实验进化方法中疟原虫介导抗生素耐药性的定量化

质粒是大多数细菌物种和栖息地普遍存在的染色体外元素，它们是横向基因转移的重要剂，因为它们可以在细胞之间和种群之间迁移。这种转移最突出和突出的例子之一是传播在质粒上编码的抗生素耐药基因。要构建编码抗生素耐药基因的质粒模型，请选择质粒骨干，PCR 使用高保真聚合酶和在质粒模板上结合的底塑剂放大质粒。在我们的案例中，我们使用了一个 pBBR1 质粒骨干网。接下来，使用高保真聚合酶放大电阻基因NptII，包括原生Tn5启动子。设计电阻基因的底转，与质粒骨干带大约20个序列互补碱基对。PCR后，使用等温体组装50分钟，将纯化电阻基因PCR产品的同源性区域与纯化质粒骨干网融合60分钟。使用电穿孔将熔融产品转化为大肠杆菌 DH5-Alpha。板100微升的混合物在选择性介质上孵育37度约24小时。然后可以提取、验证质粒并将其转化为大肠杆菌野生型菌株MG1655。这产生菌株 MG1655 pCON. 在抗生素接触期间， 细菌需要质粒才能存活。因此，质粒是正选择。在非选择性条件下，如果没有抗生素，质粒是一次性的细胞。我们研究的目的是跟踪质粒在这样非选择性条件下随着时间的推移。为此，我们为小质粒配备了抗生素耐药基因，并介绍给大肠杆菌。我们进行了一个进化实验，通过复制电镀监测质粒频率。质粒携带应变mg1655 pCON现在被引入进化实验。首先，在LB加糖板上的板mg1655 pCON补充抗生素，并在37度孵育过夜。从这个板块随机选择8个祖先殖民地，并在37度孵育过夜，不断摇晃。第二天，种群被转移到96个深井板块中进行的实验。将复制内容随机分布到板上非常重要。例如，在棋盘方法中。在我们的实验中，培养物被稀释和转移与不同的稀释率和在两个温度。在每个转移事件中，应用稀释处理，并在总共 98 次转移中重复串行转移。在进化实验中，从质粒携带细胞的比例估计了种群中质粒的频率。20世纪50年代，埃丝特和约书亚·莱德伯格推广了复制电镀，用于研究细菌的耐药性。这种方法将使他们能够升级对表型的扫描，并在研究结束时发现，青霉素耐药性可能产生在细菌由于突变的基因组。为了在实验期间确定种群中的质粒频率，固定培养物被连续稀释，并镀在非选择性LB制片板上。根据每板 250 到 500 个菌落的产量调整稀释。镀金种群在37度下孵育，生长时间不到24小时。殖民地在很小的时候最好复制。一夜之间增长后，使用读者选择的自动殖民地计数器计算所有殖民地。这会产生培养物中细菌总种群大小。请注意，应将板边缘的菌落放在外。要复制这些板，您需要选择性的加糖板，并辅以抗生素、圆形块、适合方块的金属环和无菌天鹅绒布。布料需要 100% 棉，因为可以通过自动洗灭进行灭菌。将布放在块上，用金属环固定。小心地将带计数菌落的板放在固定的天鹅绒布表面上。以圆移动敲击板，使所有板表面接触布。重要的是，所有的殖民地触摸天鹅绒。拆下 LB 板，将选择性板放在天鹅绒上。重复小心的敲击。同样重要的是，盘子要完全接触天鹅绒。之后，拆下选择性板。这些板在室温下孵育过夜。第二天，需要LB和抗生素板进行评估。将板彼此放在上面，比较生长。您可以轻松地发现无殖民地的空间。这些是对抗生素没有抗药性的菌落。因此，这些殖民地失去了质粒。最后，标记抗生素板上缺少多少菌落。这个数字给你质粒损失。每周在进化实验中重复所有种群的复制电镀。质粒损失可能是由质粒多畸形引起的。当处理质粒结构时，说在首选宿主中表达给定基因时，体内质粒的原生行为与状态可以接受的确认有关，通常是被忽视的。但在进化论中，这种对变化的确认可能非常重要。对质粒确认的分析可能是一项非常棘手的工作。特别是质粒多粒体很难分析，因为它们不能通过PCR或测序正确识别。另一方面，质粒多粒难以通过凝胶电泳进行分析，因为它们的潜在大尺寸和缓慢的电泳流动性。我们的协议提供了一个简单明了的方法，用于筛选和识别质粒多粒，我会说任何给定的质粒制剂。视觉质粒分子使用碱性分解从5 mL固定过夜细胞培养中提取质粒。低拷贝质粒的质粒提取通常会导致宿主染色体DNA的污染，这些细胞质粒在可视化之前需要消化。去除染色体DNA污染用质粒安全处理提取的质粒DNA