Name: 基于 TurboID 的接近标签，用于蛋白质-蛋白质相互作用网络的植物中识别 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 学习TurboID邻近标记技术，用于在Nicotiana benthamiana植物中识别NLR免疫受体的蛋白质相互作用网络。该方法可捕获瞬时或弱相互作用，适用于多种植物物种的蛋白质互作研究。

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本工作得到了国家转基因科学与技术计划（2019ZX08010-003，授予Y.Z.）、国家自然科学基金（31872637，授予Y.Z.）、中央高校基本科研业务费专项资金（2019TC028，授予Y.Z.）以及NSF-IOS-1354434、NSF-IOS-1339185和NIH-GM132582-01（授予S.P.D.K.）的资助。

注意：方法的概述见图1。
1. 植物材料准备
<ol>
	<li>将N. benthamiana种子高密度种植于湿润土壤中，并在气候培养箱中培养，光照周期为16小时光照（约75 μmol/m2s）和8小时黑暗，温度保持在23–25 °C。</li>
	<li>约1周后，将每株幼苗小心移栽至4' x 4'的花盆中，并继续将幼苗置于同一培养箱中培养。</li>
	<li>在培养箱中继续培养植株约4周，直至植株生长至4–8片叶阶段，用于后续的农杆菌浸润实验15。</li>
</ol>
2. TurboID 融合蛋白的构建
<ol>
	<li>使用标准的分子克隆技术，将目标蛋白与 TurboID 融合（通过 Addgene 质粒 #107177 中的 PCR 扩增获得 TurboID）。在此实验中，我们选用 NLR 免疫受体的 N 端 TIR 结构域作为目标蛋白，并构建了在花椰菜花叶病毒 35S 启动子（p35S::TIR-TurboID）驱动下的 TIR-TurboID 融合蛋白。 
	注意：TurboID 酶与目标蛋白的羧基末端或氨基末端融合，取决于具体的目标蛋白。通常情况下，对于细胞质蛋白，只要 TurboID 融合不影响目标蛋白的功能，两个末端均可接受。然而，对于定位于膜上的蛋白，在确定 TurboID 融合位点之前，应预先明确该蛋白的拓扑结构。</li>
	<li>在同一启动子下构建 TurboID 融合的柠檬黄色荧光蛋白（citrine），作为后续定量蛋白质组分析的对照。 
	注意：构建 TurboID 融合对照对于鉴定与目标蛋白邻近的蛋白质组至关重要。TurboID 融合对照的表达水平应与 TurboID 融合目标蛋白相近，可通过农杆菌浸润过程中调整农杆菌（Agrobacterium）浓度来经验性地优化。此外，对照蛋白的亚细胞定位模式应与目标蛋白相似。</li>
</ol>
3. 农杆菌浸润
<ol>
	<li>质粒转化 农杆菌
	<ol>
		<li>将步骤 2.1 和 2.2 中获得的质粒各 0.5 μg 加入 50 μL 的 根癌农杆菌 GV3101 感受态细胞，按先前所述方法制备16. 
		注意：其他 农杆菌 菌株（如 GV2260）也可使用。</li>
		<li>冰上孵育30分钟。</li>
		<li>在42 °C水浴中热激60秒。</li>
		<li>加入400 μL LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl；pH = 7.0）至 农杆菌 在28 °C下孵育90分钟。</li>
		<li>将试管中的全部内容物接种于添加了适当抗生素的LB琼脂平板上，以筛选质粒，并用于后续实验 农杆菌 （对于GV3101：50 mg/L庆大霉素和50 mg/L利福平）。</li>
		<li>在28 °C下孵育平板36–48小时，直至出现可见的单菌落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>挑取数个单菌落，在含抗生素的新鲜LB琼脂平板上划线（见步骤3.1.5），于28 °C过夜培养。 
	注意：对菌落进行PCR以确认特定双元载体的存在更为理想 农杆菌根据我们的经验，超过95%的菌落含有导入的双元载体。</li>
	<li>接种3 mL含适当抗生素（见步骤3.1.4）的LB培养基 农杆菌 含有目标构建体的菌落，于28 °C振荡培养过夜，直至OD600 的 农杆菌 培养物达到2.0。</li>
