基于 TurboID 的接近标签，用于蛋白质-蛋白质相互作用网络的植物中识别

NLR免疫受体在调节植物防御各种病原体方面起着至关重要的作用。我们描述了一种基于 TurboID 的接近标记方法，用于识别包含 NL 的 Toll/白细胞-1 受体域的相互作用伙伴，例如尼科蒂亚娜本thamiana 植物中的免疫受体。该协议为研究其他植物物种中的蛋白质-蛋白质相互作用提供了重要的参考，可以扩展到尼科蒂亚娜本thamiana感兴趣的任何蛋白质。

与传统方法相比，基于 TurboID 的接近标记方法具有明显的优势，因为它可用于捕获体内的瞬态或弱蛋白-蛋白质相互作用。首先在潮湿的土壤中高密度地种植N.benthamiana种子。将它们保持在23至25摄氏度的18小时光线和8小时黑暗照度的气候室中。

将植物留在室内约四个星期，直到它们长到四到八的叶阶段，以便随后进行农业渗透。构建 TurboID 融合，并将质粒转化为农业细菌，如文本协议中描述的那样。使用一毫升无针注射器渗透到完全成熟的N.benthamiana叶的阿巴克斯表皮的孵化。

在过滤后36小时，将200微摩尔生物素渗透到叶子中，并在收获叶组织前再维持植物3至12小时。要收集叶样本，切开花叶底部的渗透叶，去除叶静脉，并在液氮中闪冻组织。用刺和砂浆研磨叶组织，并在零下80摄氏度的15或50毫升猎鹰管中储存粉末。

要提取总蛋白，将约0.35克叶粉转移到两毫升管中。在这个过程中，一定要将组织保持在液氮中的低温。在粉末中加入700微升的RIPA裂解缓冲液。

将管子漩涡10分钟，将样品留在冰上30分钟，每4至5分钟将管子反转一次。在4摄氏度下将管子以2万倍g离心10分钟。然后收集上一液。

通过脱盐柱运行样品，去除释放生物素。拆下柱底部的密封器，并将其放在 50 毫升管中。然后松开盖子，在1000倍的g和4摄氏度的温度下将柱子离心两分钟。

将脱盐柱放在新鲜 50 毫升管中，用 5 毫升 RIPA 裂解缓冲液平衡柱三次。在1000倍的g和4摄氏度下离心两分钟，每次丢弃流经。在平衡柱中的树脂顶部加入1.5毫升蛋白质提取物。

当提取物进入树脂时，再加入100微升的RIPEA裂解缓冲液。离心柱两分钟，将脱盐样品留在冰上，直到进一步使用。要量化脱盐蛋白提取物，请使用 Bio-Rad 分光光度计测量 OD595。

根据梯度 BSA 溶液的值绘制标准曲线，并计算脱盐蛋白样品的浓度。在室温下，用一毫升RIP裂解缓冲液平衡链球菌C1结合磁珠，一分钟。使用磁架吸收珠子三分钟，轻轻吸气溶液。

然后重复洗涤一次。将蛋白质提取物转移到平衡磁珠上，在旋转器上隔夜在四摄氏度下孵育管子，以亲和地纯化蛋白质。第二天，用磁架捕捉珠子，吸上一代。

接下来，用1.7毫升的洗涤缓冲液清洗珠子，将珠子加入管子，并在转子上孵育8分钟。如前所述，取出上流液，用 1.7 毫升洗涤缓冲液 2 和洗涤缓冲液 2 重复洗涤。加入1.7毫升50毫升三叶草HCL去除洗涤剂。

然后将管子放在磁架上，取出上一液。用一毫升 50 毫升 Tris HCL 重复洗涤，然后将珠子转移到新的 1.5 毫升管中。最后，用50毫摩尔碳酸氢盐缓冲液洗六次珠子，每次洗涤5分钟。

使用100微升珠进行免疫布洛特分析，以确认生物素化蛋白的富集，并闪冻结样品的其余部分，储存在零下80摄氏度。西方的斑点被用来分析农业渗透的N.benthamiana叶中的蛋白质表达和生物基化。渗透叶中的生物素化蛋白与链球菌C1结合磁珠有效丰富，用于后续质谱分析。

不同大小的蛋白质被捕获，西方对富集蛋白质的印迹分析显示涂片带。尝试此过程时，请记住拆下脱盐柱底部的密封器，并在每次离心前松开盖。该协议很容易适应尼科蒂亚娜本thamiana感兴趣的其他蛋白质，也可用于在其他植物物种中扩展TurboID PL。