Name: IR-TEx:专为疟疾病媒阿诺菲斯甘巴病设计的大数据转录组学的开源数据集成工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 了解IR-TEx开源数据集成工具，用于分析Anopheles gambiae疟疾病媒的杀虫剂抗性转录组数据。该工具无需生物信息学背景即可实现数据可视化与相关性分析，助力研究人员探索基因表达模式并制定病媒控制策略。

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本工作由英国医学研究理事会（MRC）授予V.I.的技能发展研究员项目（MR/R024839/1）以及皇家学会挑战基金（CH160059）授予H.R.的资助支持。

1. 使用 IR-TEx 网络应用程序
<ol>
	<li>在网页浏览器中运行应用程序
	<ol>
		<li>通过访问页面底部的链接打开 IR-TEx 网络应用程序 <a href="http://www.lstmed.ac.uk/projects/IR-TEx" target="_blank">http://www.lstmed.ac.uk/projects/IR-TEx</a>.</li>
		<li>网页初始化完成后，单击 应用 页面顶部的按钮，该按钮将显示应用程序及其相关输出。</li>
		<li>阅读与默认条目相关的每个输出 AGAP008212-RA (CYP6M2) 在转录本 ID 框中输入以下条件： An. coluzzii 暴露于拟除虫菊酯类杀虫剂或未暴露于任何杀虫剂类别的数据集，以及相关转录本与相关系数 |r| &#62;0.98.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>探索目标转录本的表达
	<ol>
		<li>要选择感兴趣的转录本，请将转录本ID输入到 转录本 ID 盒，记住转录本以结尾 -RX 取决于所关注的同工型。</li>
		<li>选择要查询的数据集，勾选以下相关选项：(i) 国家；(ii) 暴露状态；(iii) 目标物种；(iv) 目标杀虫剂类别，并确保这些筛选条件能够产生 &#62;1个包含的数据集（参见Ingham等人的补充表1）1). 
		注：(iii) 指该成员中的 An. gambiae 用户感兴趣的物种复合群。目前，相关数据已可获取。 An. coluzzii 和 An. arabiensis.</li>
		<li>点击 更新视图 在选择菜单的底部或按 返回，忽略 绝对相关值 （目前）。</li>
		<li>等待应用程序完成更新。</li>
		<li>将第一张图理解为：log2 抗性种群与实验室敏感蚊种群之间目标转录本在各数据集中满足步骤1.2所选条件的倍数变化图1）。所有数据集的详细信息可参见 Ingham 等人。1.</li>
		<li>阅读图表下方的信息：各相关数据集中抗性蚊虫与敏感蚊虫之间的倍数变化，以及校正后的 p 值（Q）。每一行代表微阵列上的单个探针。该图形展示方法此前已有报道1.</li>
		<li>阅读下表，了解在所选步骤1.2标准下，目标转录本具有显著性的实验数量以及符合条件的实验总数。</li>
		<li>要以制表符分隔格式下载数据，请点击 下载 位于两个表格下方的按钮。此按钮允许用户通过 Excel 等程序更便捷地浏览数据。</li>
		<li>按如下方式解读地图：每个点代表在各数据集中抗性蚊虫的大致采集地点，其中所关注的转录本呈现差异表达。颜色遵循应用程序中说明的交通信号灯系统图2).</li>
		<li>对于步骤 1.2.5 和 1.2.8，通过右键单击并点击 另存图像为…， 并选择一个合适的文件夹。 
		注意：如果应用程序出现输出错误，很可能没有数据集符合输入的条件。请查阅 Ingham 等人论文中的补充表 1。1 如果发生这种情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>鉴定目标转录本的潜在功能/通路
	<ol>
		<li>相关性（最小 r 值）2 在多个数据集之间输入值的转录本表达模式可用于预测转录本功能，并有可能揭示来自同一通路的共调控转录本。以 Ingham 等人的研究为例1 (AGAP001076-RA； CYP4G16），请按照上述章节中的步骤1.2.1–1.2.2操作，选择所有数据集以获得最大功效。</li>
		<li>点击之前 更新视图，移动 绝对相关值 将滑块调至 0.85，然后单击 更新视图 或按压 返回.</li>
		<li>检查相关性表格（最下方的表格），找出当前显示的多个转录本，这些转录本与输入的转录本具有相关性（|r| = 0.85）。</li>
		<li>操作 绝对相关值 滑动滑块并观察最下方图表和表格中的任何变化；步骤 1.3.2 的输出结果将保持不变。如图所示 图3 (|r| &#62; 0.9，|r| &#62; 0.8），降低相关性值的严格度会显示更多的转录本，但也会引入更多噪声。</li>
		<li>阅读图形输出下方的表格，该表格（除步骤 1.2.6 中描述的参数外）还包含每个转录本的相关性值。</li>
		<li>要以制表符分隔的格式下载数据，请点击 下载 按钮。</li>
		<li>可使用 DAVID 分析对下载的转录本 ID 列表进行功能富集分析8. 进入 DAVID 网站（网址为 <a href="https://david.ncifcrf.gov/" target="_blank">https://david.ncifcrf.gov/</a>），选择 功能分析. 粘贴完整的基因列表，使用基因ID（不包含-RX后缀的标识符，可在Excel中通过在系统编号右侧插入一列并输入） =LEFT(X1,10)，其中 X1 为系统编号单元格]。选择该标识符作为 VectorBase_ID 基因列表并点击 提交列表.</li>
		<li>点击 功能注释聚类 按钮，以获取该相关网络中富集结果的概览，从而为转录本指派潜在功能。通过浏览不同类别并点击相应项，深入探索各项富集结果。 + 每个按钮，然后点击 图表.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 本地下载和实施 IR-TEx
<ol>
	<li>下载并运行 IR-TEx
	<ol>
		<li>访问 <a href="http://github.com/LSTMScientificComputing/IR-TEx" target="_blank">http://github.com/LSTMScientificComputing/IR-TEx</a> 的链接；点击 Clone or download | Download Zip。选择一个目标文件夹并将文件解压至该文件夹中。</li>
		<li>从 <a href="http://cran.r-project.org/mirrors.html" target="_blank">http://cran.r-project.org/mirrors.html</a> 提供的链接下载适用于相应操作系统的最新版本 R 软件，并安装该程序。</li>
		<li>再次从 <a href="http://www.rstudio.com/products/rstudio/download/" target="_blank">http://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</a> 提供的链接下载并安装适用于相应操作系统的最新 R Studio 软件。</li>
		<li>安装完成后，打开 R Studio | Supplemental coding File 1，逐行运行代码，以完成 IR-TEx 的系统配置。</li>
		<li>当所有软件包均成功安装并按需更新后，进入 File | Open，找到 IR-TEx.R 文件，选中并打开。此时该文件应显示在 R Studio 的顶部窗口中。</li>
		<li>要运行应用程序，请点击窗口右上角的 Run App 按钮，将弹出第二个窗口用于加载应用程序。加载完成后，为获得完整功能，请点击已加载窗口右上角的 Open in Browser。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向 IR-TEx 添加抗性数据集（使用 Anopheles gambiae 15k Agilent 芯片生成）
	<ol>
		<li>若要将使用相同微阵列平台（A-MEXP-2196）生成的新分析数据集添加至现有数据集中，请先下载应用程序，并定位到第 2.1 节中下载并解压的文件夹。</li>
		<li>打开 Additional File 1，该文件代表在 A-MEXP-2196 平台上进行 limma 分析的输出结果1。在 Excel 中，于 H1 单元格输入 Fold_Change，在 H2 单元格输入 =2^B2（其中 B2 为对数倍数变化值），并将此公式应用于 H 列的其余单元格，以生成原始倍数变化值。</li>
		<li>调整 Additional File 1 的结构，使 A 列为 ID，B 列为 H 列的倍数变化值（复制 H 列，选中 B 列，右键粘贴数值），C 列为校正后的 p 值。删除所有其他列，并将其另存为制表符分隔的文件。</li>
		<li>打开 Supplemental coding File 2，使用第 2.2.3 步生成的制表符分隔文件运行代码。 
		NEWFILE_FC = c('COUNTRY','EXPOSURE STATUS','SPECIES','INSECTICIDE') 
		NEWFILE_Q = c('COUNTRY','EXPOSURE STATUS','SPECIES','INSECTICIDE') 
		注意：单引号内的字段应更改为新数据集的相关信息。暴露状态指样本是否在杀虫剂暴露后采集（暴露/未暴露）。杀虫剂：若为“未暴露”，则填写“none”。参见 Fold_Changes.txt 文件中其他样本的元数据。请确保拼写一致。</li>
		<li>打开 geography.txt 文件，滚动至最后一个有内容的行，选择其下一行。在第 1 列输入数据集名称，后跟 Q 和 NEWFILE_Q；在第 2 列输入样本采集地点的纬度；在第 3 列输入经度。保存更改。</li>
		<li>如果使用了新的条目（例如 Gambia），而该条目在数据集中不可选（参见 Ingham 等人补充表 11），则需要将其添加至代码中。为此，请在 RStudio 中打开 IR-TEx.R 文件，并定位到 RStudio 指示的第 26 行，此处应开始出现以下内容： 
		'sidebarPanel(….'。 
		注意：接下来的每一行对应在第 2.2.5 步中输入到 Fold_Changes.txt 文件中数据集名称下方各行的元数据项。</li>
		<li>要添加新的元数据，请滚动至所选元数据所在行的末尾，找到“selected=”这一术语。其后应为一个逗号和闭合括号；此时将光标置于闭合括号内。在最后一个单引号后输入一个逗号，接着输入一个单引号，然后输入新的元数据（例如 'Gambia'），并保存更改。示例如下： 
		checkboxGroupInput('CountryInput','Select Relevant Countries',c('Burkina Faso','Cote D`Ivoire','Cameroon','Equatorial Guinea','Zambia','Tanzania','Sudan','Uganda','Togo', 'Gambia'),selected=c('Burkina Faso','Cote D`Ivoire','Cameroon','Equatorial Guinea','Zambia','Tanzania','Sudan','Uganda','Togo'))</li>
