Name: 实验进化方法中疟原虫介导抗生素耐药性的定量化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: 了解实验进化方法中质粒动态与抗生素耐药性的定量追踪技术。本研究利用大肠杆菌模型系统，通过复制平板法监测质粒频率变化，为理解细菌耐药性传播机制提供重要方法学基础。

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感谢 Gor Margaryan 提供的创意支持与技术协助。本工作由 ZMB 青年科学家资助项目 2017/2018（授予 TW）以及德国研究基金会（DFG）重点计划 1819（资助编号 DA1202/2-1，授予 TD）提供资助。

1. 构建携带抗生素抗性基因的模式质粒
注意：该菌株 大肠杆菌 K-12 MG1655 被用作所有实验的模式生物（DSM No. 18039，德国微生物与细胞培养保藏中心，DSMZ）。该菌株 E. coli DH5α17 在质粒构建过程中使用了。
<ol>
	<li>选择合适的质粒骨架进行PCR扩增，并通过PCR扩增包含启动子区域的抗性基因（图1）。
	<ol>
		<li>使用高保真DNA聚合酶及引物pBBR1_for（5'-GCGGCCACCGGCTGGCT-3'）和pBBR1_rev（5'-TACCGGCGCGGCAGCGTGACCC-3'），以质粒pLC（GenBank登录号 MH238456）为模板，对质粒骨架进行PCR扩增18。</li>
		<li>使用高保真DNA聚合酶及引物nptII_gib_for（5'-GCGCCGGTAGATCTGCTCATGTTTGAAGCTTCACGCTGCCGCA-3'）和nptII_gib_rev（5'-CGGTGGCCGCCAAAAAGGCCATCCGTCAGGTCAGAAGAACTCGT-3'），对包含天然Tn5启动子19的抗性基因nptII进行PCR扩增。nptII基因编码新霉素磷酸转移酶，赋予卡那霉素抗性。 
		注意：设计抗性基因的引物时，应使其包含约20 bp与待连接质粒骨架互补的序列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用任意合适的试剂盒纯化两条PCR产物。</li>
	<li>将纯化的抗生素抗性基因PCR产物（包含其启动子区域）与纯化的质粒骨架混合，利用等温组装法20在50 °C下反应60分钟，连接并融合同源区域。</li>
	<li>将连接产物电转化至E. coli DH5α菌株中。
	<ol>
		<li>取2 µL步骤1.3的反应产物，加入40 µL预冷的电转感受态细胞中，使用2 mm电转杯在4 °C、2.5 kV条件下进行电穿孔。转化后，将细胞重悬于1 mL溶菌肉汤（LB）培养基中。</li>
		<li>将全部液体转移至微量离心管中，在37 °C、250 rpm振荡条件下培养1小时，使质粒上的抗性标记充分表达。</li>
		<li>取100 µL菌液涂布于含有相应抗生素（卡那霉素25 µg/mL）的LB琼脂平板上，筛选携带抗性基因的转化子，从而获得含质粒的细胞。将剩余菌液离心，弃上清，将菌体重悬于100 µL LB培养基中，涂布于另一块选择性琼脂平板。将平板在37 °C培养24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为验证阳性克隆，使用商业化的质粒小提试剂盒，通过碱裂解法提取构建的质粒。
	<ol>
		<li>取5 mL过夜培养至稳定期的菌液，室温下12,000 x g离心收集菌体。将菌体重悬于试剂盒提供的重悬液中，随后进行裂解和中和处理，再于12,000 x g离心5分钟。</li>
