Name: 金属浸出在固定金属亲和力色谱中的定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: 学习使用羟基萘酚蓝和紫外可见分光光度法定量检测固定金属亲和力色谱样品中的金属污染。该方法操作简便，适用于常规生化实验室快速评估样品纯度。

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本材料基于美国国家科学基金会（项目编号 MCB-1817448）资助以及托马斯·F·和凯特·米勒·杰弗里斯纪念信托基金、美国银行（受托人）和指定捐赠人黑兹尔·索普·卡曼与乔治·盖·卡曼信托基金的奖项支持。

1. 检测组分的制备
<ol>
	<li>使用280 nm处的光吸收或其他蛋白质定量方法确定需进行检测的层析组分，以识别富含蛋白质的组分。 
	注意：本研究中使用了二极管阵列紫外-可见分光光度计。为提高通量，也可使用能够测定紫外-可见吸收的酶标仪。</li>
	<li>检测所需组分的准备
	<ol>
		<li>配制或获取10–100 mM、pH在7至12之间的缓冲液（“样品缓冲液”）。 
		注意：中性或碱性pH条件下的常见生化缓冲液，如Tris、HEPES、MOPS和磷酸盐缓冲液，均适用于本检测。Tricine和组氨酸也可使用，但由于它们对金属离子有较强的螯合作用，需单独绘制标准曲线。组氨酸校准示例见参考文献20。</li>
		<li>使用每毫升储备液加入120 mg HNB试剂的方法，在样品缓冲液中配制12% w/v（20倍浓缩）的羟基萘酚蓝（HNB）分散液。 
		警告：HNB接触眼睛可造成严重损伤和刺激。操作HNB时应佩戴护目镜，操作后应彻底洗手。 
		注意：HNB由主要科学试剂供应商以KCl分散体形式出售。因此，不同厂家、不同批次以及取样位置不同均可能导致溶液中实际浓度存在差异。理想情况下，储备液经20倍稀释后，在647 nm处的吸光度应在0.5–0.8之间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 样品制备与测量
<ol>
	<li>数据采集前分光光度计的准备
	<ol>
		<li>开启紫外-可见分光光度计并预热。将分光光度计设置为在 647 nm 处采集数据。 
		注：如果分光光度计允许，可额外在 850 nm 或其他与染料-金属及染料光谱无显著变化的波长处采集数据，用于基线校正。</li>
		<li>使用样品缓冲液对分光光度计进行空白校正。 
		注：可使用石英比色皿或一次性塑料比色皿。定量分析中优先选用石英比色皿，因其可提供比一次性塑料比色皿更高的准确度和精密度。然而，塑料比色皿会阻挡紫外光，而某些二极管阵列分光光度计的测量光束中可能含有紫外光。HNB 暴露于强紫外光下会导致明显的染料降解，并引起非期望的缓慢吸光度下降，可能被误认为是缓慢的金属结合（例如，参见参考文献20的补充信息中的图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对照样品的制备与吸光度测定
	<ol>
		<li>制备对照溶液，其中每毫升总测定体积含有 50 μL 的 HNB 储存液。为确保所有样品充分混匀，应先用移液器加入小体积液体，然后加入样品缓冲液，并通过移液操作进行混匀。稀释后的 HNB 溶液应现配现用，但 HNB 储存液可在 4 °C 下避光保存数周而不发生显著降解。</li>
		<li>将对照样品在室温下孵育至少 3 分钟。 
		注：在碱性 pH 或存在磷酸盐的情况下，由于形成难溶性金属复合物导致平衡较慢，可能需要更长的孵育时间。</li>
		<li>测定并记录对照样品在 647 nm 处的吸光度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品的制备与吸光度测定
	<ol>
		<li>通过将 50 μL 的 HNB 储存液与 950 µL 适当稀释的蛋白组分在样品缓冲液中混合，制备测定样品。 
		注：由于文献中报道的金属污染水平因洗脱条件不同可相差超过1000倍16,20，可能需要尝试几种不同稀释度的蛋白组分（见上述步骤1.2.1）以使吸光度变化处于测定的动态范围内。 
		警告：IMAC 中使用的镍及其他金属已知为皮肤刺激物，疑似致癌，并在长期暴露后可能损害肾脏和血液。处理经IMAC制备的蛋白样品时应佩戴手套并采取眼部防护。</li>
		<li>将样品在室温下孵育至少 3 分钟，并在 647 nm 处测定吸光度。 
		注：从耗时角度来看，该测定的限速步骤是孵育过程。本研究的数据采集使用单个石英比色皿，在每次测量之间仔细清洗。即使计入额外的清洗时间和 HNB 储存液的配制时间，14 个样品及对照的测定数据采集耗时约一个半小时，因此该方案可轻松完成而无需中断。</li>
		<li>对每个待测组分重复步骤 2.3.1 和 2.3.2。 
		注：若使用多个比色皿测定多个样品，应确保各样品的孵育时间及环境光暴露条件具有可比性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 金属定量
<ol>
	<li>测定每个样品中金属的浓度
	<ol>
		<li>计算每个样品在 647 nm 处的吸光度与 HNB 对照之间的差值。</li>
		<li>使用以下公式确定金属浓度（单位为 µM）： 
		 