	<li>将细胞在 3,000 x g 并重悬至OD600 = 1.0，置于农杆菌浸润缓冲液（10 mM MgCl₂）中2，10 mM MES（pH = 5.6），250 μM 乙酰丁香酮。 
	注意：尽管在农杆菌浸润前于室温下将接种物孵育2小时为最佳条件，但根据我们使用GV3101菌株的经验，目标蛋白的表达水平在孵育与未孵育之间差异并不显著 与 无需孵育。</li>
	<li>使用1 mL无针注射器将接种物注入完全成熟叶片的（远轴面）表皮 N. benthamiana 叶片 
	注意：为准备三个生物学重复所需的足够叶片材料，通常每株植物注射三片叶片，每片完整的叶片均进行注射，每个载体使用三至四株植物。每片叶片注射1.5–2.0 mL重悬的农杆菌菌液即可。</li>
	<li>接种后36小时（hpi），用200 μM生物素（溶于10 mM MgCl₂）进行浸润2 将溶液注入已用TurboID质粒预浸润的叶片中。</li>
	<li>在按照第4节所述收获叶片组织之前，将植物继续培养3–12小时。 
	注意：选择在感染后36小时进行生物素渗透的原因是，根据以往研究，目标蛋白的表达在此时间点达到峰值11建议确定目标蛋白表达达到最佳所需的时间。生物素渗透后的孵育时间取决于实验设计及所研究的目标蛋白。通常，3–12小时的生物素处理可使TurboID融合蛋白对目标蛋白邻近的大多数蛋白进行有效标记。</li>
</ol>
4. 叶片样品采集
注意：后续处理叶片样品时，应佩戴无菌手套，以避免样品受到角蛋白污染。所有试剂也应尽可能不含角蛋白。
<ol>
	<li>在叶柄基部切下浸润的叶片，去除叶脉，然后将叶片组织在液氮中迅速冷冻。</li>
	<li>使用研钵和研杵研磨叶片组织，并将叶片粉末储存于15 mL或50 mL离心管中，于-80 °C保存以备后续使用。 
	注意：从不同植株中分别取三到四片叶片作为三个生物学重复。本方案可在此暂停。在进行后续步骤前，建议通过免疫印迹分析检测目标蛋白的表达及生物素化情况。典型的Western blot结果见图2。</li>
</ol>
5. 叶片总蛋白的提取
<ol>
	<li>取约 0.35 g 叶片粉末转移至 2 mL 离心管中。每个样品准备两管。 
	注意：接触任何经液氮冷却的物体时，请佩戴手套。</li>
	<li>向 0.35 g 叶片粉末中加入 700 µL RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH = 7.5]，500 mM NaCl，1 mM EDTA，1% NP40 [v/v]，0.1% SDS [w/v]，0.5% 脱氧胆酸钠 [w/v]，1 mM DTT，1 片蛋白酶抑制剂混合物）。</li>
	<li>涡旋振荡管子 10 分钟。</li>
	<li>将样品置于冰上静置 30 分钟。</li>
	<li>每隔 4–5 分钟将离心管上下颠倒数次，以混匀内容物。</li>
</ol>
6. 通过脱盐去除游离生物素
注意：本步骤约需 50 分钟。
<ol>
	<li>平衡脱盐柱。
	<ol>
		<li>移除脱盐柱底部的密封盖，将柱置于一个50 mL离心管中。</li>
		<li>在1000 × g、4 °C条件下离心2分钟以去除保存液，并确保盖子已松开。</li>
		<li>将脱盐柱放入一个新的50 mL离心管中。用5 mL RIPA裂解缓冲液重复平衡3次，每次在1000 × g、4 °C条件下离心2分钟，并弃去穿流液。</li>
		<li>将脱盐柱转移至一个新的50 mL离心管中，暂时保存于4 °C，以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步骤5.4中的离心管在16,500 × g、4 °C条件下离心10分钟，然后将两管中的上清液转移至一个新的2 mL离心管中。</li>
	<li>将1,500 µL蛋白提取物加至已平衡的脱盐柱（来自步骤6.1.4）树脂顶部。当蛋白提取物进入树脂后，再加入100 µL RIPA裂解缓冲液。 
	注意：尽管从叶片中提取蛋白时使用了1,400 μL RIPA裂解缓冲液，但在蛋白提取和脱盐后总体积通常会略有增加。因此，按照步骤5.1和5.4所述合并每组样品后，每个样品至少可获得1,500 µL蛋白提取物。</li>
	<li>在1000 × g、4 °C条件下离心2分钟，随后将脱盐后的样品暂时置于冰上保存。</li>