		<li>将上清液转移至试剂盒提供的DNA结合柱中，用500 µL洗涤液洗涤两次，每次均需离心，最后用洗脱缓冲液洗脱柱膜上的DNA。</li>
		<li>对提取的质粒进行Sanger测序，确认其序列正确无误。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在确认质粒构建正确后，按照上述方法将该质粒（现命名为pCON）电转化至E. coli MG1655菌株中，获得菌株E. coli MG1655 pCON。</li>
</ol>
2. 在不同条件下随时间监测携带质粒的细菌
注意：该进化实验在非选择性条件（LB 培养基）下，使用携带质粒的菌株，在两种温度（37 °C 和 20 °C）及三种群体瓶颈规模中进行。该实验设计用于研究在不同条件下质粒的持续存在情况。
<ol>
	<li>设计一项进化实验以追踪质粒频率随时间的变化（图2）
	<ol>
		<li>将构建的携带质粒的菌株（E. coli MG1655 pCON）接种于添加抗生素（卡那霉素 25 µg/mL）的LB琼脂平板上，并在37 °C下过夜培养。</li>
		<li>在96孔深孔板中每孔加入1 mL LB培养基。从琼脂平板上独立挑取八个随机分离的单菌落作为细菌祖先，分别接种至不同孔中。将深孔板置于37 °C、450 rpm的摇床中培养24小时。同时制备祖先克隆的冻存甘油菌种。</li>
		<li>次日，根据实验设计（图2）将八个重复群体转移至新的深孔板中。使用PBS缓冲液将培养物稀释至总体积为1 mL，稀释比例分别为1:100（大瓶颈，L）、1:1,000（中等瓶颈，M）或1:10,000（小瓶颈，S）。稀释后的培养物分别在37 °C和20 °C下培养。 
		注意：在96深孔板中必须严格防止交叉污染。因此，应采用棋盘式板设计，将接种的孔与未接种的LB培养基孔交替排列。在整个进化实验过程中均应使用此模式。</li>
		<li>在37 °C培养的培养物每12小时转移一次，而在20 °C培养的培养物每24小时转移一次。 
		注意：每次转移时均应用相应的瓶颈大小处理，并重复连续转移，共进行98次转移。具体转移次数可根据读者的实验设计进行调整。</li>
		<li>定期（每周两次）为所有群体制备冻存甘油菌种。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过影印平板法监测质粒频率（图3） 
	注意：在进化实验过程中，通过宿主所占比例来估算群体中携带质粒细胞的频率。影印平板法流程见图3。
	<ol>
		<li>为确定进化实验期间群体中的质粒频率，将处于稳定期的培养物进行系列稀释后，涂布于非选择性LB琼脂平板上。调整稀释度以使每平板获得250–500个菌落。 
		注意：在涂布前应预先制备较厚的LB琼脂平板（约30 mL琼脂）。</li>
		<li>根据实验中的生长温度，将涂布后的平板进行过夜培养。 
		注意：菌落应保持较小，因此在37 °C下培养时间应&#60;24小时。</li>
		<li>过夜培养后，使用手动或自动菌落计数仪统计所有菌落数量，并计算培养物中的总细菌群体大小。 
		注意：琼脂平板边缘的菌落不应计入总细菌细胞数。</li>
		<li>通过高压灭菌对棉质天鹅绒方块（约20 x 20 cm）进行灭菌。 
		注意：天鹅绒布料必须为100%纯棉才能耐受高压灭菌。灭菌后必须将布料彻底干燥。</li>
		<li>灭菌后，将天鹅绒布平整地覆盖在圆形支撑块上，并用金属环固定。务必避免产生褶皱。小心地将长有菌落的平板（琼脂面朝下）放置在固定的天鹅绒表面，通过以环形方式轻敲培养皿，确保所有菌落均接触天鹅绒表面。</li>
