溶液）的储备液，分装于冻存管中，并储存在液氮（LN2）杜瓦瓶内，以便后续配制冷冻置换液时使用。</li>
		<li>将装有FS Mix 2的冻存管放入冷冻置换仪中，将经过第三次丙酮洗涤的胶囊转移至FS Mix 2冻存管中。在-90°C下孵育72小时，随后在12–18小时内逐步升温至0°C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保持温度在0°C，使用新开封瓶装的预冷丙酮洗涤3次，每次30分钟。</li>
</ol>
5. 树脂渗透与包埋
警告：此处使用的树脂（见材料表）在聚合前具有毒性，应按照适当的安全操作规程并佩戴个人防护装备进行操作。任何未聚合的树脂均应作为危险化学废物处理。
<ol>
	<li>使用新开瓶的丙酮溶解树脂，将样品依次浸入浓度递增的树脂溶液中。按照生产商说明，在塑料烧杯中配制树脂组分A、B和D的混合液，并将样品依次在0 °C下于2%、4%和8%树脂溶液中各孵育2小时。随后在室温下依次于15%、30%、60%、90%和100%树脂溶液中各孵育4小时。最后在组分A、B、C和D的混合液中孵育4小时。</li>
	<li>将细胞沉淀面朝上的膜载体放入平整的包埋模具中，并用树脂（A、B、C和D）填充。此时可在孔中加入纸质样品标签。</li>
	<li>在60 °C烘箱中聚合24–36小时。 
	注意：聚合完成后可暂停实验流程。</li>
	<li>从模具中取出包埋块并使其冷却。去除膜载体时，先将样品置于超薄切片机的垂直夹具中，并在放大条件下观察。通过在膜载体上滴加液氮使金属与塑料分离，同时用剃刀片剔除膜载体周围的树脂，结合两种方法将膜载体与包埋块分离。分离后，轻轻移开膜载体，使细胞沉淀形成的穹顶结构保留在包埋块表面。</li>
	<li>将暴露细胞沉淀面朝上的包埋块放入略深于前次所用的平整包埋模具中，并填充树脂。在60 °C下聚合24–36小时。 
	注意：聚合完成后可再次暂停实验流程。</li>
</ol>
6. 切片
<ol>
	<li>使用剃刀在细胞沉淀周围修整包埋块。然后将包埋块安装在超薄切片机切片臂的样品夹上。使用玻璃刀或钻石刀将包埋块修成紧贴细胞沉淀的梯形。</li>
	<li>使用玻璃刀或钻石刀对细胞沉淀进行90 nm的超薄切片。</li>
	<li>将切片条带捞取到透射电镜（TEM）载网上。带有Formvar膜的铜质槽型载网（1 × 2 mm2 槽）适用于连续切片的成像。用滤纸边缘轻触载网边缘以吸干液体，并将载网存放于透射电镜载网储存盒中。 
	注意：切片完成后可暂停本实验流程。</li>
</ol>
7. 透射电子显微镜成像
<ol>
	<li>将载网安装到透射电镜（TEM）样品 holder 上，并放入显微镜中。我们常规使用 Tecnai T12 在 80 kV 条件下对冷冻 APEX 样品进行筛选。采集具有 APEX2 标记的细胞及感兴趣亚细胞结构的图像。</li>
	<li>如需增强膜结构的对比度，可采用铅后染色法。参见 图2 中未进行后染色的样品（图2I–K）与铅后染色样品（图2A–H）的对比。
	<ol>
		<li>将干燥的载网切面朝下漂浮于一滴稀释的氯化钠溶液（约 1.5 mM）中，每次 1 分钟，重复 2 次，随后再漂浮 10 分钟。</li>
		<li>将载网漂浮于一滴 Sato 铅染液中 1 分钟。随后在氯化钠溶液中漂洗 3 次，每次 1 分钟；再在去离子水中漂洗 3 次，每次 1 分钟。用滤纸吸去载网上的多余液体，并将其存放于载网盒中。 
		注意：铅为有毒化学品，操作时应遵循适当的安全规程并佩戴个人防护装备。含铅溶液应作为危险化学废物妥善处置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在透射电镜下对后染色样品进行成像。 
	备注：在传统的透射电镜样品制备流程中，铅对比染色步骤通常在电镜成像前完成。但对于 cryoAPEX 样品，建议首先对未染色样品进行成像。此举可确保标记物产生的强对比信号能够从染色较浅的细胞结构背景中被清晰识别。对于许多样品而言，可能无需进一步染色；但若需要增强膜结构的对比度，则可进行铅后染色（步骤 7.2），并对样品重新成像。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍的冷冻APEX技术提供了一种在细胞环境中表征膜蛋白定位的可靠方法。该方法不仅利用基因编码的APEX2标签实现对目标蛋白的精确定位，还通过冷冻固定和低温脱水技术，实现了对周围细胞超微结构的优良保存与染色。综合而言，这些技术结合成为在亚细胞背景下高精度定位蛋白的有力工具。
该方法进步的关键在于，传统透射电镜（TEM）制备过程中超微结构的损失主要源于脱水步骤，而非固定步骤40。此前人们认为，基于过氧化物酶的方法与高压冷冻/冷冻替代（HPF/FS）技术不兼容，因为过氧化物酶反应前需要进行化学固定。为克服这一限制，近期开发出一种名为CryoCHEM的方案，该方案首先对样品进行冷冻固定，随后进行再水化并实施过氧化物酶反应49。该方法在显著改善样品染色和结构保存的同时，实现了优异的靶标定位效果。该技术已被证明适用于组织样品，以及需要进行荧光显微镜与电子显微镜关联成像的情况。与CryoCHEM并行发展的是我们的方法，该方法将戊二醛固定与高压冷冻和冷冻替代技术相结合。CryoAPEX提供了一种简化...