		<li>运行应用程序。新的元数据条目应作为未选中的复选框出现在相应标题下。如果用户希望其默认被选中，则应将其添加至 selected=c(…) 列表中，如下所示： 
		checkboxGroupInput('CountryInput','Select Relevant Countries',c('Burkina Faso','Cote D`Ivoire','Cameroon','Equatorial Guinea','Zambia','Tanzania','Sudan','Uganda','Togo', 'Gambia'),selected=c('Burkina Faso','Cote D`Ivoire','Cameroon','Equatorial Guinea','Zambia','Tanzania','Sudan','Uganda','Togo', 'Gambia'))</li>
		<li>如需添加未在 A-MEXP-2196 平台上生成的抗性数据集，请参见第 3 节。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 针对不同数据集调整 IR-TEx 的使用方法
<ol>
	<li>在多个组学平台间应用并处理缺失数据
	<ol>
		<li>继续进行 &#34;0&#34; 在数据集中：请查阅数据集来源以了解具体含义 &#34;0&#34;建议 &#34;0&#34; 被（保守地）替换为 &#34;NA&#34;与原始的倍数变化（B/A）相同， &#34;0&#34; 表示在实验条件B中未检测到信号。如果实验条件A表现出显著表达，用户可应用较小的倍数变化值。</li>
		<li>打开 附加文件 2.txt，一个来自 Uyhelji 等人的 RNAseq 文件9此文件为新数据应遵循的模板：A 列为标识符，B 列为原始倍数变化值，C 列为校正后的 p 值。请使用此文件执行以下步骤。</li>
		<li>运行 R 代码，将不同平台的标识符匹配到一个制表符分隔的文件中，然后对数据进行整理和标准化（补充编码文件 2）。文件中包含说明。任何 FILEPATH 均将通过 &#34;/&#34; 适用于 macOS 或 &#34;//&#34; 适用于 Windows（请更改这些设置） &#34;\&#34;，它们将按此形式呈现。</li>
		<li>输出在实验结束时生成的文件 补充编码文件 2 到步骤 3.1.5 中选定的位置以供使用。 补充编码文件 2 将输出一个新 Fold_Changes.txt 文件。备份原始文件。</li>
		<li>执行包含在代码中的指令 补充编码文件 3. 找到名为的输出文件 FC_distribPlot.png 在指定为的文件夹中 文件路径. 检查对数分布2 倍数变化，以验证对数2 不同数据集之间的倍数变化分布几乎相同。</li>
		<li>按照步骤 2.2.6 的说明编辑其他文件，并确保新文件的兼容性 Fold_Changes.txt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 IR-TEx 用于全新数据集的修改方法
	<ol>
		<li>打开 IR-TEx.R 在 RStudio 中并找到以第 23–34 行开头的代码行： 
		'标签面板(' 
		并结束于： 
		提交按钮(&#34;更新视图&#34;, 图标(&#34;刷新&#34;)) 
		),</li>
		<li>改变 AGAP008212-RA 在新数据中，将以下行中的内容与目标转录本进行比对。 
		textInput('textInput','转录本 ID',value='AGAP008212-RA')</li>
		<li>找到以以下内容开头的四个选项： 
		复选框组输入 
		这些选项可进行修改，以表示用户希望用于筛选新数据的重要元数据。在每种情况下，用户都应更改 选择相关国家; 选择暴露状态; 选择相关物种； 和 选择杀虫剂类别 以代表数据（即 选择组织类型; 选择性别; 选择年龄区间; 选择疾病状态.</li>
		<li>识别与数据集相关的元数据，并输入以替换第一个之后的现有选项 c('在每种情况下，选项都应包含在引号内，并以逗号与下一个选项分隔。在最后一个选项之后，应闭合括号。示例如下 选择疾病状态 是： 
		（感染、未感染、未知）</li>
		<li>选择在打开应用程序时将选中的元数据。这些选项可通过修改后续设置进行更改 selected=c('一个示例 选择疾病状态 是： 
		selected = c('感染', '未感染') 
		这将指示应用程序在初始加载时仅选择符合这些条件的数据集。</li>
		<li>要创建一个新的数据表，请遵循以下布局： Fold_Changes.txt 并按照第2节中的说明操作。根据步骤3.2.4中列出的每一项更改，精确修改元数据（R语言区分大小写）。在“detoxification”列中输入基因名称，在“transcript type”列中为每条转录本输入基因描述。添加新数据集时，请遵循第3.2节的指导。</li>
		<li>如果映射与实验需求无关，请找到以下代码行并在其前方添加“#”： 
		第49–51行： 
		（空行） 
		withSpinner(plotOutput(&#34;地理学&#34;)), 
		地理图例 
		第493行开始： 
		地理学 &#60;- renderPlot({ 
		至602行结束： 
		地理图例 &#60;- 渲染文本({ 
		粘贴(&#34;仅显著转录本（p&#34;，作为表达式（"<=&#34;),&#34;0.05)：FC &#62; 5 = 红色，FC &#62; 1 = 琥珀色，FC &#60; 1 = 绿色&#34;，sep=""） 
		})</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ingham, V. A., Wagstaff, S., Ranson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+meta-signatures+identified+in+Anopheles+gambiae+populations+reveal+previously+undetected+insecticide+resistance+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic meta-signatures identified in Anopheles gambiae populations reveal previously undetected insecticide resistance mechanisms.</a> Nature Communications. 9 (1), 5282(2018).</li>
<li>Chang, W., Cheng, J., Allaire, J., Xie, Y., McPherson, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChang%2C+W+%22shiny%3A+Web+Application+Framework+for+R%22">shiny: Web Application Framework for R</a>. , (2017).</li>
<li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+malaria+control+on+Plasmodium+falciparum+in+Africa+between+2000+and+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The effect of malaria control on Plasmodium falciparum in Africa between 2000 and 2015.</a> Nature. 526 (7572), 207-211 (2015).</li>
<li>Ranson, H., Lissenden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticide+Resistance+in+African+Anopheles+Mosquitoes%3A+A+Worsening+Situation+that+Needs+Urgent+Action+to+Maintain+Malaria+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Insecticide Resistance in African Anopheles Mosquitoes: A Worsening Situation that Needs Urgent Action to Maintain Malaria Control.</a> Trends in Parasitology. 32 (3), 187-196 (2016).</li>
<li>Donnelly, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+kdr+genotype+predict+insecticide-resistance+phenotype+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Does kdr genotype predict insecticide-resistance phenotype in mosquitoes.</a> Trends in Parasitology. 25 (5), 213-219 (2009).</li>
<li>Stevenson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+6M2+from+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae+metabolizes+pyrethroids%3A+Sequential+metabolism+of+deltamethrin+revealed%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 6M2 from the malaria vector Anopheles gambiae metabolizes pyrethroids: Sequential metabolism of deltamethrin revealed.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 41 (7), 492-502 (2011).</li>
<li>Müller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-Caught+Permethrin-Resistant+Anopheles+gambiae+Overexpress+CYP6P3%2C+a+P450+That+Metabolises+Pyrethroids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Field-Caught Permethrin-Resistant Anopheles gambiae Overexpress CYP6P3, a P450 That Metabolises Pyrethroids.</a> PLoS Genetics. 4 (11), 1000286(2008).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DAVID+Gene+Functional+Classification+Tool%3A+a+novel+biological+module-centric+algorithm+to+functionally+analyze+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists.</a> Genome Biology. 8 (9), 183(2007).</li>