</ol>
7. 使用 Bradford 法对脱盐后的蛋白质提取物进行定量
<ol>
	<li>配制每种梯度BSA溶液各50 µL：0 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL和1 mg/mL。</li>
	<li>将脱盐后的蛋白质提取物稀释：取5 µL样品与45 µL的ddH2O混合。</li>
	<li>通过将5x Bradford试剂（含100 mg考马斯亮蓝G250、47 mL甲醇、100 mL 85%磷酸和53 mL ddH2O）稀释来制备1x Bradford试剂。</li>
	<li>将每种梯度BSA溶液50 µL以及稀释后的蛋白质提取物50 µL分别加入2.5 mL的1x Bradford试剂中。</li>
	<li>室温孵育10分钟。</li>
	<li>将每份样品溶液200 µL加入ELISA板的一个孔中（每个样品设三个技术重复）。</li>
	<li>使用酶标仪测定OD595。</li>
	<li>根据梯度BSA溶液的测定值绘制标准曲线，并计算脱盐蛋白质样品的浓度。通常，从0.7 g叶片中获得的总蛋白浓度范围为3–6 mg/mL。</li>
	<li>为后续亲和纯化准备6–8 mg脱盐蛋白质提取物。</li>
</ol>
8. 生物素化蛋白的富集
<ol>
	<li>取 200 µL 链霉亲和素-C1 偶联的磁珠至 2 mL 离心管中。</li>
	<li>用 1 mL RIPA 裂解缓冲液在室温下平衡链霉亲和素-C1 偶联磁珠 1 分钟。</li>
	<li>每次洗涤后，将磁珠置于磁力架上吸附 3 分钟，然后用移液器轻轻吸除上清液。</li>
	<li>重复步骤 8.2 和 8.3。</li>
	<li>将脱盐后的蛋白提取物转移至已平衡的链霉亲和素-C1 偶联磁珠中。</li>
	<li>将离心管置于 4 °C 条件下，在旋转仪上孵育 12 小时（或过夜），以亲和纯化生物素化蛋白。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上室温静置 4 分钟，直至磁珠吸附至管壁一侧，然后用移液器轻轻吸除上清液。</li>
	<li>向离心管中加入 1.7 mL 洗涤缓冲液 I（水中含 2% SDS），在室温下置于旋转仪上孵育 8 分钟。重复步骤 8.3。</li>
	<li>向离心管中加入 1.7 mL 洗涤缓冲液 II（50 mM HEPES：pH = 7.5，500 mM NaCl，1 mM EDTA，0.1% 脱氧胆酸钠 [w/v]，1% Triton X-100），在室温下置于旋转仪上孵育 8 分钟。重复步骤 8.3。</li>
	<li>向离心管中加入 1.7 mL 洗涤缓冲液 III（10 mM Tris-HCl：pH = 7.4，250 mM LiCl，1 mM EDTA，0.1% 脱氧胆酸钠 [w/v]，1% NP40 [v/v]），在室温下置于旋转仪上孵育 8 分钟。重复步骤 8.3。</li>
	<li>加入 1.7 mL 50 mM Tris-HCl 缓冲液（pH = 7.5）以去除去垢剂，然后重复步骤 8.3。</li>
	<li>将磁珠转移至新的 1.5 mL 离心管中，并重复步骤 8.11 和 8.3。</li>
	<li>用 50 mM 碳酸氢铵缓冲液在室温下洗涤磁珠 6 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>向磁珠中加入 1 mL 50 mM 碳酸氢铵缓冲液并充分混匀。</li>
	<li>取 100 µL 磁珠用于免疫印迹分析，以确认生物素化蛋白的富集效果。典型的 Western 印迹结果见 图 3。</li>
	<li>将剩余的蛋白样品迅速冷冻，并于 -80 °C 保存，或立即置于干冰上送至实验室进行 LC-MS/MS 分析。 
	注：典型的质谱结果已在先前发表的文章中展示（Zhang et al. 2019；图 2，补充数据 1 和补充数据 2）11。完整数据集可通过标识符 MSV000083018 和 MSV000083019 在 MassIVE（网址：&#60;http://massive.ucsd.edu&#62;）获取。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何披露信息。