		<li>小心取下LB琼脂平板，再将添加抗生素（卡那霉素 25 µg/mL）的选择性平板放置于天鹅绒布上。同样通过轻敲培养皿确保平板与天鹅绒完全接触。随后取下平板，在室温下静置过夜培养。</li>
		<li>次日，同时观察LB琼脂平板和选择性平板。能在选择性培养基上生长的菌落记为质粒宿主（即具有抗生素抗性），而无菌落出现的位置则对应于不含质粒的菌落（即对抗生素无抗性，已丢失质粒）。通过将两个平板叠放并对生长情况进行比对（例如标记缺失的菌落），分别统计两个平板上的菌落数量，从而获得在进化实验过程中丢失质粒的细胞数量。</li>
		<li>在整个进化实验过程中定期重复此操作（例如每14次转移后进行一次）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用凝胶电泳可视化质粒多聚体
注意：低拷贝质粒的质粒提取常导致宿主基因组 DNA 污染，因此在检测前需通过酶切消化去除。
<ol>
	<li>使用碱裂解法从5 mL静止期过夜培养的细胞培养物中提取质粒DNA，具体操作如步骤1.5所述。</li>
	<li>随后，用一种ATP依赖性DNase处理提取的质粒DNA，该酶仅切割染色体DNA，以去除染色体DNA污染（参见材料表）。在37 °C孵育30分钟。之后，使用任意合适的纯化试剂盒对DNA进行纯化。</li>
	<li>为获得所有质粒构象（单体或多个体）的开环分子，将质粒DNA样品与切口酶（Nb.BsrDI）孵育，在65 °C下持续30分钟。</li>
	<li>同时，为获得线性质粒分子（用于质粒大小比较），选用一种仅在质粒上单一切点的限制性内切酶（如HindIII）进行消化。 
	注意：此处理可得到线性质粒单体。开环分子在电泳中不呈线性迁移。</li>
	<li>为观察质粒的大小与构象，将切口化和线性化的质粒DNA样品在1%（w/v）琼脂糖凝胶、1× TAE缓冲液中以4.3 V/cm的电压电泳120分钟。使用Midori Green对样品染色，并在凝胶成像系统上观察凝胶结果（参见材料表）。使用1 kbp DNA标记物。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，我们介绍了一种结合分子生物学、实验进化和DNA可视化技术的方法，用于研究质粒进化在细菌抗生素耐药性持久存在中的作用。尽管该方法整合了不同研究领域的技术，但所采用的各项技术均简单直接，可在标准的微生物学实验室中完成。
该实验方案中最关键的步骤包括构建模型系统菌株，并对携带质粒的基因型进行遗传学验证。值得注意的是，许多质粒天然携带抗生素抗性基因，因此读者可省略方案中的第1步，直接进入第2步。接下来，进化实验应采用随机设计的重复种群，以避免深孔板中重复种群的位置对实验结果造成偏差。此外，在进化实验中，连续传代和稀释步骤需格外谨慎操作，因为污染会扭曲实验结果。最后，影印平板操作也必须极为小心。菌落过大可能会影响结果，但可通过将平板培养时间控制在24小时以内来避免。同样，单个平板上菌落数量过多也可能导致影印结果出现偏差，因此在平板接种和影印前需对种群进行适当稀释。
我们这种方法最大的优势之一是无需重型设备即可轻松重复实验。此外，使用影印平板法追踪标记基因的另一个优势在于，只有活细胞会被检测到，而流式细胞术或定量PCR可能会将死细胞误判为活细胞。因此，影印平板法在计数携带质粒的细胞时引入的偏差更小。然而，影印平板法的一个局限性在于单次实验运行中可检测的群体规模（即细胞数量）有限。
利用我们的方法，我们最近发现质粒稳定性进化能够增强抗生素抗性基因在细菌中的持续存在。因此，我们开发了一种方法，用于追踪质粒介导的抗性持久性，这对于在无抗生素条件下长期监测抗性具有重要意义。