		<img alt="镍离子浓度公式，光谱分析方程，吸光度计算。" src="/files/ftp_upload/60690/60690equfig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1"> 
		 
		其中 DF 为检测部分的稀释倍数，ΔAbs647 为 647 nm 处的吸光度变化值，3.65×10-2 表示 HNB 的摩尔消光系数（ε = 36.5 mM-1·cm-1，详见参考文献20），l 为比色皿的光程（单位为 cm）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelate+affinity+chromatography%2C+a+new+approach+to+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li>
<li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687909630275">Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review.</a> Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).</li>
<li>Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiality+of+IMAC+as+sample+pretreatment+tool+in+food+analysis+for+veterinary+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatographia%22%5BJournal%5D)">Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs.</a> Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).</li>
<li>Felix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+serum+proteins+involved+in+pancreatic+cancer+cachexia%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia.</a> Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+enhanced+laser+desorption%2Fionization+profiling%3A+New+diagnostic+method+of+HBV-related+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).</li>
<li>Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+bacterial+photosynthetic+reaction+centers+with+an+engineered+poly-histidine+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).</li>
<li>Guergova-Kuras, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+one-step+purification+of+a+fully+active+polyhistidine-tagged+cytochrome+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides.</a> Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).</li>
<li>Mitchell, D. M., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+wildtype+and+mutant+cytochrome+c+oxidase+from+Rhodobacter+sphaeroides+by+Ni%282%2B%29-NTA+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography.</a> FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).</li>
<li>Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+head+domain+movement+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+in+electron+transfer+reaction+of+the+cytochrome+bc1+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).</li>
<li>Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexibility+of+the+neck+region+of+the+rieske+iron-sulfur+protein+is+functionally+important+in+the+cytochrome+bc1+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).</li>
<li>Louie, A. Y., Meade, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+complexes+as+enzyme+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Metal complexes as enzyme inhibitors.</a> Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).</li>
<li>Tamás, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy+Metals+and+Metalloids+As+a+Cause+for+Protein+Misfolding+and+Aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation.</a> Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).</li>
<li>Gerencser, L., Maroti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retardation+of+proton+transfer+caused+by+binding+of+the+transition+metal+ion+to+the+bacterial+reaction+center+is+due+to+pKa+shifts+of+key+protonatable+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1850-1860 (2001).</li>
<li>Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash-induced+turnover+of+the+cytochrome+bc1+complex+in+chromatophores+of+Rhodobacter+capsulatus%3A+binding+of+Zn2%2B+decelerates+likewise+the+oxidation+of+cytochrome+b%2C+the+reduction+of+cytochrome+c1+and+the+voltage+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).</li>
<li>Link, T. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+ions+inhibit+the+QP+center+of+bovine+heart+mitochondrial+bc1+complex+by+blocking+a+protonatable+group%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).</li>
<li>Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Schäfer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+comprehensive+quality+control+of+recombinant+human+Interleukin-1beta%3A+a+case+study+for+a+process+development+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy.</a> Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).</li>
<li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides%3A+II.+Kinetics+and+mechanism+of+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).</li>
<li>Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+imidazole+to+the+heme+of+cytochrome+c1+and+inhibition+of+the+bc1+complex+from+Rhodobacter+sphaeroides%3A+I.+Equilibrium+and+modeling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).</li>
<li>Bornhorst, J. A., Falke, J. J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687900260588">Purification of proteins using polyhistidine affinity tags.</a> Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).</li>