TurboID生物素连接酶是通过基于酵母展示系统的定向进化技术对BioID10改造而获得的。与其他邻近标记（PL）酶相比，TurboID具有多种优势。TurboID使得邻近标记技术可应用于其他模式生物系统，包括最适生长温度约为25 °C的果蝇和线虫10。尽管邻近标记技术已在动物系统中被广泛使用，但其在植物中的应用仍较为有限。本文所述方案提供了在模式植物弯孢状烟草（N. benthamiana）中建立基于TurboID的邻近标记技术的逐步操作流程，该植物已被广泛用于植物-病原体互作研究。本方案涵盖了叶片样品制备、游离生物素的去除、提取蛋白的定量以及生物素化蛋白的富集等步骤。
尽管动物细胞培养系统中的游离生物素可通过PBS缓冲液洗涤细胞而基本去除4，但叶片组织中的游离生物素无法通过简单的洗涤清除。最近一项研究表明，游离生物素会严重影响后续生物素化蛋白的富集效果11。在本实验方案中...

蛋白质相互作用（PPI）是多种细胞过程的基础。传统的蛋白质相互作用鉴定方法包括酵母双杂交（Y2H）筛选以及免疫共沉淀结合质谱分析（IP-MS）1。然而，这两种方法均存在一些局限性。例如，Y2H筛选依赖于目标植物或动物物种的Y2H文库是否可获得，而构建此类文库耗时且成本高昂。此外，Y2H实验是在异源的单细胞真核生物酵母中进行的，可能无法真实反映高等真核细胞的细胞内状态。
相比之下，免疫共沉淀-质谱联用技术（IP-MS）在捕获瞬时或弱相互作用的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）方面效率较低，且不适用于丰度低或高度疏水的蛋白质。许多参与植物信号通路的重要蛋白质，例如类受体激酶（RLKs）或NLR免疫受体家族，通常表达水平较低，并常与其他蛋白质发生瞬时相互作用。因此，这极大地限制了对这些蛋白质调控机制的理解。
近年来，基于工程化抗坏血酸过氧化物酶（APEX）及突变体的邻近标记（PL）方法 大肠杆菌 生物素连接酶 BirAR118G （称为 BioID）已被开发并用于蛋白质相互作用（PPIs）的研究2,3,4PL 的原理是将目标蛋白与一种酶融合，该酶可催化生成不稳定的生物素化腺苷酸（bio-AMP）。PL 酶释放出游离的 bio-AMP，扩散至目标蛋白附近，从而在约 10 nm 半径范围内对邻近蛋白的伯胺基团进行生物素标记。5.
与传统的酵母双杂交（Y2H）和免疫共沉淀-质谱（IP-MS）方法相比，该方法具有显著优势，例如能够捕获瞬时或弱相互作用的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。此外，邻近标记（PL）技术可在目标蛋白所处的天然细胞环境中，对其邻近蛋白进行标记。不同的PL酶在应用于不同系统时各有其局限性。例如，尽管APEX相较于BioID具有更快的标记动力学，并已在哺乳动物系统中成功应用，但该方法需要使用有毒的过氧化氢（H2O2），因此不适用于植物中的邻近标记研究。
相比之下，基于 BioID 的邻近标记（PL）无需使用有毒的 H2O2，但其标记速率较慢（完成生物素化需要 18–24 小时），因此对瞬时蛋白质相互作用（PPIs）的捕获效率较低。此外，BioID 实现高效邻近标记所需的较高孵育温度（37 °C）会对某些生物体（如植物）引入外部胁迫4。因此，基于 BioID 的邻近标记在植物中的应用较为有限，目前仅有少数报道，包括在水稻原生质体、Arabidopsis 和 N. benthamiana 中的应用6,7,8,9。最近报道的 TurboID 酶克服了 APEX 和基于 BioID 的邻近标记的缺陷。TurboID 表现出高活性，可在室温下 10 分钟内完成邻近标记10。基于 TurboID 的邻近标记已成功应用于哺乳动物细胞、果蝇和线虫10。最近，我们课题组及其他研究团队独立优化并拓展了基于 TurboID 的邻近标记技术在不同植物体系中的应用，包括 N. benthamiana 和 Arabidopsis 植物以及番茄毛状根11,12,13,14。比较分析表明，TurboID 在植物邻近标记中的表现优于 BioID11,14。该技术还通过鉴定出 NLR 免疫受体的多个新相互作用蛋白，证明了其在植物体内应用的稳健性11，而该类蛋白通常难以通过传统方法获得其相互作用伙伴。
本方案阐述了基于TurboID的邻近标记方法 在植株内 通过描述NLR免疫受体N端TIR结构域相互作用蛋白的鉴定 N. benthamiana 植物。该方法可扩展至任何感兴趣的蛋白质 N. benthamiana更重要的是，它为研究其他植物物种中的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）提供了重要参考，例如 拟南芥、番茄及其他作物。