生物学研究通常涉及解析蛋白质在细胞和细胞器内的亚细胞定位问题。免疫荧光显微镜可提供蛋白质定位的低分辨率图像，而近年来超分辨率成像技术的进步正在不断突破荧光标记蛋白质的分辨率极限1,2,3。然而，电子显微镜（EM）仍是成像细胞超微结构的高分辨率“金标准”，尽管蛋白质标记仍具挑战性。
历史上，多种电子显微镜（EM）方法已被用于研究蛋白质的超微结构定位问题。其中最常用的方法之一是免疫电子显微镜技术（IEM），该技术利用抗原特异性的初级抗体来检测目标蛋白。EM信号通过使用与电子致密颗粒结合的二抗产生，最常见的是胶体金4,5。 alternatively，也可使用与酶（如辣根过氧化物酶，HRP）偶联的抗体来生成电子致密沉淀6,7,8。IEM主要有两种方法，称为包埋前标记和包埋后标记。在包埋前IEM中，抗体直接引入细胞，这需要轻微固定并通透细胞9,10,11。这两个步骤均可能损伤超微结构12,13。近年来开发出由抗体Fab片段与1.4 nm纳米金结合而成的更小抗体，使得可采用非常温和的通透条件；然而，纳米金颗粒过小，无法在透射电镜（TEM）下直接观察，需额外的增强步骤才能显影14,15,16。在包埋后IEM中，抗体应用于已通过固定、脱水和树脂包埋完全处理的细胞超薄切片上17。尽管该方法避免了通透步骤，但在整个样品制备过程中保持目标表位的完整性仍具挑战性18,19,20。Tokuyasu方法采用轻度固定后进行冷冻、冷冻切片及抗体检测，可显著改善表位保存效果21,22。然而，冷冻超薄切片技术操作要求高，且细胞内对比度欠佳，是其存在的缺点23。
使用基因编码标签可消除免疫电镜（IEM）中与目标蛋白检测相关的诸多困难。目前已有多种标签可供选择，包括 HRP、铁蛋白（ferritin）、ReAsH、miniSOG 和金属硫蛋白（metallothionein）24,25,26,27,28,29,30,31,32。这些标签相较于传统方法各有优势，但也存在限制其广泛应用的缺点。例如，HRP 在细胞质中无活性、铁蛋白标签体积过大、ReAsH 对光敏感，以及金属硫蛋白体积小且难以与细胞染色兼容。最近，一种源自抗坏血酸过氧化物酶的蛋白被开发为电镜标签，命名为 APEX233,34。作为一种过氧化物酶，APEX2 可催化 3,3' 二氨基联苯胺（DAB）的氧化反应，生成一种能与四氧化锇反应的沉淀物，从而在目标蛋白周围产生局部电镜对比度，且扩散范围极小（小于 25 nm）33,35。与传统的基于 HRP 的方法不同，APEX2 极其稳定，并可在所有细胞区室中保持活性33。样品可采用传统的电镜染色方法进行透射电镜（TEM）制样，从而实现对周围结构的良好观察33,34,36。由于其体积小、稳定性高且用途广泛，APEX2 已成为具有巨大潜力的电镜标签。
上述讨论的许多方法目前尚无法或尚未与最先进的超微结构保存技术——高压冷冻（HPF）和低温冷冻置换——相结合。因此，这些方法存在膜结构保存不佳和/或细胞染色不足的问题，从而难以准确确定蛋白质的定位。这必然限制了所获得数据的分辨率和解释能力。高压冷冻（HPF）通过在高压（约2,100 bar）下将样品迅速浸入液氮中实现快速冷冻，使水样形成玻璃化而非结晶化，从而将近乎天然状态保存细胞37,38,39。随后进行冷冻置换（FS），即在低温（-90 °C）条件下用丙酮进行脱水，并同时孵育常规电镜染色剂，如四氧化锇和醋酸铀酰。相较于传统的化学固定（过程较长且易产生假象）以及室温或冰上进行的酒精脱水（可能导致脂质和糖类被提取），HPF与FS联用具有明显优势，因此将其与最优的电镜蛋白标记技术结合尤为理想。
HPF/FS 未与 APEX2 标记结合使用的一个原因是，过氧化物酶反应需要进行轻度化学固定，而这会限制 DAB 反应产物的扩散。迄今为止，在 APEX2 研究中，固定和过氧化物酶反应之后通常采用传统的电镜方法进行染色和乙醇脱水33,36。然而，已有研究表明，化学固定后采用 HPF/FS 处理，在超微结构保存方面明显优于单独使用传统化学固定和乙醇脱水的方法40。传统透射电镜样品中观察到的超微结构完整性丧失，似乎与脱水过程的关系比与固定过程更密切；脱水通常在室温或冰上使用乙醇进行，可能导致脂质和糖类的抽提40,41。为了建立 cryoAPEX 方法，我们提出假设：在化学固定和过氧化物酶反应之后进行 HPF 和 FS 处理，可在超微结构保存方面获得最佳效果。
本文介绍了cryoAPEX实验方案，该方法结合了APEX2标记技术与冷冻固定及冷冻置换方法（图1）。该简易流程包括转染带有APEX2标签的目的蛋白、细胞化学固定以及过氧化物酶反应。随后进行高压冷冻（HPF）和冷冻置换（FS），接着进行常规树脂包埋和超薄切片。透射电子显微镜（TEM）成像结果显示，该方法可极好地保存细胞超微结构。此外，还观察到内质网（ER）腔内蛋白的高分辨率亚细胞定位及其空间分布。该方法广泛适用于在电子显微镜分析中检测细胞内膜蛋白的定位。在我们的实验中，该方法已成功应用于多种体外培养的细胞系，包括HEK-293T（人胚胎肾细胞）、HeLa（人宫颈癌细胞）、Cos7（非洲绿猴肾成纤维细胞）和BHK（幼仓鼠肾细胞）。下文以HEK-293T细胞为例，详细描述实验步骤。

