金属浸出在固定金属亲和力色谱中的定量

我们的方法非常重要，因为它允许普通生物化学家快速确定使用固定金属亲和力色谱分离的样品是否受到过渡金属的污染。主要优点是易于进行测定。该检测使用大多数生物化学实验室常见的仪器和技术，可以轻松、快速地实施。

在这篇文章中，我们应用这种方法与镍-NTA柱分离的样品，该方法可用于任何其他金属亲和力树脂。首次使用已知浓度的镍库存溶液时，用户应尝试此方法。这将熟悉光谱变化中显示的工作流程、样品颜色和树脂。

演示这个程序的将是科尔·斯温，一个来自我实验室的技术人员。首先，打开 UV-Vis 分光光度计并预热。确定使用二极管阵列UV-Vis分光光度计测定的色谱分数，光学吸收度为280纳米，以量化蛋白质。

获得 10 至 100 毫摩尔样品缓冲液，PH 介于 7 和 12 之间，例如 Tris、HEPES、MOPS 和磷酸盐缓冲液。使用每毫升库存溶液的 120 毫克 HNB 试剂，在样品缓冲液中制备 12% 的 HNB 分散量溶液。设置分光光度计以在 647 纳米时收集数据。

使用填充样品缓冲液的石英库将分光光度计空白。在含有每毫升总测定量的 50 微升 HNB 库存的 cuvette 中准备一个控制解决方案。在室温下，允许控制至少孵育三分钟。

测量并记录控制样品的 647 纳米的吸光度。通过将 150 微升 HNB 库存与 2850 微升适当稀释的蛋白质馏分与样品缓冲液混合，准备检测样品。在室温下，让样品孵育至少三分钟。

对要测量的每个分数重复频谱记录。在获得稀释不足的情况下，647纳米的整个光谱带消失。虽然稀释过强，但样品与控制物不易使用。

要确定每个样品中金属的浓度，请首先从 HNB 控制中找出每个样品吸收率在 647 纳米时的差异。使用DDF是测定分数的稀释因子的公式确定微摩尔中的金属浓度，增量 A-B-S 647 是 647 纳米的吸收度变化，3.65 倍 10 到负 2 表示 HNB 的消光系数，l 是 cuvette 的光路（以厘米为单位）。在这项研究中，此处显示了从MSP1E3D1分离中对镍离子进行分谱的中性PH的免费HNB光谱。

与 HNB 控制相比，647 纳米的吸收度有所下降，这与在过渡金属存在的情况下形成 HNB 复合物相对应。为了证明该测定方法的应用，分析了两种他标记的膜基架蛋白，MSP1E3D1，MSP2N2，以及一种新型的三血、c型细胞色素GSU0105，来自细菌硫化物。GSU0105中每个分数的蛋白质和镍离子含量彼此显著变化，而含有最多蛋白质的MSP1E3D1和MSP2N2的含量也具有最高的镍含量。

还说明，金属含量可能无法均匀地分布在使用动员的金属亲和力色谱收集的馏分中。最重要的是，在所有样品中充分且一致地混合空白，并允许所有样品中的空白有相等的孵育时间。可以通过原子吸收光谱学或ICPMS进一步分析特殊感兴趣的蛋白质分数，以确认金属污染，并测试溷合或强结合蛋白金属离子。

除了过渡金属浸出检测外，该技术还可用于测量过渡金属离子与蛋白质的结合亲和力。HNB 和样品中任何镍分别是眼睛和皮肤的刺激物。方法期间应使用标准 PPE，包括手套和眼睛保护。