<table><tbody><tr><td>721 分光光度计</td><td>Metash，中国制造</td><td>Q/SXFZ6</td><td>对于 OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; 测量</td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma</td><td>A6141-500G</td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>Sigma</td><td>B4639-1G</td><td>50 mM 储存液</td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>离心机 5702</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5417R</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete蛋白酶抑制剂混合物</td><td>罗氏</td><td>11697489001</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸</td><td>Sigma</td><td>D2510-100G</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇（DTT）</td><td>VWR生命科学</td><td>0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td>用于亲和纯化</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758-500G</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 板</td><td>康宁</td><td>Costar 3590</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-1KG</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-212</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P PVDF 膜</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>用于蛋白质印迹分析</td></tr><tr><td>8 M 氯化锂溶液（LiCl）</td><td>Sigma</td><td>L7026-500ML</td><td></td></tr><tr><td>低速冷冻离心机</td><td>Zonkia，中国制造</td><td>KDC-2046</td><td>用于脱盐</td></tr><tr><td>氯化镁六水合物（MgCl₂·6H₂O）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M9272-500G</td><td></td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Invitrogen</td><td>123.21D</td><td>用于珠子吸附</td></tr><tr><td>Multiskan FC 微孔板光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>N07710</td><td>对于OD&lt;sub&gt;595&lt;/sub&gt; 测量</td></tr><tr><td>NP-40（IGEPAL CA-630）</td><td>Sigma</td><td>I8896-100ML</td><td></td></tr><tr><td>抗HA大鼠单克隆抗体</td><td>罗氏</td><td>11867423001</td><td></td></tr><tr><td>旋转混匀仪</td><td>Kylin-Bell 实验室仪器</td><td>WH-986</td><td>用于免疫沉淀</td></tr><tr><td>震荡培养箱</td><td>实验室，中国制造</td><td>ZQPZ-228</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma</td><td>D2510-100G</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma</td><td>L4390-1KG</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-辣根过氧化物酶</td><td>Abcam</td><td>ab7403</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 碱</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>涡旋</td><td>科学工业公司</td><td>G-560E</td><td></td></tr><tr><td>水套式培养箱</td><td>中国产的蓝豹</td><td>GHP-9080</td><td>对于 &lt;em&gt;农杆菌&lt;/em&gt; 孵育</td></tr><tr><td>Zeba 脱盐柱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>89893</td><td>用于去除生物素</td></tr></tbody></table>