<table><tbody><tr><td>3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637-1G</td><td></td></tr><tr><td>丙酮（玻璃蒸馏）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>烧杯；塑料，一次性，120 cc</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>60952</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>冷冻储存管，2 mL</td><td>VWR</td><td>82050-168</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka，单组分 A，M 型环氧树脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44611-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka，单组分 B，固化剂 964</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44612-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka，单组分 C，促进剂 960（DY 060）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44613-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka，单组分 D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44614-100ML</td><td></td></tr><tr><td>包埋模具，标准平面型，14 mm × 5 mm × 6 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>包埋模具，标准平面型，14 mm × 5 mm × 4 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70900</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清；Nu-Serum IV 生长培养基添加剂</td><td>Corning</td><td>355104</td><td></td></tr><tr><td>玻璃刀舟，6.4 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71008</td><td></td></tr><tr><td>玻璃刀制备仪</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM KMR3</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛 10% 水溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>配备快速转移系统的高压冷冻仪</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM PACT2</td><td>已归档产品，已被 Leica EM ICE 取代</td></tr><tr><td>过氧化氢 30% 溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-266-27</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 转染试剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>EM PACT2 膜载体，1.5 mm × 0.1 mm</td><td>Mager Scientific</td><td>16707898</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇，晶体</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）20X，超纯级</td><td>VWR</td><td>97062-950</td><td></td></tr><tr><td>AFS/AFS2 用塑料胶囊，5 mm × 15 mm</td><td>Mager Scientific</td><td>16702738</td><td></td></tr><tr><td>载网（Slot grids），2 × 1 mm 铜网，带 Formvar 支持膜</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FF2010-Cu</td><td></td></tr><tr><td>二甲胂酸钠缓冲液，0.2 M，pH 7.4</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>102090-962</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠，颗粒，500 g（ACS 级）</td><td>Avantor Macron Fine Chemicals</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr><td>单宁酸</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>21710</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿，聚苯乙烯，无菌，Corning，100 mm</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>超薄玻璃刀条</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰二水合物</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