<li>Uyhelji, H. A., Cheng, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+differences+between+euryhaline+and+stenohaline+malaria+vector+sibling+species+in+response+to+salinity+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic differences between euryhaline and stenohaline malaria vector sibling species in response to salinity stress.</a> Molecular Ecology. 25 (10), 2210-2225 (2016).</li>
<li>Edi, C. V., Benjamin, K. G., Jones, C. M., Weetman, D., Ranson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-Insecticide+Resistance+in+Anopheles+gambiae+Mosquitoes%2C+Southern+C%C3%B4te+d%E2%80%99Ivoire%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Multiple-Insecticide Resistance in Anopheles gambiae Mosquitoes, Southern Côte d’Ivoire.</a> Emerging Infectious Diseases. 18 (9), 1508-1511 (2012).</li>
<li>Ding, Y., Ortelli, F., Rossiter, L., Hemingway, J., Ranson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Anopheles+gambiae+glutathione+transferase+supergene+family%3A+annotation%2C+phylogeny+and+expression+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Anopheles gambiae glutathione transferase supergene family: annotation, phylogeny and expression profiles.</a> BMC Genomics. 4 (1), 1-16 (2003).</li>
<li>Enayati, A. A., Ranson, H., Hemingway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+glutathione+transferases+and+insecticide+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insect glutathione transferases and insecticide resistance.</a> Insect Molecular Biology. 14 (1), 3-8 (2005).</li>
<li>Ranson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+class+of+insect+glutathione+S-transferases+involved+in+resistance+to+DDT+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel class of insect glutathione S-transferases involved in resistance to DDT in the malaria vector Anopheles gambiae.</a> The Biochemical Journal. 359, 295-304 (2001).</li>
<li>Riveron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+mutation+in+the+GSTe2+gene+allows+tracking+of+metabolically+based+insecticide+resistance+in+a+major+malaria+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A single mutation in the GSTe2 gene allows tracking of metabolically based insecticide resistance in a major malaria vector.</a> Genome Biology. 15 (2), 27(2014).</li>
<li>Pavlidi, N., Vontas, J., Van Leeuwen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glutathione+S-transferases+%28GSTs%29+in+insecticide+resistance+in+crop+pests+and+disease+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">The role of glutathione S-transferases (GSTs) in insecticide resistance in crop pests and disease vectors.</a> Current Opinion in Insect Science. 27, 97-102 (2018).</li>
<li>Salvemini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+glutathione+levels+and+oxidoresistance+mediated+by+increased+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enhanced glutathione levels and oxidoresistance mediated by increased glucose-6-phosphate dehydrogenase expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (5), 2750-2757 (1999).</li>
<li>Deplancke, B., Gaskins, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+control+of+the+transsulfuration+and+glutathione+biosynthesis+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Clinical+Nutrition+%26+Metabolic+Care%22%5BJournal%5D)">Redox control of the transsulfuration and glutathione biosynthesis pathways.</a> Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 5 (1), (2002).</li>
<li>Puente, X. S., López-Otn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+analysis+of+a+novel+human+serine+hydrolase+with+sequence+similarity+to+prokaryotic+enzymes+involved+in+the+degradation+of+aromatic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression analysis of a novel human serine hydrolase with sequence similarity to prokaryotic enzymes involved in the degradation of aromatic compounds.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (21), 12926-12932 (1995).</li>
<li>Riveron, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+transcription+and+functional+analyses+reveal+heterogeneous+molecular+mechanisms+driving+pyrethroids+resistance+in+the+major+malaria+vector+Anopheles+funestus+across+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide transcription and functional analyses reveal heterogeneous molecular mechanisms driving pyrethroids resistance in the major malaria vector Anopheles funestus across Africa.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (6), 1819-1832 (2017).</li>
<li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+models+and+empirical+bayes+methods+for+assessing+differential+expression+in+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Statistical+Applications+in+Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 3 (1), 3(2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