基于turboid的邻近标记法用于植物体内蛋白质-蛋白质相互作用网络的鉴定

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

利用工程化抗坏血酸过氧化物酶（APEX）的邻近标记（PL）技术 大肠杆菌 生物素连接酶BirA（即BioID）已成功用于鉴定哺乳动物细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。然而，该方法对有毒的过氧化氢（H₂O₂）的依赖带来了使用上的限制。2O2) 在基于 APEX 的邻近标记（PL）中，需要较长的生物素孵育时间（16–24 小时），而在基于 BioID 的邻近标记中，需要较高的孵育温度（37 °C），这些因素严重限制了它们在植物中的应用。最近报道的基于 TurboID 的邻近标记克服了 BioID 和 APEX 的诸多局限性。TurboID 能够在仅 10 分钟内快速实现蛋白质的邻近标记&#8201;在室温（RT）条件下进行。尽管TurboID在动物模型中的应用已得到证实，但我们最近的研究表明，在植物中，与BioID相比，基于TurboID的邻近标记（PL）在标记目标蛋白邻近蛋白方面表现更优。本文提供了一种以核苷酸结合富亮氨酸重复蛋白（NLR）家族N端Toll/白细胞介素-1受体（TIR）结构域为模型，用于鉴定蛋白质互作伙伴的分步实验方案。该方法包括载体构建、农杆菌浸润表达蛋白载体、生物素处理、蛋白质提取与脱盐、定量，以及通过亲和纯化富集生物素化蛋白。本文所述方案可轻松适用于研究植物中其他目标蛋白 烟草属 及其他植物物种。

代表性数据基于所述实验方案的预期结果，改编自Zhang等人的研究11。图1总结了在N. benthamiana中进行基于TurboID的邻近标记（PL）的操作流程。图2展示了在侵染的N. benthamiana叶片中目标蛋白的表达及生物素标记情况。图3显示，侵染叶片中生物素标记的蛋白质能够被高效富集，用于后续质谱分析。需要注意的是，在使用链霉亲和素-C1偶联磁珠富集生物素化蛋白后，捕获到了不同分子量大小的多种蛋白质，对富集产物进行Western印迹分析时观察到弥散条带（图3）。这一现象在近期发表的多项研究中均有报道6,7,13<sup...

本文介绍了一种用于鉴定Nicotiana benthamiana叶片组织中NLR免疫受体TIR结构域相互作用蛋白的邻近标记方法。同时提供了一份详细方案，可用于在Nicotiana及其他植物物种中利用该技术鉴定其他目标蛋白之间的相互作用。