用于超微结构完整细胞中膜蛋白定位电子显微镜分析的cryoapex方法

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

信号转导和膜运输等关键细胞事件依赖于蛋白质在细胞区室中的正确定位。因此，了解蛋白质精确的亚细胞定位对于回答许多生物学问题至关重要。长期以来，寻找一种能够有效标记蛋白质定位、同时实现良好细胞保存和染色的可靠标记方法一直具有挑战性。近年来，电子显微镜（EM）成像技术的进步推动了多种方法和策略的发展，以提高细胞结构的保存效果并标记目标蛋白质。一种相对较新的基于过氧化物酶的遗传标签 APEX2，已成为可克隆的电子显微镜活性标签中的领先技术。与此同时，透射电子显微镜（TEM）样品制备技术近年来也取得了进展，尤其是通过高压冷冻（HPF）实现的冷冻固定，以及通过冷冻置换（FS）实现的低温脱水与染色。HPF 和 FS 能够为 TEM 成像提供优异的细胞超微结构保存效果，其质量仅次于对玻璃态样品的直接冷冻成像。本文介绍了一种名为 cryoAPEX 的实验方案，该方法结合了 APEX2 标签与 HPF 和 FS 技术。在此方案中，目标蛋白质首先被标记 APEX2，随后进行化学固定和过氧化物酶反应。与传统的室温染色和酒精脱水不同，样品通过冷冻固定，并在低温下经由冷冻置换完成脱水和染色。利用 cryoAPEX 方法，不仅可以在亚细胞区室中识别目标蛋白质，还能在结构完整保留的膜系统内解析其拓扑信息。我们证明，该方法具有足够高的分辨率，能够解析蛋白质在细胞器腔内的分布模式，并区分某一细胞器内蛋白质的区室化定位，即使该细胞器邻近其他未标记的细胞器。此外，cryoAPEX 操作流程简便，适用于培养在组织培养条件下的细胞，其技术难度不高于常规的冷冻固定与冷冻置换方法。cryoAPEX 可广泛应用于任何可通过基因标记的膜蛋白的 TEM 分析。

为了比较使用冷冻APEX（cryoAPEX）方法与传统固定和脱水方法在超微结构保存方面的效果，我们制备了样品，其中内质网膜（ERM；ER membrane）肽段被标记上APEX2，并转染至HEK-293T细胞中。ERM-APEX2定位于内质网的胞质面，并将内质网结构重塑为形态上独特的结构，称为有序光滑内质网（organized smooth ER, OSER）34,42,43。OSER的形态包含光滑、平行且紧密堆叠的膜区域，是用于比较超微结构保存效果的理想区域。采用传统APEX方法制备的样品中，OSER结构显示出清晰的标记信号（图2A–D）。在高倍镜下观察时，堆叠的膜呈现皱褶状，同心膜密度之间存在不均匀的间隙，表明膜结构保存不良并发生了脂质提取（图2D）。而通过cry...