<li>Kokhan, O., Marzolf, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+transition+metal+leaching+in+metal+affinity+chromatography+with+hydroxynaphthol+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue.</a> Analytical Biochemistry. 582, 113347(2019).</li>
<li>Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+method+for+simultaneous+measurement+of+zinc+and+copper+in+metalloproteins+using+4-%282-pyridylazo%29resorcinol%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol.</a> Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).</li>
<li>Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFurrer%2C+J+%22Inorganic+Chemical+Biology%22">Inorganic Chemical Biology</a>. Gasser, G. , (2014).</li>
<li>Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+proteins+in+whole+blood%2C+plasma+and+DBS%2C+with+element-labelled+antibody+detection+by+ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS.</a> Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).</li>
<li>Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultratrace+Elements+in+Terrestrial+Water+as+Determined+by+High-Resolution+ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Microchemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS.</a> Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).</li>
<li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+Formation+Between+Hydroxy+Naphthol+Blue+and+First+Row+Transition+Metal+Cyanide+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Letters%22%5BJournal%5D)">Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes.</a> Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).</li>
<li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Transition+Metal+Ions+by+the+Calcium+Indicator+Hydroxy+Naphthol+Blue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Letters%22%5BJournal%5D)">Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue.</a> Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).</li>
<li>Temel, N. K., Sertakan, K., Gürkan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preconcentration+and+Determination+of+Trace+Nickel+and+Cobalt+in+Milk-Based+Samples+by+Ultrasound-Assisted+Cloud+Point+Extraction+Coupled+with+Flame+Atomic+Absorption+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Trace+Element+Research%22%5BJournal%5D)">Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry.</a> Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).</li>
<li>Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+and+derivative+spectrophotometric+determination+of+nickel+with+hydroxynaphthol+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Microchimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue.</a> Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).</li>
<li>Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Self-Assembly+of+Monodisperse+Phospholipid+Bilayer+Nanodiscs+with+Controlled+Size%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).</li>
<li>Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+extended+membrane+scaffold+proteins+for+self-assembly+of+soluble+nanoscale+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%2C+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).</li>
<li>Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+dried-droplets+deposited+on+pre-cut+filter+paper+disks+for+quantitative+LA-ICP-MS+imaging+of+biologically+relevant+minor+and+trace+elements+in+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples.</a> Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).</li>
<li>Olmedo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+method+to+quantify+chromium%2C+cadmium%2C+manganese%2C+nickel+and+lead+in+human+whole+blood%2C+urine%2C+saliva+and+hair+samples+by+electrothermal+atomic+absorption+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).</li>
<li>Shyamal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Selective+Turn-On+Fluorogenic+Chemosensor+for+Robust+Quantification+of+Zn%28II%29+Based+on+Aggregation+Induced+Emission+Enhancement+Feature%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature.</a> ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).</li>
<li>Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-Based+Analytical+Device+for+Zinc+Ion+Quantification+in+Water+Samples+with+Power-Free+Analyte+Concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration.</a> Micromachines. 8 (4), 127(2017).</li>
<li>Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-cloth+integrated+with+gravity%2Fcapillary+flow+chemiluminescence+%28GCF-CL%29%3A+towards+simple%2C+inexpensive%2C+portable%2C+flow+system+for+measuring+trivalent+chromium+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用HNB进行金属的比色检测，为定量测定IMAC树脂中过渡金属离子引起的蛋白质污染程度提供了一种简便方法。如我们在参考文献20中所确立的，Ni2+与HNB以1:1的化学计量比结合，且Ni-HNB复合物的解离常数随pH变化。然而，在所有推荐的pH值范围（7–12）内，该复合物的Kd均处于亚纳摩尔（sub-nM）级别。实际意义上，这意味着只要不存在EDTA等其他强螯合试剂，任何待测组分中的Ni2+都将与HNB完全结合。这些性质共同导致了线性的Ni2+滴定曲线，我们在实验中已观察到这一现象。在该报告20中，我们还确定，由于金属-染料复合物的形成所引起的光谱变化，在整个pH 7–12范围内保持一致。该检测方法的下限受限于可可靠测量的最小吸光度变化（根据所用分光光度计的不同，为10-4 – 10-3 OD），对应于2.7–27 nM的Ni2+。检测上限则受限于HNB的加入量。在本研究中，我们使用约15 µM的HNB，其在647 nm处的吸光度约为0...