大数据转录组学为每种实验条件产生数千个差异表达转录本的列表。许多此类实验是在相关生物体和表型上进行的，且几乎总是被作为独立实验进行分析。通过整体性地、且不依赖理论假设地利用这些丰富的数据资源，将能够：1）识别出新的候选转录本；2）避免因信息量过大而无法在体内验证，从而导致有价值的数据被舍弃1。
IR-TEx 为生物信息学背景有限的用户提供了便捷地分析多个数据集、可视化数据集变化以及下载相关数据的能力1。尽管 IR-TEx 不支持在单次搜索中查询多个转录本，但用户可直接使用 Excel、R 或其他合适的程序查看相应的 Fold_Changes.txt 文件。IR-TEx 的进一步优势在于利用相关性网络预测转录本功能，输入假定蛋白或功能未知的转录本，并结合下游软件进行富集分析1。
在本方案所展示的示例中，IR-TEx 按其原始功能使用。在此，它可用于探索与杀虫剂抗性相关的转录本，并通过作图方式可视化转录本的上调和下调表达分布情况。感兴趣的转录本需在体内进行验证，以确定其上调或下调表达是否与观察到的表型1（例如杀虫剂抗性）相关。如先前报道1所示，该数据集可用于基于假设的研究方法，以在国家特异性基础上鉴定感兴趣的转录本。随后可利用 IR-TEx 实现：1）探索该转录本的表达情况；2）通过在每个组学数据集所包含的所有转录本之间构建两两相关性网络，对该转录本的功能进行情境化分析。在此，GSTMS1 被发现与多个参与解毒过程的其他转录本存在共相关性。这些数据（结合该转录本敲低后，在杀虫剂暴露后导致死亡率显著上升的结果）表明该转录本在异源物质清除中具有重要作用。
IR-TEx 是一个有价值的资源，可用于通过网络或本地应用程序探索与杀虫剂抗性相关的转录本。本实验方案展示了如何针对不同的组学平台以及全新的数据对 IR-TEx 进行修改。该指南说明了如何使用 IR-TEx 整合来自多个组学平台的数据集，包括含有缺失数据的数据集，并展示了如何简便地重新编码 IR-TEx，使其对任何研究转录组数据集的研究人员都有所帮助。