本方案描述了冷冻APEX（cryoAPEX）方法，该方法可在超微结构得到最佳保存的细胞内，通过透射电子显微镜对带有APEX2标签的膜蛋白进行定位。

用于超微结构完整细胞中膜蛋白定位电子显微镜分析的CryoAPEX方法

关键的细胞事件，如信号转导和膜运输，依赖于蛋白质在细胞区室中的正确定位。理解精确的……

该方法能够对膜蛋白进行染色，同时保持膜的完整性和亚细胞结构，因此在精确定位膜相关蛋白方面具有很强的优势。该技术的主要优点在于，它将一种稳定且可遗传克隆的标签 APEX2 与最先进的细胞保存电镜技术（包括冷冻固定和冷冻置换）相结合。上述方法可实现对保存完好的细胞内蛋白质精确定位。该方案可用于解析病毒在宿主细胞内复制的机制。在感染过程中，病毒常会劫持宿主蛋白以协助自身增殖。病毒拥有较小的基因组，它们利用这些基因组在宿主细胞内进行复制。最近，我们通过尚未发表的数据，利用该技术对这些蛋白质进行标记，以了解病毒的复制机制。该技术在最近一项关于导致高尔基体破裂的细菌毒素的协作研究中发挥了关键作用。通过使用cryoAPEX技术，我们能够精确定位毒素与高尔基体碎片之间的关系，而这一点若使用常规免疫荧光技术则极难观察到。本实验技术将由本实验室的研究生艾莉诺·米赫尔克（Elaine Mihelc）和研究助理斯蒂芬妮·安吉尔（Stephanie Angel）进行演示。在培养皿中接种HEK293细胞后，按照制造商的说明，使用转染试剂将APEX2标记的哺乳动物表达质粒转染至细胞中。转染后12-15小时，用PBS洗涤细胞一次。然后用PBS将细胞从培养皿中冲洗至15毫升锥形管中。在500 × g条件下离心5分钟。小心吸去上清液，并将沉淀重悬于 2 毫升含 2% 戊二醛和 0.1 摩尔/升二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）的溶液中，室温下进行。将样品置于冰上孵育 30 分钟。随后，在 4 摄氏度下以 500 × g 离心 5 分钟，收集沉淀。将沉淀物用2毫升0.1摩尔的卡考基酸钠缓冲液在4摄氏度下离心，每次5分钟，共洗涤3次。离心后，弃去上清液。为进行过氧化物酶反应，将沉淀物重新悬浮于3毫升DAB溶液中，洗涤后在500 × g离心5分钟，形成沉淀。然后，将沉淀重悬于3毫升含5.88毫摩尔过氧化氢的DAB溶液中。室温孵育30分钟。沉淀物明显变为棕色，表明存在不溶性DAB反应产物。根据文稿要求，用DMEM中的二甲基砷酸钠缓冲液再次洗涤后，将细胞沉淀重悬于500 µL含有10%胎牛血清和15%牛血清白蛋白的DMEM冷冻保护剂溶液中。将细胞悬液转移至0.5 mL微量离心管中。再次离心收集沉淀，离心速度略高于500 × g。弃去大部分上清液，确保留下足够的液体，以免沉淀干燥。使用实验室擦拭纸或纸巾的一角吸去细胞沉淀中残留的液体。保留足够液体，使沉淀形成类似牙膏状的糊状物。吸取两到三微升细胞沉淀，将其滴加到膜载体上。将膜载体的孔完全填满，使表面张力在顶部形成轻微的穹顶状。将膜载体推入卡盒中，并固定好。将样品盒放入已准备并预冷的高压冷冻仪中，按下启动键进行冷冻。保持样品盒浸没在液氮中，将膜载体从样品盒中取出，放入塑料胶囊内，再将塑料胶囊置于装满液氮的冻存管中。在化学通风橱中，于 Cryovial 管中为每个样品配制一毫升溶液，该溶液由 0.2%（重量/体积）单宁酸和 5% 去离子水溶于丙酮中组成。将其置于液氮中冷冻。将冻 substitution 混合液分装至一个离心管中，并将含有冷冻细胞沉淀的 Cryovial 管一同放入冷冻置换装置的样品室中。将含有膜载体的内层胶囊从液氮小瓶转移至含有冻置换混合液一的相应小瓶中。在90摄氏度下启动冻置换程序。24小时后，暂停冻置换，用已冷却至90摄氏度的丙酮洗涤样品三次，每次五分钟。