OaAEP1介导的聚合蛋白酶法合成及其在单分子力谱学中的固定
2020年2月5日
本文介绍了一种利用酶促反应将蛋白质单体连接成具有可控序列的蛋白质聚合物，并将其固定在表面用于单分子力谱研究的实验方案。
我们的酶法使用具有可控聚合度的蛋白质寡聚体，是单分子力谱研究以及基于蛋白质的材料构建的理想样品制备方法。该方法不会向目标蛋白质引入半胱氨酸。
由于半胱氨酸是蛋白质中最重要的功能残基之一，它有助于聚合物蛋白或酶的形成。本次实验操作将由我实验室的研究生邓一兵和石盛超进行演示。首先，在烧杯中将20克铬酸钾溶解于40毫升超纯水中。
缓慢将360毫升浓硫酸加入重铬酸钾溶液中，并用玻璃棒轻轻搅拌。将玻璃盖玻片放入铬酸中，转移至80摄氏度的烘箱中加热30分钟。用水清洗盖玻片，再用无水乙醇清洗，最后用氮气流吹干。
将盖玻片完全浸入体积分数为1%的APTES甲苯溶液中，在室温下避光处理1小时。先用甲苯清洗盖玻片，再用无水乙醇清洗，并用氮气流吹干。随后将盖玻片在80摄氏度下孵育15分钟，然后冷却至室温。
使用移液器在两个固定的盖玻片之间加入 200 微升浓度为 1 毫克/毫升的 Sulfo-SMCC DMSO 溶液，避光孵育 1 小时。1 小时后，先用 DMSO 清洗盖玻片，再用无水乙醇清洗，以去除残留的 Sulfo-SMCC。在氮气流下干燥盖玻片。
用移液器将60微升200微摩尔的GL-ELP-50-cys蛋白溶液滴加到功能化的盖玻片上，在25摄氏度孵育约3小时。随后用超纯水洗涤盖玻片，以去除未反应的GL-ELP-50-cys。为制备功能化的悬臂梁表面，首先将悬臂梁浸入铬酸中，并在80摄氏度下清洗10分钟。
使用水和无水乙醇冲洗去除酸。将悬臂浸入含有1%（体积分数）APTES的甲苯溶液中，在塑料管盖内进行氨基硅烷化处理，反应1小时。用无水乙醇冲洗悬臂，然后在80摄氏度下烘烤15分钟。
将悬臂浸入 Sulfo-SMCC 溶液中 1 小时，然后用无水乙醇冲洗悬臂。为将 cys-ELP-50-NGL 连接到表面，将悬臂浸入含有 Sulfo-SMCC 的马来酰亚胺基团的 cys-ELP-50-NGL 溶液中反应 1.5 小时。然后用超纯水洗去悬臂上未反应的 cys-ELP-50-NGL。
接下来，将功能化的悬臂浸入含有 200 微升 50 微摩尔 GL-CBM-XDocerin 蛋白溶液和 200 纳摩尔 OaAEP1 的溶液中，并在 25 摄氏度下放置 20 至 30 分钟。然后使用 AFM 缓冲液洗去未反应的蛋白质。在进行 AFM 实验前彻底洗去未反应的残留蛋白质至关重要，因为残留蛋白质会形成凝集素-对接蛋白配对，从而阻断悬臂在表面结合新蛋白质的能力。
为了将连接在盖玻片表面的GL-ELP-50与连接单元cohesin-T-L-目标蛋白-NGL相连，向盖玻片加入15 µL的OaAEP1，并孵育30分钟。使用15至20 mL的AFM缓冲液洗去未反应的蛋白质。加入100 µL TEV蛋白酶，在25 °C下反应1小时，以在TEV识别位点切割蛋白单元。
然后使用 15 至 20 毫升 AFM 缓冲液洗去残留的蛋白质。利用 OaAEP1 将目标蛋白-NGL 的连接单元 cohesin-T-L-与 GL-泛素-NGL 玻璃连接，反应 30 分钟。根据需在玻璃表面构建的 GL-泛素-NGL 蛋白结构，重复多蛋白制备步骤 n1 次。
省略最后一次TEV切割反应，以在蛋白质聚合物上保留黏连蛋白，形成黏连蛋白-TEV-L-泛素-n-NGL玻璃。向原子力显微镜（AFM）流体池中加入1毫升AFM缓冲液，其中含10毫摩尔/升氯化钙和5毫摩尔/升抗坏血酸。选择功能化AFM探针的D型探针头进行实验。
将探针浸入原子力显微镜缓冲液中。以每秒400纳米的恒定速度从表面收回悬臂。同时，以每秒4,000赫兹的采样率记录力-伸展曲线。
每次实验前，使用能量均分定理在原子力显微镜缓冲液中对悬臂梁进行校准，以获得精确的弹簧常数 K 值。将功能化修饰有dockerin的悬臂梁探针与表面功能化修饰有cohesin的蛋白质结合，形成cohesin-dockerin配对。然后打开JPK数据处理软件，选择具有典型锯齿状模式且脱附力较高的力-伸展曲线。
本研究中，OaAEP1 连接反应在相邻蛋白之间引入的 NGL 残基未影响聚合物中蛋白单体的稳定性，其解折叠力和反向长度增量与先前研究结果相当。亚铁形式的红氧还蛋白纯化后在 495 纳米和 575 纳米处呈现典型的紫外-可见吸收峰，而锌形式则无此吸收峰。逐步消化与连接反应的 SDS-PAGE 凝胶结果显示了黏性 TEV-L-泛素、TEV 切割后的目标蛋白混合物、纯化的 GFP-TEV 蛋白酶以及纯化产物 GL-泛素。
显示了经切割的GL-泛素以及含有或不含OaAEP1的黏连蛋白-TEV-L-泛素连接混合物，同时展示了纯化的OaAEP1。使用活性Sulfo-SMCC对表面进行功能化修饰对于成功连接肽段至关重要。本文提供了一种构建聚合蛋白的新方法。
它可帮助研究人员利用单分子力谱技术研究复杂的蛋白质系统。铬酸具有强腐蚀性和强酸性。在配制和操作时需小心谨慎。
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概述