通过微阵列平台和RNA测序技术，研究人员能够同时测量大量转录本的表达水平，从而在模式生物和非模式生物中产生了大量将转录本表达与特定表型相关联的数据集。这些数据集为科研人员提供了极为丰富的资源，若采用大数据整合方法将相关数据集进行整合，其研究价值可进一步提升。然而，该方法通常仅限于具备特定生物信息学技能的研究人员使用。本文介绍了一款名为IR-TEx的程序（此前由Ingham等人1发表），该程序基于R语言开发的Shiny2软件包编写，使缺乏生物信息学背景的用户也能相对轻松地对这些数据集进行整合与深入分析。
IR-TEx 位于 <a href="http://www.lstmed.ac.uk/projects/IR-TEx" target="_blank">http://www.lstmed.ac.uk/projects/IR-TEx</a>，该工具旨在研究与冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）杀虫剂抗性相关的转录本，冈比亚按蚊是非洲主要的疟疾传播媒介1。疟疾是一种由疟原虫属（Plasmodium）物种引起的寄生虫病，通过雌性按蚊（Anopheles）叮咬在人类之间传播。使用杀虫剂靶向控制蚊媒已被证明是预防非洲疟疾发病率和死亡率最有效的方法。自2000年以来，防控工具（例如长效杀虫蚊帐）的大规模推广在显著降低疟疾病例方面发挥了关键作用3。由于可用的杀虫剂种类极为有限，蚊虫面临强烈的进化压力，目前杀虫剂抗性已在非洲疟疾传播媒介中广泛存在4。
此外，靶标位点突变5和杀虫剂的代谢降解6,7仍是抗性机制研究的主要方向，但其他重要的抗性机制也正在逐渐被揭示1。许多这类新机制此前并未与杀虫剂抗性相关联，但通过使用IR-TEx应用程序在多个抗性种群中搜索共同的基因表达模式而被发现，并随后通过基因组学方法进行了功能验证1。
本文介绍了一步一步使用IR-TEx的方法，包括在网页端和本地安装环境下的操作流程。该方案描述了如何将新的杀虫剂抗性数据集整合到现有软件包中，并解释了如何处理缺失数据。最后，本文还说明了如何将该软件用于与杀虫剂抗性无关的其他组学（-omics）数据集，从而在整合不同组学方法数据的同时，处理缺失值和数据标准化问题，使各类数据具有可比性。