自从 Porath 及其同事首次提出以来1，固定化金属亲和层析（IMAC）已成为一种根据蛋白质与过渡金属离子（如 Zn2+、Ni2+、Cu2+ 和 Co2+）结合能力进行快速分离的首选方法。该方法通常通过设计的多组氨酸标签实现，现已成为分离重组蛋白最常用的层析纯化技术之一2。IMAC 的应用已超越重组蛋白纯化，被用于食品样品分析中喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类和 β-内酰胺类物质的分离3，也被用于肝癌和胰腺癌血清蛋白标志物鉴定的步骤之一4,5。毫不奇怪，IMAC 也已成为分离多种天然生物能量酶的首选方法6,7,8,9,10。然而，这些纯化方法在酶活性生物能量蛋白研究中的成功实施，依赖于柱基质中浸出至洗脱液的金属阳离子水平可忽略不计。IMAC 中常用的二价金属阳离子即使在低浓度下也具有明确的病理生物学意义11,12。这些金属的生理效应在生物能量系统中尤为显著，可作为细胞呼吸或光合作用的抑制剂而具有致死性13,14,15。对于大多数蛋白质类别而言，残留污染物金属会干扰蛋白质的生物学功能，或影响其在生化与生物物理技术中的表征，类似的问题不可避免。
尽管在氧化条件下使用咪唑作为洗脱剂时，金属污染水平通常较低16，但在含有半胱氨酸还原剂（如DTT、β-巯基乙醇等）或使用组氨酸17,18或乙二胺四乙酸（EDTA）等更强螯合剂的情况下进行蛋白质纯化时，金属污染水平会显著升高19,20。类似地，由于IMAC树脂中的金属离子通常由羧基配位，因此在酸性条件下进行的蛋白质洗脱也容易导致更高的金属污染水平。溶液中的金属含量可通过原子吸收光谱法（AAS）和电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）进行检测，检测限可达ppb至ppt范围21,22,23,24。然而，AAS和ICP-MS在传统生物化学实验室中并不具备实际可行性，因为这些方法需要专用设备和专业培训。
Brittain25,26此前研究了使用羟基萘酚蓝（HNB）作为识别溶液中过渡金属存在的方法。然而，其数据中存在若干内部矛盾20，且这些研究未能提供充分的实验方案。Temel等人27和Ferreira等人28在Brittain工作的基础上进一步探索了HNB作为潜在金属指示剂的应用。然而，Temel开发的方案仅将HNB用作螯合剂，并依赖原子吸收光谱法（AAS）进行样品分析。Ferreira的研究则利用HNB在563 nm处吸光度的变化进行检测，但该波长位于游离染料HNB光谱与HNB-金属配合物在pH 5.7条件下光谱严重重叠的区域，导致检测灵敏度较低，且金属结合亲和力相对较弱20。为解决本实验室中IMAC过程中Ni2+渗漏的问题，我们拓展了Brittain25,26和Ferreira28的研究，建立了一种简便的检测方法，可检测多种过渡金属的纳摩尔水平。我们已证明，HNB在较宽pH范围内与镍及其他常用于IMAC的金属形成1:1配合物，且结合亲和力达到亚纳摩尔级别20。本文报道的检测方法基于上述发现，利用HNB在647 nm处光谱吸光度的变化实现金属的定量分析。该方法可在生理pH范围内进行，使用典型生物化学实验室常见的缓冲体系和仪器，通过比色法检测和定量金属-染料配合物，以及游离染料与金属结合后相应的吸光度变化。