接下来，在通风橱中，于 Cryovial 管中为每个样品配制 1 毫升固定液，其中含 1% 四氧化锇、0.2% 醋酸铀酰，并用 5% 去离子水溶解于丙酮中，随后将其置于液氮中冷冻。将含有冻替溶液二的 Cryovial 管放入冷冻置换仪中，并将第三次丙酮清洗后的胶囊转移至冻替溶液二的管中。在 -90°C 下孵育 72 小时，随后在 12–18 小时内逐步升温至 0°C。将温度保持在 0 °C，加入预冷的丙酮清洗离心管，每次 10 分钟，共清洗三次。根据生产商说明，在塑料烧杯中配制所需树脂混合液，并将 2%、4% 和 8% 的树脂分别加入离心管中以浸没胶囊。在 0 °C 下每次孵育两小时，共孵育三次。然后，在室温下分别用仅含A、B和D组分的15%、30%、60%、90%和100%树脂溶液各孵育4小时。20小时后，配制含有树脂组分A、B、C和D的混合液，并孵育4小时。将细胞沉淀面朝上的膜载体放入平底包埋模具中，并用A、B、C和D树脂混合液填充。将模具置于烘箱中，在60°C下聚合24–36小时。聚合完成后，将样品块从模具中取出，并将其置于超薄切片机的垂直卡盘中，以便在放大条件下进行观察。通过在膜载体上滴加液氮使金属与塑料分离，同时使用剃刀刀片剔除膜载体周围的树脂，从而将膜载体与样品块分离。分离后，轻轻移去膜载体，使细胞沉淀物的穹顶状结构保留在样品块表面。将细胞沉淀面朝上的包埋块放入一个比第一个包埋模具稍深的平底包埋模具中，并加入树脂组分 A、B、C 和 D。在 60 摄氏度下聚合 24–36 小时。使用剃刀片在细胞沉淀周围修块。然后将包埋块置于超薄切片机切片臂的样品夹中。使用玻璃刀或金刚石刀将包埋块修成梯形，紧密包围细胞团块。用玻璃刀或金刚石刀获取细胞团块的90纳米超薄切片。将切片条带捞于透射电镜载网上。用滤纸轻轻蘸去载网边缘的液体以干燥载网，并将其存放在透射电镜载网储存盒中。将载网安装到透射电镜样品 holder 上，并将 holder 放入显微镜中。使用 Tecnai T12 于 80 千伏电压下对 cryoAPEX 样品进行筛选。利用 APEX2 标记获取目标细胞及亚细胞结构的图像。本研究中，采用传统 APEX 方法制备样本，可清晰标记出有序的光滑内质网结构。在高倍放大下，堆叠的膜结构呈现褶皱状，同心膜密度之间存在不均匀的间隙，表明膜结构保存不良以及脂质被提取。通过cryoAPEX制备的样品也显示出对有序、光滑的内质网结构具有清晰明确的标记，但膜结构平滑且呈平行排列，几乎未见脂质提取现象。对90纳米超薄切片的透射电子显微镜（TEM）分析显示，亨廷顿酵母相互作用蛋白E存在于周边内质网以及核膜中。此外，该蛋白的密度在内质网腔侧膜上呈现出规律分布的焦点结构。在使用传统固定和脱水方法制备的样品中，也可观察到亨廷顿酵母相互作用蛋白E的分布和焦点结构。然而，该样品存在广泛的膜结构破坏和成分提取，导致其质量欠佳。APEX2标记实验使用了三种细胞标记物，其中mito-V5-APEX2仅对线粒体产生特异性染色，而CAAX-APEX2仅对质膜产生清晰的染色。在细胞内细胞器中未观察到标记信号。高尔基体腔的染色也如我们先前的Sengupta等论文所述，使用Alpha MAN2-APEX2标记物进行评估。通过该方法处理后，可进一步开展三维成像技术，如电子断层扫描或聚焦离子束扫描电子显微镜，以研究目标蛋白的三维分布情况。本方案中使用的多种化学试剂具有毒性，因此在使用前应查阅安全数据表，确保采用适当的个人防护装备操作这些化学品，并根据机构规定进行处置。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

超结构保存细胞内膜蛋白定位电子显微镜分析的CryoAPEX方法

来源：Schönherr, S., 等. 结合光遗传学与冰冻断裂复型免疫标记技术研究小鼠杏仁核中谷氨酸受体的输入特异性分布。 J. Vis. Exp.