<table><tbody><tr><td>配备浏览器的笔记本电脑</td><td>任意</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>R 程序</td><td>统计计算用 R 项目</td><td>-</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.r-project.org/&quot; target=&quot;_blank">https://www.r-project.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>R Studio</td><td>R Studio</td><td>-</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.rstudio.com/&quot; target=&quot;_blank">https://www.rstudio.com/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

ir-tex：一种面向疟疾媒介的开源大数据转录组学数据整合工具 anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx 是一个使用 Shiny（R 语言的一个软件包）编写的程序，可用于探索与冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）杀虫剂抗性表型相关的转录本表达情况，并为其分配功能。该程序可在线使用，也可由任何人下载并在本地运行。本地版本的程序可进行修改，以添加来自多种组学平台的新型杀虫剂抗性数据集。本指南演示了如何添加新数据集以及如何处理缺失数据。此外，IR-TEx 可以被完全且便捷地重新编码，以适用于任何实验产生的组学数据集，使其成为众多研究人员的宝贵资源。本实验方案以微粒体谷胱甘肽转移酶 GSTMS1 为例，说明了 IR-TEx 在鉴定新型杀虫剂抗性候选基因方面的应用价值。该转录本在来自科特迪瓦和布基纳法索的多个拟除虫菊酯抗性蚊群中均呈上调表达。通过鉴定与其共表达的转录本，可进一步揭示该基因的潜在生物学功能。