质粒是环状的、可自我复制的遗传元件，在原核生物中普遍存在。作为水平基因转移的载体，它们能够在微生物种群之间传递性状，因此被认为在微生物进化中发挥着重要作用。质粒可在短时间内驱动微生物快速适应生长限制性条件（例如在抗生素或杀虫剂存在的情况下1），并导致长期的生活方式转变（例如致病性的出现2）。关于质粒在基因转移方面影响的最显著例证，记录于暴露于抗生素浓度波动的生态系统中，例如医疗机构或工业化农场3。由于强烈的正向选择作用，许多质粒携带抗菌素耐药性基因，并常被发现使其宿主细菌产生多重耐药性。质粒能够在不同种群或细菌物种之间迁移，从而导致多种抗菌素耐药性的迅速传播。在无选择压力的条件下，质粒对细胞并非必需，甚至常被视为寄生性元件。尽管如此，质粒在自然界中广泛存在，其进化过程与细菌染色体的进化高度交织。质粒在自然环境（波动且无选择压力）中的持续存在机制仍不清楚，但这一问题对于我们理解抗生素耐药基因在自然界中的持久性具有重要意义。
实验进化是研究微生物种群的有力工具4。实验进化表明，对质粒维持施加强烈选择压力会导致质粒或宿主染色体发生补偿性（即适应性）进化，从而降低质粒的适合度代价，并进而促进质粒的丰度（即质粒的持久性）5,6,7。因此，随时间推移追踪质粒与宿主之间的相互作用，可能揭示出这两种元件适应机制的重要细节。此外，实验进化还能够量化在不同条件下携带质粒的细胞随时间变化的丰度8,9,10。
在进化实验中，质粒的持久性可通过多种策略进行监测，包括基于荧光激活细胞分选（FACS）的流式细胞术11、定量PCR（qPCR）11或基于培养的方法。流式细胞术需要使用FACS仪器，并在质粒上引入可检测的（荧光）标记基因，例如绿色荧光蛋白（GFP）。然而，GFP的表达可能改变多种细胞特性，并进一步影响质粒在细胞内的定位12，从而可能影响细胞分裂过程中的质粒遗传。采用qPCR方法测定质粒丰度时，结果可能受到质粒拷贝数的显著偏差影响，而质粒拷贝数在细菌生长周期的不同阶段及随时间变化可能差异很大13。最后，基于培养和涂板的方法需要引入可筛选的标记基因，这可以是抗生素抗性基因，而这类基因通常天然存在于天然质粒上，因此无需进行遗传操作。抗生素抗性可通过传统的影印平板法进行追踪。因此，为了研究天然质粒的动力学，影印平板法非常适合用于监测由质粒编码的抗生素抗性14。
为了观察质粒分子（例如评估质粒大小），可采用多种方法。可通过基于PCR的方法扩增完整的质粒。然而，该方法需要设计特异性引物，在进化实验中可能具有挑战性，因为质粒序列可能随时间发生变化。此外，由于PCR引物存在多个结合位点，基于PCR的方法难以有效扩增质粒多聚体。质粒多聚体分子可能在质粒复制终止后或通过质粒分子之间的重组产生，通常以头尾相连的方式排列15。另一种质粒可视化方法结合了DNA内切酶对质粒分子的酶切或切口处理，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。不同大小的同一质粒（例如单体与多聚体）在凝胶中的迁移速率不同，因此在观察质粒分子时可被分辨。该方法能够实现对不同质粒构象（即多聚化状态）的可视化和定量分析。质粒构象可作为质粒稳定性的指标，因为质粒多聚体在细胞分裂过程中常会丢失16。
在最近的一项研究中，我们追踪了质粒在非选择性条件下（即无抗生素选择压力）的持续存在情况。我们比较了两种不同温度（20 °C 和 37 °C）以及三种群体规模（即稀释率）下质粒的持续性。通过应用不同的稀释率，即种群瓶颈，可用来研究种群规模对细菌和质粒进化的影响。根据我们的结果，我们提出质粒对其细菌宿主可能是中性的，并且可以在没有任何选择压力的情况下进化出稳定性8。这种进化而来的质粒稳定性是通过减少质粒多聚体的形成而实现的8。
本文介绍了一种用于定量分析质粒持久性并研究质粒在维持抗生素抗性基因方面进化的实验方案。该方法包含多个步骤：首先将抗生素抗性基因插入模式质粒（若使用天然抗性质粒，则可省略此步骤），随后通过实验进化方法评估该质粒在非选择性条件下持续存在的能力，同时利用影印平板法测定质粒频率随时间的动态变化，并通过可视化手段分析质粒基因组。本文所述方案旨在研究质粒的进化与持久性，但也可用于追踪染色体抗性基因（或其他标记基因）随时间的进化过程。

