基于TurboID的邻近标记法用于植物体内蛋白质-蛋白质相互作用网络的鉴定

NLR免疫受体在介导植物抵御多种病原体的过程中发挥着关键作用。我们描述了一种基于TurboID的邻近标记方法，用于鉴定含有Toll/白细胞介素-1受体结构域的NLR（如本氏烟植物中的免疫受体）的相互作用蛋白伙伴。该方案为研究其他植物物种中的蛋白质-蛋白质相互作用提供了重要参考，并可扩展应用于本氏烟中任何目标蛋白的研究。

基于TurboID的邻近标记方法相较于传统方法具有显著优势，因为它能够在体内捕获瞬时或微弱的蛋白质-蛋白质相互作用。首先将N. benthamiana种子高密度种植于湿润土壤中。随后将其置于气候培养箱中，在23至25摄氏度条件下，维持18小时光照和8小时黑暗的光周期。

将植株置于培养室中约四周，直至其生长至四到八片叶的阶段，用于后续的农杆菌浸润。按照文本方案中的描述构建TurboID融合蛋白，并将质粒转化至根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）感受态细胞中。使用1毫升无针头注射器，将接种液浸润到本氏烟草（N. benthamiana）完全成熟的叶片的远轴表皮。

过滤后36小时，将200微摩尔的生物素注入叶片，并继续培养植株3至12小时，随后收获叶片组织。采集叶片样品时，从叶柄基部剪下已注射的叶片，去除叶脉，并用液氮速冻组织。使用研钵和研杵研磨叶片组织，将粉末分装至15或50毫升Falcon管中，在-80°C下保存。

为了提取总蛋白，将约0.35克叶片粉末转移至一个2毫升离心管中。在此过程中，务必使用液氮保持组织处于低温状态。向粉末中加入700微升RIPA裂解缓冲液。

将离心管涡旋振荡10分钟，然后将样品置于冰上30分钟，每隔四到五分钟通过倒置离心管混合内容物。在4°C条件下以20,000 × g离心10分钟。随后收集上清液。

通过脱盐柱去除游离的生物素。取下柱子底部的封盖，并将其放入一个50毫升的离心管中。然后松开盖子，在4°C条件下以1,000 × g离心2分钟。

将脱盐柱置于新的50毫升离心管中，用5毫升RIPA裂解缓冲液重复平衡柱子三次。在4°C、1,000 × g条件下离心2分钟，每次弃去穿流液。将1.5毫升蛋白质提取物加至已平衡的柱子树脂顶部。

当提取物进入树脂后，再加入100微升RIPA裂解缓冲液。将柱子离心两分钟，去盐后的样品置于冰上，待后续使用。为定量去盐后的蛋白质提取物，使用Bio-Rad分光光度计测定OD595。

根据梯度浓度 BSA 溶液的数值绘制标准曲线，并计算脱盐后蛋白质样品的浓度。用 1 毫升 RIPA 裂解缓冲液在室温下平衡链霉亲和素 C1 偶联磁珠 1 分钟。使用磁力架吸附磁珠 3 分钟，然后轻轻吸除上清液。

然后再次重复洗涤一次。将蛋白质提取物转移至已平衡的磁珠中，将离心管置于4°C条件下，在旋转仪上孵育过夜，以亲和纯化蛋白质。次日，使用磁力架捕获磁珠，并吸除上清液。

接下来，向管中加入1.7毫升洗涤缓冲液一，将珠子洗涤一次，并在旋转器上孵育8分钟。按照前述方法去除上清液，并依次用1.7毫升洗涤缓冲液二和洗涤缓冲液三重复洗涤步骤。加入1.7毫升50毫摩尔的Tris HCl以去除去垢剂。

然后将离心管置于磁力架上，吸除上清液。用1毫升50毫摩尔的Tris HCl再重复洗涤一次，并将磁珠转移至新的1.5毫升离心管中。最后，用50毫摩尔的碳酸氢铵缓冲液洗涤磁珠六次，每次洗涤5分钟。

使用100微升珠子进行免疫印迹分析，以确认生物素化蛋白的富集，并将剩余样品快速冷冻，储存于负80摄氏度。采用蛋白质印迹法分析农杆菌浸润的N. benthamiana叶片中蛋白的表达及生物素化情况。浸润叶片中的生物素化蛋白通过链霉亲和素C1偶联磁珠被高效富集，用于后续质谱分析。

捕获了不同大小的多种蛋白质，对富集的蛋白质进行蛋白质印迹分析显示为弥散条带。在进行此操作时，请务必在每次离心前移除脱盐柱底部的密封盖，并松开盖子。该方案易于适用于本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中其他目标蛋白质，也可用于在其他植物物种中扩展TurboID邻近标记技术。