利用 IR-TEx 附带的 Fold_Changes.txt 文件，我们将抗性伊蚊库兹氏按蚊（Anopheles coluzzii）和冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）数据集中的显著差异表达转录本与来自科特迪瓦和布基纳法索的敏感型对照进行了比较。结果筛选出 18 个目标转录本（表 1；该分析可通过 Excel、R 或其他程序完成）。其中两个转录本——ATP 酶（AGAP006879）和 α-晶状体蛋白（AGAP007160）——已有文献报道，前者对拟除虫菊酯类抗性具有显著影响1。除这两个转录本外，还发现了两个解毒相关转录本：GSTMS1（FCµ = 1.95 和 1.85）和 UGT306A2（FCµ = 2.29 和 2.28）。
如前所述1，对其中两个转录本（GSTMS1，一种解毒相关转录本；以及 AGAP009110-RA，一种功能未知、蚊媒特异性的含有 β-1,3-葡聚糖结合结构域的转录本）进行了 qPCR 验证。使用 附加文件 3 中描述的引物组进行分析，结果显示，与实验室敏感品系 N'Gousso 相比，这两个转录本在中国台湾科特迪瓦（Tiassalé）和布基纳法索（Banfora）的多重抗性蚊群中均显著上调（图 4A）。
由于这两个转录本在所有抗性种群中均表现出显著上调，因此在来自LSTM实验室Tiassalé品系的蚊虫中进行了RNAi介导的基因敲低实验。该品系源自科特迪瓦，对公共卫生中使用的各类主要杀虫剂均具有抗性，如先前所述1,10。敲低GSTMS1的表达后，与注射GFP的对照组相比，氯氰菊酯暴露后的死亡率显著升高（p = 0.021），表明该转录本在拟除虫菊酯抗性中具有重要作用（图4B）。相反，AGAP009110-RA的敲低在暴露后并未引起死亡率的显著变化（p = 0.082）（图4B）。
GSTMS1 是一种微粒体谷胱甘肽S-转移酶（GST），也是在A. gambiae蚊子中发现的三种此类酶之一11。尽管ε类和δ类GST家族成员此前已被证实参与杀虫剂的解毒过程12,13,14，但据我们所知，这是首次发现微粒体GST在拟除虫菊酯抗性中发挥作用的证据15。为了探究该转录本在Anopheles gambiae sl蚊子中的潜在功能，研究鉴定了其在IR-TEx中的表达情况及相关性。GSTMS1在该物种现有的21个数据集中有20个表现出显著过表达，仅比奥科岛例外。在每个地区，其过表达水平与敏感种群相比均低于五倍（图5）。
由于微粒体谷胱甘肽S-转移酶（microsomal GSTs）长期以来一直被忽视作为潜在的杀虫剂解毒因子，因此关于其在杀虫剂抗性中的作用知之甚少15。通过分析其他转录本的共相关性，可基于共调控或参与相同通路的假设来阐明其推测功能。为了在相关性网络中最大化分析效力，选择了IR-TEx中所有可用的基因芯片数据集，并设定相关系数绝对值 |r| > 0.75。 表2 显示了来自IR-TEx的分析结果。
在DAVID功能注释工具中，这些转录本在氧化还原酶活性以及葡萄糖/碳水化合物代谢方面显著富集8。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和谷胱甘肽γ-裂解酶均可维持哺乳动物细胞中谷胱甘肽的水平16,17，因此与谷胱甘肽S-转移酶GSTMS1直接相关。过氧化氢酶是一种快速响应氧化应激的酶，可保护细胞免受活性氧物种的损伤，而活性氧是拟除虫菊酯暴露的副产物。伐昔洛韦水解酶是一种水解酶，可能在哺乳动物细胞的解毒过程中发挥作用18。CYP4H17也出现在相关性网络中。细胞色素P450酶可直接代谢拟除虫菊酯类杀虫剂，其降解产物可进一步被谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）代谢。最后，已有研究指出CYP4H17与A. funestus中拟除虫菊酯抗性相关19。综上所述，这些数据强烈支持GSTMS1在异源物质解毒中发挥重要作用。
<img alt="基因表达折线图，不同样本中的Log2倍数变化；数据分析可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60721/60721fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：对数2 所有数据集中 AGAP002865-RA 的倍数变化。 横轴列出了不同的数据集，相关信息可参见先前发表文章中的补充表11，y轴显示对数值2 目标转录本的倍数变化。浅灰色虚线表示显著性的近似阈值，此处设定为倍数变化为 &lt;0.8 或倍数变化 &gt;1.2. 黑色虚线表示1倍变化（即抗性群体与敏感群体之间基因表达无差异）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60721/60721fig1alarge.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示非洲事件集群的地图，彩色标记表示严重程度级别。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60721/60721fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：显示抗性群体中 AGAP002865-RA 显著差异表达的微阵列分布。 差异倍数变化采用交通灯系统表示：绿色表示倍数变化 &lt;1，橙色表示倍数变化 &gt;1，红色表示倍数变化 &gt;5。仅显示具有显著差异表达（p ≤ 0.05）的数据集。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60721/60721fig2alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="基因表达分析图、Log2倍数变化、比较数据、转录本定量" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60721/60721fig3a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：AGAP001076-RA（CYP4G16）的相关性网络。 在全部31个微阵列数据集中，对所有转录本进行两两相关性计算，并应用用户自定义的阈值。图中显示的是（A）|r| &gt; 0.9 和（B）|r| &gt; 0.8。图中展示的所有转录本均满足该阈值条件，并与 AGAP001076-RA 的表达变化一致。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60721/60721fig3alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示AGAP000165、AGAP009110的死亡率的柱状图；Tiassalé和Banfora的GFP注射分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60721/60721fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：GSTMS1 和 AGAP009110-RA 抑制后的 mRNA 表达及表型变化。（A）分别来自科特迪瓦和布基纳法索的两个多重抗性An. coluzzii种群中GSTMS1和AGAP009110-RA的mRNA表达水平。以实验室敏感型An. coluzzii N'Gousso为对照进行比较。显著性水平通过单因素方差分析（ANOVA）结合事后Dunnett检验计算得出。（B）与注射GFP的对照组相比，两种转录本经RNA干扰（RNAi）诱导后的表达抑制情况。GSTMS1的抑制在氯氟氰菊酯暴露后显示出显著升高的死亡率（通过单因素方差分析结合事后Tukey检验计算；*p ≤ 0.05，**p ≤ 0.01）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60721/60721fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示西非和中非研究地点地理位置的地图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60721/60721fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：Anopheles gambiae 和 Anopheles coluzzii 种群中 GSTMS1 的表达情况。 该地图显示了在现有的基因芯片数据集中 GSTMS1 显著差异表达的情况。GSTMS1 在21个基因芯片数据集中的20个中表现出显著差异表达。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60721/60721fig5alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>转录本ID</td>
			<td>描述</td>
			<td>布基纳法索</td>
			<td>科特迪瓦</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP006879-RA</td>
			<td>ATP酶</td>
			<td>27.94</td>
			<td>43.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP007160-RB</td>
			<td>a-晶体蛋白</td>
			<td>11.49</td>
			<td>10.58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP007160-RC</td>
			<td>a-晶体蛋白</td>
			<td>11.14</td>
			<td>10.38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP007160-RA</td>
			<td>a-晶体蛋白</td>
			<td>9.78</td>
			<td>9.84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP009110-RA</td>
			<td>未知</td>
			<td>9.26</td>
			<td>5.96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP007780-RA</td>
			<td>NADH脱氢酶</td>
			<td>10.49</td>
			<td>3.77</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP006383-RA</td>
			<td>寡糖基转移酶复合体β亚基</td>
			<td>3.69</td>
			<td>5.57</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP007249-RB</td>
			<td>Flightin蛋白</td>
			<td>4.61</td>
			<td>3.86</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP003357-RA</td>
			<td>RAG1激活蛋白1样蛋白</td>
			<td>4.31</td>
			<td>4.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP007249-RA</td>
			<td>Flightin蛋白</td>
			<td>4.48</td>
			<td>3.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP001998-RA</td>
			<td>mRpS10</td>
			<td>3.46</td>
			<td>2.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP007589-RA</td>
			<td>UGT306A2</td>
			<td>2.29</td>
			<td>2.28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP000165-RA</td>
			<td>GSTMS1</td>
			<td>1.95</td>
			<td>1.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP002101-RA</td>
			<td>异亮氨酰-tRNA合成酶</td>
			<td>0.57</td>
			<td>0.59</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP002969-RA</td>
			<td>天冬酰胺酰-tRNA合成酶</td>
			<td>0.45</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP004199-RA</td>
			<td>溶质载体家族5（钠偶联单羧酸转运蛋白），成员8</td>
			<td>0.35</td>
			<td>0.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP004684-RA</td>
			<td>rRNA加工蛋白CGR1</td>
			<td>0.36</td>
			<td>0.22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAP006414-RA</td>
			<td>Cht8</td>
			<td>0.024</td>
			<td>0.36</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：在布基纳法索和科特迪瓦种群中相同倍数变化方向上显著差异的转录本。 转录本ID、基因描述以及来自代表An. coluzzii和An. gambiae种群的两个国家各自数据集的平均倍数变化。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>相关性</td>
			<td>系统名称</td>
			<td>转录本类型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>AGAP000165-RA</td>
			<td>GSTMS1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.82</td>
			<td>AGAP004904-RA</td>
			<td>过氧化氢酶</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.76</td>
			<td>AGAP007243-RA</td>
			<td>26S 蛋白酶调节亚基 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.79</td>
			<td>AGAP008358-RA</td>
			<td>CYP4H17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.76</td>
			<td>AGAP009436-RA</td>
			<td>伐昔洛韦水解酶</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75</td>
			<td>AGAP010739-RA</td>
			<td>葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.85</td>
			<td>AGAP011172-RA</td>
			<td>胱硫醚γ-裂解酶</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.76</td>
			<td>AGAP012678-RA</td>
			<td>葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：与之共相关的转录本 GSTMS1. 该表格展示了相关性网络的输出结果 GSTMS1 在IR-TEx上，|r|为 &gt;0.75。该表格列出了每个共相关转录本的Spearman相关系数、转录本ID和基因描述。
附加文件 1：使用 limma 分析 A-MEXP-2196 芯片阵列的输出文件。 该文件来源于一项 Met 基因敲低实验与 GFP 对照组芯片阵列的比较，更多细节参见 ArrayExpress（编号 E-MTAB-4043）及另一篇先前发表的研究1。各列分别代表 AGAP 标识符（SystematicName）、对数倍数变化（logFC）、对数表达值（AveExpr）、t 统计量（t）、未校正的 p 值（P.Value）、校正后的 p 值（adj.P.Val）以及 B 统计量（B）20。本文件中所涉及的蚊虫为中国科特迪瓦地区的Anopheles coluzzii，未接触过杀虫剂，采集地纬度和经度分别为 -5.4 和 6.0。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60721/additional_file1.txt" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键可下载）。</a>
附加文件 2：RNAseq 实验的输出文件。 RNAseq 分析数据来自 Uyhelji 等人9，描述了按蚊（Anopheles）在暴露于 50% 盐度时转录组的变化。该文件改编自该论文的表 S2，包含 AGAP 标识符（SystematicID）、原始倍数变化（Fold_Change）以及校正后的 p 值（q_value）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60721/additional_file2.txt" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键点击可下载）。</a>
附加文件 3：代表性结果的引物列表。 每个转录本的 AGAP 编号、基因名称、dsRNA 正向引物、dsRNA 反向引物、qPCR 正向引物和 qPCR 反向引物序列。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60721/additional_file3.txt" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。</a>
补充代码文件 1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60721/Supplemental_coding_File_1.R" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键点击可下载）。</a>
补充代码文件 2。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60721/Supplemental_coding_File_2.R" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。</a>
补充编码文件 3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60721/Supplemental_coding_File_3.R" target="_blank">请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。</a>