<table><tbody><tr><td>96孔深孔板</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔深孔板</td><td>Roth</td><td>EN07.1</td><td>2 ml，方形</td></tr><tr><td>96孔深孔板（冷冻用）</td><td>Starlab</td><td>E1702-8400</td><td>微稀释管系统</td></tr><tr><td>菌落计数器</td><td>斯图尔特</td><td>SC6+</td><td></td></tr><tr><td>棉绒</td><td>窗帘店</td><td></td><td>需100%棉质</td></tr><tr><td>电泳槽</td><td>BioRad</td><td></td><td>琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>电泳电源</td><td>BioRad</td><td>1645070</td><td>琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>电穿孔比色皿</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1652089</td><td>0.1 cm</td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet 胶回收试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>K0832</td><td>PCR片段纯化</td></tr><tr><td>GeneJet 质粒小提试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>K0503</td><td>质粒提取试剂盒</td></tr><tr><td>吉布森组装</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>50125852</td><td></td></tr><tr><td>培养箱（板式摇床）</td><td>Heidolph</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>新不伦瑞克科学公司</td><td>Innova 44</td><td></td></tr><tr><td>接种环</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3125000052, 3125000028</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Capp</td><td>ME8-1250R</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND2000</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸</td><td>Eurofines</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion 聚合酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>F533S</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,</td><td></td></tr><tr><td>PlasmidSafe 酶</td><td>Epicentre</td><td>10059400</td><td></td></tr><tr><td>反应管</td><td>Eppendorf</td><td>30125150</td><td></td></tr><tr><td>复制块 &amp;和金属环</td><td>VWR</td><td>601-3401</td><td>PVC 圆柱 69 毫米；环 102 厘米</td></tr><tr><td>限制性内切酶</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>T100</td><td></td></tr></tbody></table>