基于TurboID的邻近标记法用于植物体内蛋白质-蛋白质相互作用网络的鉴定

利用工程化的抗坏血酸过氧化物酶（APEX）或大肠杆菌生物素连接酶BirA（称为BioID）的邻近标记（PL）技术已……

NLR免疫受体在介导植物抵御多种病原体的过程中发挥着关键作用。我们描述了一种基于TurboID的邻近标记方法，用于鉴定含有Toll/白细胞介素-1受体结构域的NLR（如本氏烟植物中的免疫受体）的相互作用蛋白伙伴。该方案为研究其他植物物种中的蛋白质-蛋白质相互作用提供了重要参考，并可扩展应用于本氏烟中任何目标蛋白的研究。基于TurboID的邻近标记方法相较于传统方法具有显著优势，因为它能够在体内捕获瞬时或微弱的蛋白质-蛋白质相互作用。首先将N. benthamiana种子高密度种植于湿润土壤中。随后将其置于气候培养箱中，在23至25摄氏度条件下，维持18小时光照和8小时黑暗的光周期。将植株置于培养室中约四周，直至其生长至四到八片叶的阶段，用于后续的农杆菌浸润。按照文本方案中的描述构建TurboID融合蛋白，并将质粒转化至根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）感受态细胞中。使用1毫升无针头注射器，将接种液浸润到本氏烟草（N. benthamiana）完全成熟的叶片的远轴表皮。过滤后36小时，将200微摩尔的生物素注入叶片，并继续培养植株3至12小时，随后收获叶片组织。采集叶片样品时，从叶柄基部剪下已注射的叶片，去除叶脉，并用液氮速冻组织。使用研钵和研杵研磨叶片组织，将粉末分装至15或50毫升Falcon管中，在-80°C下保存。为了提取总蛋白，将约0.35克叶片粉末转移至一个2毫升离心管中。在此过程中，务必使用液氮保持组织处于低温状态。向粉末中加入700微升RIPA裂解缓冲液。将离心管涡旋振荡10分钟，然后将样品置于冰上30分钟，每隔四到五分钟通过倒置离心管混合内容物。在4°C条件下以20,000 × g离心10分钟。随后收集上清液。通过脱盐柱去除游离的生物素。取下柱子底部的封盖，并将其放入一个50毫升的离心管中。然后松开盖子，在4°C条件下以1,000 × g离心2分钟。将脱盐柱置于新的50毫升离心管中，用5毫升RIPA裂解缓冲液重复平衡柱子三次。在4°C、1,000 × g条件下离心2分钟，每次弃去穿流液。将1.5毫升蛋白质提取物加至已平衡的柱子树脂顶部。当提取物进入树脂后，再加入100微升RIPA裂解缓冲液。将柱子离心两分钟，去盐后的样品置于冰上，待后续使用。为定量去盐后的蛋白质提取物，使用Bio-Rad分光光度计测定OD595。根据梯度浓度 BSA 溶液的数值绘制标准曲线，并计算脱盐后蛋白质样品的浓度。用 1 毫升 RIPA 裂解缓冲液在室温下平衡链霉亲和素 C1 偶联磁珠 1 分钟。使用磁力架吸附磁珠 3 分钟，然后轻轻吸除上清液。然后再次重复洗涤一次。将蛋白质提取物转移至已平衡的磁珠中，将离心管置于4°C条件下，在旋转仪上孵育过夜，以亲和纯化蛋白质。次日，使用磁力架捕获磁珠，并吸除上清液。接下来，向管中加入1.7毫升洗涤缓冲液一，将珠子洗涤一次，并在旋转器上孵育8分钟。按照前述方法去除上清液，并依次用1.7毫升洗涤缓冲液二和洗涤缓冲液三重复洗涤步骤。加入1.7毫升50毫摩尔的Tris HCl以去除去垢剂。然后将离心管置于磁力架上，吸除上清液。用1毫升50毫摩尔的Tris HCl再重复洗涤一次，并将磁珠转移至新的1.5毫升离心管中。最后，用50毫摩尔的碳酸氢铵缓冲液洗涤磁珠六次，每次洗涤5分钟。使用100微升珠子进行免疫印迹分析，以确认生物素化蛋白的富集，并将剩余样品快速冷冻，储存于负80摄氏度。采用蛋白质印迹法分析农杆菌浸润的N. benthamiana叶片中蛋白的表达及生物素化情况。浸润叶片中的生物素化蛋白通过链霉亲和素C1偶联磁珠被高效富集，用于后续质谱分析。捕获了不同大小的多种蛋白质，对富集的蛋白质进行蛋白质印迹分析显示为弥散条带。在进行此操作时，请务必在每次离心前移除脱盐柱底部的密封盖，并松开盖子。该方案易于适用于本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中其他目标蛋白质，也可用于在其他植物物种中扩展TurboID邻近标记技术。