IR-TEx 用于研究冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）中与杀虫剂抗性相关的转录谱。本文提供了使用该应用程序的完整说明，探索多个转录组数据集的修改方法，以及利用该框架为来自任何生物体、在任何平台上生成的转录组数据集合构建交互式数据库的方法。

IR-TEx：一种面向疟疾媒介的开源大数据转录组学数据整合工具 Anopheles gambiae

IR-TEx 是一个使用 Shiny（R 语言程序包）编写的应用程序，可用于探索转录本的表达情况，并为其分配功能……

本方案具有重要意义，因为这是首次将冈比亚按蚊的转录组数据集中、免费且便捷地公开。该技术使得所有研究人员，即使不具备生物信息学背景，也能自由、便捷地获取其关注基因及杀虫剂抗性蚊虫的表达数据。首先，请点击LSTM IR-TEx项目页面底部的链接，在网络浏览器中运行IR-TEx网络应用程序。网页初始化完成后，点击页面顶部的“Application”按钮，即可显示应用程序及其相关输出结果。阅读转录本ID输入框中默认条目对应的各项输出。选择暴露于拟除虫菊酯类杀虫剂的条件及相应的按蚊（Anopheles Coluzzii）数据集，或未暴露于任何杀虫剂类别的数据集，并筛选出相关系数大于0.98的关联转录本。为了研究目标转录本的表达情况，首先选择该转录本。然后将转录本 ID 输入至转录本 ID 输入框中，并注意转录本编号以 RX 结尾，具体取决于所关注的异构体。通过勾选相应的复选框来选择要分析的数据集，包括国家、暴露状态、目标物种以及目标杀虫剂类别。确保这些条件筛选出的数据集数量超过一个。在选择菜单底部点击“更新视图”或按回车键，暂时忽略绝对相关性值。等待应用程序完成更新。第一个图表显示了在满足所选条件的每个数据集中，抗性蚊群与实验室易感蚊群之间目标转录本的 Log2 倍数变化。请阅读图表下方的信息，其中包含每个相关数据集中抗性蚊与易感蚊之间的倍数变化以及相应的校正后 P 值。每一行代表微阵列上的单个探针。请阅读下方的附加表格，其中包含目标转录本具有显著性的实验数量，以及符合所选条件的实验总数。要以制表符分隔的格式下载数据，请点击两个表格下方的“下载”按钮。这使用户能够使用 Excel 等程序更方便地探索数据。地图上的每个点代表各数据集中抗性蚊虫的大致采集地点，这些地点中目标转录本呈差异表达。颜色遵循应用程序中说明的交通灯系统。通过右键单击图形输出，选择“另存为图像”，并选择合适的文件夹来保存图像结果。如果应用程序出现输出错误，可能是由于没有数据集符合输入的条件。通过多个数据集间转录本表达模式的相关性分析，可用于预测转录本功能，并有可能揭示来自同一通路的共调控转录本。在点击“更新视图”之前，将绝对相关性值滑块移至0.85，然后点击“更新视图”或按回车键。查看相关性表格，找出当前显示的多个转录本，这些转录本与输入的转录本具有相关性。阅读图形输出下方的表格，其中包含每个转录本的相关性数值。如需以制表符分隔的格式下载数据，请点击“下载”按钮。调节绝对相关性值滑块，观察最下方图表和表格中的任何变化。相关性值的严格性越低，显示的转录本越多，但会引入更多噪声。IR-TEx 安装完成后，打开 RStudio 补充代码文件1，逐行运行以设置 IR-TEx 系统。当所有软件包均成功安装并按要求更新后，进入“文件”菜单，选择“打开”。找到 IR_TEx.r 文件，选中并打开。现在应在 RStudio 的顶部窗口中可见。要运行该应用程序，请点击窗口右上角的“Run App”按钮。随后将弹出第二个窗口，应用程序将在其中加载。加载完成后，为实现全部功能，请点击加载窗口右上角的“在浏览器中打开”。用户可按照 TEx 方案中所述方法，将使用冈比亚按蚊 15k Agilent 芯片生成的抗性数据集添加到 IR-TEx。打开 Additional File2.txt。此RNA分析文件为新数据应遵循的模板。A列为标识符，B列为原始倍数变化（Fold Change），C列为校正后的P值。运行R代码，将不同平台的标识符匹配并整合为一个以制表符分隔的文件，然后对数据进行整理和标准化。说明包含在文件中。任何文件路径在 Mac OS 中将用正斜杠分隔，而在 Windows 中将用双正斜杠分隔。请备份原始文件。将补充涂层文件2结束时生成的文件输出至指定位置，以供下一步使用。补充编码文件2将生成一个新的Fold_Changes.txt文件。运行补充代码文件3中包含的代码。在指定为文件路径的文件夹中找到名为 FC_DistribPlot.png 的输出文件。检查 Log2 倍数变化的分布情况，以确认不同数据集之间的 Log2 倍数变化分布几乎相同。图中显示的是来自科特迪瓦和布基纳法索的两种多药抗性冈比亚按蚊（Anopheles Coluzzii）群体中 GS TMS1 和 AGAP 009110 RA 的 mRNA 表达水平。与实验室敏感型冈比亚按蚊 N-Guzo 相比，这些转录本在两个独立的多药抗性群体中均显著上调。在来自LSTM实验室T-Oscillae品系的蚊子中进行了RNAi诱导的基因敲低实验。该品系源自科特迪瓦，对公共卫生中使用的所有主要类别的杀虫剂均具有抗性。在暴露于Delta Matheran后，与注射GFP对照组相比，GS TMS1转录本表达减弱导致死亡率显著升高，表明该转录本在拟除虫菊酯抗性中具有重要作用。相反，AGAP 009110 RA 的敲低在暴露后并未导致死亡率发生显著变化。在该物种现有的21个微阵列数据集中，GST MS1 在20个中显著过表达。在每个地区，与易感种群相比，抗性种群的倍数变化显著更高。所有数据集均来自多年间开展的不同实验，最初并非为基于微分析的严谨方法而设计，因此可能需要降低常规的 P 值严格性。可使用其他杀虫剂及生活史性状进一步开展表型敲低评估。若结果足够理想，后续寄生实验可进一步确定该蛋白的功能。该技术是首次整合冈比亚按蚊复合种杀虫剂抗性转录组学数据并将其提供给该领域所有研究人员的应用。

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定点 φC31介导的整合与盒式交换 按蚊属 疟疾的传播媒介

本文介绍了一种从原始测序数据到功能分析的完整RNA测序转录组数据分析流程，包括质量控制和预处理步骤，以及高级统计分析方法。...

高通量转录组分析用于研究宿主-病原体相互作用

本文介绍了一种利用磁珠提取蚊虫DNA的方案，可获得高质量的DNA提取物。这些提取物适用于后续的高通量测序分析。...

一种基于磁珠的蚊虫DNA提取方案及其在下一代测序中的应用

显微注射技术对于将外源基因导入蚊子基因组至关重要。本方案介绍了James实验室用于向Anopheles...

Anopheles gambiae 胚胎的显微注射方法

通过细菌产生的双链RNA（dsRNA）进行口服给药，是一种常用于Caenorhabditis...

有效的口服RNA干扰（RNAi）给药至成年Anopheles gambiae蚊子

本视频展示了在实验室中饲养冈比亚按蚊的一般技术。通过该生物体从幼虫到蛹再到吸血成虫的整个生命周期，演示了实验室蚊虫饲养的各个环节。...

冈比亚按蚊（A. gambiae）的饲养方案

了解IR-TEx开源数据集成工具，用于分析Anopheles gambiae疟疾病媒的杀虫剂抗性转录组数据。该工具无需生物信息学背景即可实现数据可视化与相关性分析，助力研究人员探索基因表达模式并制定病媒控制策略。

IR-TEx：一种面向疟疾媒介的开源大数据转录组学数据整合工具 Anopheles gambiae

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