小鼠脑组织冰冻断裂标本中神经元膜蛋白的免疫标记

为了保存神经元结构以进行超微结构分析，我们描述了一种将原代神经元接种于透射电镜载网后进行瞬时冷冻的实验方案，从而获得悬浮于玻璃态冰层中的样品。这些样品可用于冷冻电子显微镜观察，以在纳米尺度上可视化细胞结构。...

利用冷冻电子断层扫描技术观察处于冷冻水合状态神经突的原代神经元制备

本文介绍了一种研究冷冻断裂植物组织的方法。将高压冷冻的叶片样品进行冷冻断裂并双层镀膜，获得保存良好的冷冻水合样品，随后使用冷冻扫描电子显微镜在高倍率下成像，且电子束损伤最小。...

通过冷冻断裂叶片组织的低温扫描电子显微镜研究光合膜的超分子结构

关键词：光合膜，超分子结构，冷冻断裂，叶片组织，低温扫描电子显微镜

本文描述了一种简便且低成本的冷冻固定方法，用于通过透射电子显微镜观察悬浮细胞。...

冷冻蚀刻：用于透射电子显微镜下悬浮细胞超微结构与免疫定位研究的工具

本文提供了一种简便、低成本且省时的化学固定方法，使用丙烯醛固定剂固定灵长类动物脑组织，可实现长期保存，并适用于透射电子显微镜所需的包埋前免疫组织化学分析。...

非人灵长类动物脑组织的制备用于包埋前免疫组织化学与电子显微镜观察

我们开发了一种电子显微镜下的新方法， "闪光与冷冻，"...

闪光-冷冻：一种利用电子显微镜捕捉膜动态的新型技术

采用相关联的光镜与电镜显微技术（CLEM），通过电子显微镜（EM）对先前经光镜（LM）筛选出的细胞中病毒诱导产生的细胞内结构进行成像。将光镜与电镜结合为一种混合成像方法，以实现对病毒与宿主相互作用的整合性观察。...

用于追踪和成像冷冻固定细胞中病毒蛋白相关结构的关联光镜与电镜技术

本文介绍了一种用于标记哺乳动物细胞膜蛋白并对样品进行石墨烯包覆以进行液相扫描透射电子显微镜观察的实验方案。该方案还可用于研究样品对辐射损伤的稳定性。...

用于液相电子显微镜的化学固定哺乳动物细胞石墨烯封装

本实验方案展示了如何利用冷冻结构光照明显微镜对生物冷冻保存样品进行成像。我们通过成像U2OS细胞的细胞骨架来演示该方法。...

冷冻保存细胞的冷冻结构光照显微镜数据采集

本实验方案的目的是引导细胞在冷冻电子显微镜用载网上特定区域进行黏附和生长。该目标通过以下步骤实现：首先涂覆抗污染层，然后按照用户指定的图案进行消融，接着在图案化区域沉积细胞外基质蛋白，最后接种细胞。...

微图案化透射电子显微镜载网以在全细胞冷冻电子断层成像工作流程中引导细胞定位

该工作流程利用低温三重共定位成像平台，能够针对尺寸微小（轴向尺寸&lt;1...

使用低温荧光、电子与离子束联用显微镜对细胞进行靶向切割的工作流程

学习cryoAPEX方法，利用APEX2标签和冷冻固定技术在HEK293细胞中精确定位膜蛋白，同时保存细胞超微结构。该技术对研究病毒复制机制和细胞生物学具有重要价值。

用于超微结构完整细胞中膜蛋白定位电子显微镜分析的CryoAPEX方法

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