本文介绍了一种通过酶促方法将蛋白质单体连接成具有可控序列的蛋白质多聚体的技术。所获得的蛋白质多聚体可固定在表面，用于单分子力谱研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 蛋白质工程
- 单分子技术
背景
- 蛋白质寡聚体在材料科学的多种应用中至关重要。
- 保持蛋白质中的功能残基对其活性至关重要。
- 单分子力谱技术可提供分子相互作用的深入信息。
- 该方法避免引入半胱氨酸，从而保护重要的功能基团。
研究目的
- 建立一种用于制备具有特定序列的蛋白质多聚体的实验方案。
- 促进在单分子水平上研究蛋白质相互作用。
- 提供一种可靠的基于蛋白质的材料构建方法。
使用的方法
- 蛋白质单体的酶促聚合。
- 聚合物在表面的固定化。
- 单分子力谱样品的制备。
- 在制备过程中使用铬酸钾。
主要结果
- 成功将蛋白质单体共价连接成多聚体。
- 保持目标蛋白质中的功能残基完整。
- 由研究生成功演示该方法的操作过程。
- 制备产物适用于后续蛋白质相互作用的研究。
结论
- 该方法为蛋白质聚合提供了一种可靠的途径。
- 它为单分子力谱研究开辟了新的方向。
- 未来应用可能包括先进的蛋白质基材料。
常见问题
行业重要性概述
这种酶促聚合方法能够可控地构建用于单分子力谱分析的蛋白质聚合物，通过精确的结构域解折叠测量支持靶点验证。该方法通过保护功能残基并避免半胱氨酸修饰，保持了蛋白质的完整性，从而实现可靠的生物物理评估。此策略为早期发现工作流程中评估蛋白质稳定性及相互作用强度提供了可重复的实验平台。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可检测蛋白质结构域的稳定性和解折叠力，以验证机制假说。
- 操作价值：生成具有可控价态的明确定义多蛋白底物，实现一致的力谱读数。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过标准化的单分子测量，制备具有均一呈现的固定化蛋白质聚合物。
- 操作价值：利用黏连蛋白-对接蛋白配对实现共价、定向固定，支持检测的即用性。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过量化蛋白质结构域在受力条件下的机械稳定性，有助于降低治疗靶点的风险。
- 操作价值：能够在定义明确的聚合形式下，对野生型和变异型蛋白质进行纵向比较。
流程与工作流整合
该方法通过提供有关蛋白质结构域稳定性的定量生物物理数据，适用于从靶点验证到先导化合物优化的整个发现过程。
- Discovery Biology: 通过直接测量蛋白质解折叠力和轮廓长度变化，支持假设验证。
- Screening: 提供可重复的定量力-伸展曲线，用于比较蛋白质变体或配体结合状态。
- Analytics: 生成高分辨率的力学指纹图谱（锯齿状模式、解离力），反映特定结构域的稳定性。
- Translational Research: 通过机制关联，将体外稳定性参数与潜在的体内行为相联系。
- Enterprise Reuse: 建立可重复使用的表面化学及固定化策略，适用于多种蛋白质靶标。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低蛋白质稳定性评估中的不确定性，提高靶点选择的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化的酶促聚合和表面功能化方案，增强实验的可重复性。
- 战略价值：通过提供蛋白质构建体完整性的直接力学读数，优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：基于生理力学条件下经验证的结构域稳定性，实现对靶点的风险调整优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备蛋白质工程、酶法偶联以及基于原子力显微镜的力谱技术方面的专业知识。
- 依赖于配备液体池、校准悬臂梁及力-延伸测量功能的原子力显微镜系统的可及性。
- 需要在不同实验运行中对表面功能化（Sulfo-SMCC、APTES）以及蛋白酶/OaAEP1 活性进行标准化。
- 在应用于具有不同末端或结构特性的多种蛋白质构建体时，需考虑方法的适应性调整。
- 受限于表面制备过程中对高纯度试剂的需求，以及对腐蚀性铬酸的谨慎操作要求。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:43
Functionalization of Coverslip and Cantilever Surface
4:31
Stepwise Polyprotein Preparation with Controlled Sequences
5:44
AFM Experiment Measurement and Data Analysis
6:54
Results: AFM-based SMFS Measurements, UV-Vis Absorbance Spectra and SDS-PAGE Gel Results
7:51
Conclusion