<table><tbody><tr><td>2xYT 肉汤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9743-500</td><td>用于大肠杆菌生长的培养基</td></tr><tr><td>HEPES，游离酸</td><td>BioBasic</td><td>HB0264</td><td>替代缓冲液</td></tr><tr><td>HisPur Ni-NTA 树脂</td><td>Thermo Scientific</td><td>88222</td><td></td></tr><tr><td>羟基萘酚蓝二钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>219916-5g</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196-500</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>BioBasic</td><td>IB0277</td><td></td></tr><tr><td>MOPS，游离酸</td><td>BioBasic</td><td>MB0360</td><td>替代缓冲液</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td>替代缓冲液</td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Gold Bio</td><td>T870-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500</td><td></td></tr></tbody></table>

固定化金属亲和色谱中金属浸出的定量分析

Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography

用于固定化金属亲和层析（IMAC）柱的金属浸出导致酶被污染，这是酶学研究者面临的一个主要问题，因为IMAC树脂中常用的许多二价和三价阳离子对酶具有抑制作用。然而，由于缺乏使用生物化学实验室常见设备即可操作的简单且实用的过渡金属定量方案，人们对金属浸出的程度以及不同洗脱剂和还原剂的影响仍知之甚少。为解决这一问题，我们开发了一种实验方案，可快速定量经IMAC纯化步骤制备样品中的金属污染量。该方法利用羟基萘酚蓝（HNB）作为样品溶液中金属阳离子含量的比色指示剂，并通过紫外-可见光谱法在647 nm处检测HNB光谱的变化，从而将金属含量定量至纳摩尔（nmol）级别。传统上，溶液中的金属含量通常采用原子吸收光谱法或电感耦合等离子体技术测定，但这些方法需要专用仪器和专门培训，超出了典型生物化学实验室的能力范围。本文提出的方法使生物化学研究人员能够利用现有设备和知识，简便、快速地测定样品中的金属含量，且不牺牲准确性。

中性pH下游离HNB的光谱（黑线）及用于Ni检测的各组分的代表性光谱2+ 从 MSP1E3D1 的分离29 如图所示 图2成功的检测系列应显示在647 nm处的吸光度较HNB对照降低，这对应于在存在过渡金属的情况下形成了HNB复合物。若在647 nm处吸光度升高，则表明检测失败。另外，若在647 nm处的吸光度较初始值下降超过90%，则提示金属含量过高，需对更稀释的组分进行检测。检测结果中吸光度未发生变化，与游离HNB对照一致，并不一定表示检测失败；有可能样品中几乎不含浸出金属。然而这种情况较为罕见，任何未显示吸光度变化的样品均应重新制备并再次测量，最好减少稀释倍数，以确认结果。总体而言，大多数未能观察到预期吸光度变化的情况可归因于样品制备过程中移液操作不当、测量前孵育时间不足，或pH值超出推荐的7–12范围。
为了展示该检测方法的应用，我们分析了两种带组氨酸标签的膜支架蛋白MSP1E3D1（制备方法见Denisov, I. G. 等人<sup clas...