实验进化方法中质粒介导的抗生素抗性定量分析

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

质粒在微生物生态学和进化中发挥重要作用，作为微生物群体中侧向基因转移的载体以及辅助基因功能的储存库。在环境快速变化的情况下（例如抗生素暴露波动），这一作用尤为显著。我们最近的研究表明，质粒能够在 大肠杆菌 未对质粒的存在进行阳性筛选。本文描述了一种实验系统，可用于在长期进化实验中同时追踪质粒的基因型和表型。我们利用分子技术设计一种模型质粒，随后将其引入实验进化批量系统中 E. coli 宿主。我们通过影印平板法追踪质粒频率随时间的变化 E. coli 在量化抗生素耐药性持久性的同时，我们通过质粒切刻和琼脂糖凝胶电泳分析质粒多聚体的形成程度，以监测宿主细胞中质粒的构象。该方法不仅能够直观展示进化中质粒的基因组大小，还能揭示其拓扑构象——这一因素对质粒的遗传至关重要。本系统结合了分子生物学策略与传统微生物学方法，构建了一个可长期追踪细菌群体中质粒动态的实验体系。所展示的方法未来可广泛应用于多种可移动遗传元件的研究。

本文介绍了一种通过量化质粒在群体中的持续性来研究质粒进化的研究方法。首先，我们展示了如何构建携带质粒的 E. coli 菌株 MG1655 pCON，并将其用于后续的进化实验。其次，我们提供了一种简便的方法，用于追踪进化过程中细菌群体中质粒的丰度。最后，我们展示了如何对质粒分子的大小和构象进行可视化分析。
在我们之前的研究8中，利用本方法开展了一项进化实验，用于追踪在无抗生素条件下E. coli中抗生素抗性质粒的持续性（图4）。代表性结果显示，在37 °C、稀释倍数为10-4的条件下，质粒携带细胞的丰度随时间推移而下降（图4）。通过本方法，我们发现质粒丢失是由于质粒基因组结构高度压缩，导致抗性基因转录与质粒自身复制之间产生冲突，从而引发质粒不稳定。对质粒分子的可视化分析使我们发现，这些冲突导致了不稳定的质粒构象（即质粒多聚体形成，图5）。然而，我们观察到在未接触抗生素的情况下，质粒稳定性仍发生了进化（图4）。这种进化获得的稳定性源于质粒内部的一段重复序列，该重复序列消除了转录与复制之间的冲突，从而形成了可稳定遗传的质粒。因此，我们的研究结果揭示了重组和基因组扩增在遗传元件适应性进化中的重要作用。
<img alt="使用PCR扩增和等温融合进行大肠杆菌转化的质粒构建示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：pCON质粒的设计。 构建pCON质粒所用克隆策略的示意图。质粒骨架（pBBR1）和抗生素抗性基因（nptII）通过PCR扩增，并利用等温融合技术连接20。由此获得质粒pCON及菌株MG1655 pCON。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="大肠杆菌持留性测试流程，包含连续稀释、涂板及温度条件的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：长期进化实验的设计。 连续传代实验的示意图。携带质粒（pCON）的群体被涂布于选择性培养基上。从平板中随机挑选祖先菌落，并接入连续传代系统。通过三种不同的稀释方式实施传代，以模拟不同规模的种群瓶颈效应。稀释过程进行连续重复。实验在两种温度条件下进行。通过影印培养法在实验过程中监测质粒-宿主频率。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用绒布块在琼脂平板上进行菌落复制的过程；示意图；Km&lt;sub&gt;25&lt;/sub&gt;-敏感性筛选。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：影印平板法。 细菌群体影印平板操作步骤的示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌宿主动态图；抗生素对转移的影响；pCON3-6 数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：pCON 频率随时间变化的代表性结果。 pCON 的持续性以进化实验过程中宿主的比例（代表性重复群体）表示。在 98 次传代中，pCON 质粒群体在非选择性条件下进化，稀释倍数为 10-4。所有携带 pCON 质粒的重复群体在种群中的比例均下降。随后，将这些群体暴露于抗生素中过夜培养，再重新在非选择性条件下培养，以检测质粒稳定性的进化情况。该图已根据 Wein 等人8 修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳结果；DNA线性化，DNase处理分析；质粒构象研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 5"> 
图5：质粒构象的代表性分析。 模型质粒pCON的可视化结果。图中显示了提取后未经处理的质粒DNA、线性化的质粒DNA、经DNase处理（仅切割染色体DNA）的样品，以及经酶切产生切口的DNA（即开环质粒DNA）。质粒线性化结果显示所有质粒大小一致。去除染色体DNA并使pCON产生切口后，可观察到二聚体及其他多聚体的存在。该图改编自Wein等人的研究8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