turboid-based-proximity-labeling-for-planta-identification-protein

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

基于 TurboID 的接近标签，用于蛋白质-蛋白质相互作用网络的植物中识别

我们介绍了一种改进的QUICK（定量免疫沉淀结合敲低）方法，该方法此前已被提出，用于区分真实的和虚假的蛋白质-蛋白质相互作用。我们的方法基于15N代谢标记、通过ATP的有无来调节蛋白质-蛋白质相互作用的亲和力、免疫沉淀以及定量质谱分析。...

一种基于15N代谢标记、免疫沉淀、定量质谱及亲和力调控的蛋白质-蛋白质相互作用鉴定方案

本视频介绍了用于研究线虫细胞中原位蛋白质-蛋白质相互作用的邻近连接分析技术。当目标蛋白质彼此靠近时，在连接有二抗的PLA探针的帮助下，可形成环状DNA模板。随后使用扩增溶液对探针进行扩增，产生一条长的单链DNA，再通过检测探针的杂交，实现细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的定位。...

原位蛋白质-蛋白质相互作用研究的邻近连接实验

我们介绍一种用于生成可诱导稳定细胞系的定位与亲和纯化（LAP）标签标记方法，以研究蛋白质功能、时空性的亚细胞定位以及蛋白质-蛋白质相互作用网络。...

可诱导的LAP标签稳定细胞系用于研究蛋白质功能、时空定位及蛋白质相互作用网络

蛋白质-蛋白质相互作用可发生在细胞的细胞核和细胞质中。为了研究这些相互作用，通常采用传统的共免疫沉淀法和现代的邻近连接技术。在本研究中，我们比较了这两种方法，以可视化NF90-RBM3相互作用在细胞核和细胞质中的分布情况。...

通过免疫共沉淀法在核组分和胞质组分中可视化蛋白质-蛋白质相互作用 原位 邻近连接实验

我们提供一种基于邻近标记技术BioID的蛋白片段互补实验——split-BioID的逐步操作方案。该方法在两个特定蛋白相互作用时被激活，可在天然细胞环境中实现对依赖于特定条件的蛋白复合物进行蛋白质组学分析。该方法操作简便、成本低廉，仅需常规实验室设备即可完成。...

分裂型BioID——在天然细胞环境中对特定情境下蛋白质复合物的蛋白质组学分析

本文展示了如何利用邻近连接实验（PLA）以高灵敏度在固定细胞中可视化MST1/MST2异源二聚体的形成。...

利用双分子荧光互补技术检测蛋白异构体异源二聚化 原位 邻近连接实验

同源J结构域蛋白与Hsp70分子伴侣协同作用，参与从蛋白质折叠到降解等多种生物学过程。本文介绍了一种原位邻近连接实验方法，可用于在细菌、酵母和人类细胞中监测这些短暂形成的分子伴侣复合物。...

原位监测细菌、酵母和人类细胞中瞬时形成的分子伴侣复合物

本文以AT4G18020（APRR2）-AirID蛋白为模型，介绍了一步一步在黄瓜（Cucumis sativus...

基于AirID的邻近标记技术用于植物中蛋白质-蛋白质相互作用研究

本研究建立了基于TurboID的果蝇（D.

体内应用基于TurboID的邻近标记技术于Drosophila melanogaster

本方案介绍了一种基于生物素连接酶与目标蛋白融合后，利用其邻近效应在活体（in...

体内邻近生物素化用于四膜虫（Paramecium tetraurelia）蛋白质相互作用研究

学习TurboID邻近标记技术，用于在Nicotiana benthamiana植物中识别NLR免疫受体的蛋白质相互作用网络。该方法可捕获瞬时或弱相互作用，适用于多种植物物种的蛋白质互作研究。

基于TurboID的邻近标记法用于植物体内蛋白质-蛋白质相互作用网络的鉴定

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