我们介绍了一种简便的检测方法，用于定量分析通过固定化金属亲和层析制备的样品中引入的金属。该方法采用羟基萘酚蓝作为比色金属指示剂，并以紫外-可见分光光度计作为检测器。

固定化金属亲和色谱柱（IMAC）中浸出的金属对酶造成污染，是酶学研究者面临的主要问题，因为……

本方法具有重要意义，因为它能够使普通生物化学研究人员快速判断通过固定化金属亲和层析分离的样品是否被过渡金属污染。该方法的主要优势在于操作简便。该检测所用的仪器和实验技术在大多数生物化学实验室中均很常见，因此可以轻松且快速地实施。尽管本文中采用镍-NTA柱纯化的样品进行该方法的应用，但该方法也可用于其他任何金属螯合亲和树脂。初次使用者应先使用已知浓度的镍标准溶液尝试该方法，以熟悉实验流程、样品颜色以及光谱变化中显示的树脂特性。演示该实验操作的是我实验室的技术员 Cole Swain。首先，打开紫外-可见分光光度计并进行预热。使用带二极管阵列的紫外-可见分光光度计，在280纳米波长下通过光吸收来测定待分析的层析组分，以定量蛋白质含量。取 pH 在 7 至 12 之间的 10 至 100 毫摩尔样品缓冲液，例如 Tris、HEPES、MOPS 和磷酸盐缓冲液。使用每毫升储备液 120 毫克 HNB 试剂，在样品缓冲液中配制 12%（质量/体积）的 HNB 分散液。将分光光度计设置为在 647 纳米波长处采集数据。使用装有样品缓冲液的石英比色皿对分光光度计进行调零。在比色皿中配制对照溶液，每毫升总反应体积中含有50微升HNB储备液。将对照溶液在室温下孵育至少三分钟。测定并记录对照样品在647纳米处的吸光度。通过将150微升HNB储备液与2850微升用样品缓冲液适当稀释的蛋白组分混合，制备检测样品。将样品在室温下孵育至少三分钟。对每个待测组分重复进行光谱记录。若稀释不足，则在647纳米处的整个光谱带将消失；而若稀释过度，则样品与对照无法区分。为确定每个样品中金属的浓度，首先计算各样品在 647 纳米处的吸光度与 HNB 对照之间的差值。使用以下公式确定以微摩尔为单位的金属浓度：其中 DF 为检测组分的稀释倍数，ΔA-B-S 647 为 647 纳米处的吸光度变化，3.65 × 10⁻² 表示 HNB 的摩尔吸光系数，l 为比色皿的光程（厘米）。本研究中展示了在中性 pH 条件下游离 HNB 的光谱，以及从 MSP1E3D1 分离过程中检测镍离子的代表性组分的光谱。与HNB对照相比，在647纳米处观察到吸光度降低，这对应于在存在过渡金属的情况下形成了HNB复合物。为了展示该检测方法的应用，分析了两种带组氨酸标签的膜支架蛋白MSP1E3D1、MSP2N2，以及来自硫还原地杆菌（geobacter sulfurreducens）的一种新型含三个血红素的c型细胞色素GSU0105。对于GSU0105，其各组分中的蛋白质和镍离子含量显著分离；而MSP1E3D1和MSP2N2中蛋白质含量最高的组分也具有最高的镍含量。本文还说明，使用金属螯合亲和层析收集的不同组分中，金属含量可能分布不均。最重要的是，在所有样品中充分且一致地混匀空白对照，并确保空白对照在所有样品中的孵育时间相等。对于特别关注的蛋白质组分，可进一步采用原子吸收光谱法或电感耦合等离子体质谱法（ICPMS）进行分析，以确认是否存在金属污染，并检测是否存在螯合或紧密结合的蛋白质金属离子。除了可用于检测过渡金属的溶出外，该技术还可用于测定过渡金属离子与蛋白质之间的结合亲和力。HNB 以及样品中可能存在的镍分别对眼睛和皮肤具有刺激性。实验过程中应使用标准的个人防护装备，包括手套和护目用品。

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