我们的实验方法提供了一种策略，用于追踪细菌群体中质粒丰度和抗生素抗性随时间的变化。

质粒作为横向基因转移的载体和微生物中辅助基因功能的储存库，在微生物生态学和进化中发挥着重要作用……

质粒是染色体外的遗传元件，广泛存在于大多数细菌物种及其生境中，作为横向基因转移的重要媒介，能够在细胞之间以及种群之间迁移。此类基因转移最显著且典型的例子之一，便是由质粒编码的抗生素抗性基因的传播。为了构建一个编码抗生素抗性基因的模型质粒，需选择一种质粒骨架，并使用高保真DNA聚合酶及能与质粒模板结合的引物，通过PCR扩增该骨架。在本实验中，我们采用了pBBR1质粒骨架。接下来，使用高保真DNA聚合酶扩增包含天然Tn5启动子的抗性基因nptII。设计抗性基因的引物时，应使其具有约20个碱基与质粒骨架序列互补。PCR完成后，将纯化的抗性基因PCR产物的同源区域与纯化的质粒骨架通过50°C恒温组装反应融合60分钟。将融合产物通过电穿孔法转化至大肠杆菌DH5-Alpha中。取100微升转化混合物涂布于选择性培养基平板上，37°C培养约24小时。随后可提取质粒，进行验证，并将其转化至大肠杆菌野生型菌株MG1655中，获得菌株MG1655 pCON。在抗生素存在条件下，细菌需要该质粒才能存活，因此质粒处于正向选择压力下；而在非选择性条件（即无抗生素）下，质粒对细胞而言是可有可无的。本研究的目标是在这种非选择性条件下，长期追踪质粒的动态变化。为此，我们将小型质粒携带抗生素抗性基因并导入大肠杆菌（Escherichia coli），开展进化实验，并通过影印平板法监测质粒频率。携带质粒的菌株MG1655 pCON现被用于进化实验。首先，在添加抗生素的LB琼脂平板上涂布MG1655 pCON，37°C过夜培养。从该平板上随机选取8个祖先菌落，于37°C恒温振荡培养过夜。次日，将这些种群转移至96深孔板中进行实验。在此过程中，必须将重复样本在平板上随机分布，例如采用棋盘式布局。在本实验中，培养物以不同的稀释倍数和两种温度条件进行稀释和转移。每次传代时均施加相应的稀释处理，连续传代共98次。在整个进化实验过程中，通过携带质粒的细胞比例来估算种群中质粒的频率。影印平板法由Esther和Joshua Lederberg于20世纪50年代推广，他们曾利用该方法研究细菌的药物抗性。该方法使研究人员能够大规模筛查表型，最终发现青霉素抗性可由基因组中的自发突变引起。为确定实验过程中种群内质粒的频率，需将处于稳定期的培养物进行系列稀释后涂布于非选择性的LB琼脂平板上。调整稀释度，使每块平板上长出250至500个菌落为宜。将涂布后的平板于37°C培养过夜，时间少于24小时。菌落较小时最适宜进行影印。过夜培养后，使用任意型号的自动菌落计数器统计所有菌落数量，以获得培养物中的总细菌数量。注意应排除平板边缘的菌落。进行影印操作时，需准备添加抗生素的选择性琼脂平板、一个圆形木块、一个适配木块的金属环以及无菌的丝绒布。丝绒布必须为100%棉质，以便通过高压灭菌进行消毒。将丝绒布平铺于木块上，并用金属环固定。小心地将已计数菌落的平板倒置于固定的丝绒布表面，以环形轻压方式轻敲平板，确保整个平板表面均接触丝绒布。至关重要的是，所有菌落都必须接触到丝绒布。移去LB平板后，将选择性平板置于丝绒布上，再次小心轻敲，同样需确保整个平板完全接触丝绒布。随后移去选择性平板。将平板于室温下过夜培养。次日，需同时使用LB平板和抗生素平板进行结果判读。将两块平板叠放对比，可清晰观察到无菌落生长的空白区域。这些区域对应的菌落不具有抗生素抗性，即已丢失质粒。最终，统计抗生素平板上缺失的菌落数量，该数值即反映质粒丢失情况。在整个进化实验期间，需每周对所有种群重复一次影印平板操作。质粒丢失可能由质粒多联体形成异常所致。在进行质粒构建时，例如为在特定宿主菌株中表达某个目标基因，质粒在体内所呈现的构象状态通常容易被忽视。然而，在进化背景下，此类构象变化可能具有极其重要的意义。质粒构象的分析是一项极具挑战性的工作。尤其是质粒多联体难以通过PCR或测序方法准确识别。另一方面，由于质粒多联体可能具有较大分子量及较慢的电泳迁移率，也难以通过凝胶电泳有效分析。本实验方案提供了一种简单直接的方法，可用于筛查和鉴定任意质粒制备样品中的质粒多联体。为观察质粒分子，需从5 mL处于稳定期的过夜培养细胞中提取质粒DNA，采用碱裂解法进行提取。低拷贝数质粒的提取常伴随宿主染色体DNA污染，因此在可视化前需将其消化去除。为消除染色体DNA污染，使用Plasmid-Safe

quantification-plasmid-mediated-antibiotic-resistance-an-experimental

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

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