利用冻融胚胎高效制备基因修饰小鼠

本方案可简便、高效、快速地从小鼠单细胞胚胎制备基因编辑小鼠。本方案结合使用冻融的一细胞期胚胎和电穿孔技术，能够高效、低嵌合率地快速获得基因编辑小鼠，包括突变小鼠。进行体外受精时，首先通过腹腔注射7.5国际单位的孕马血清促性腺激素，对4周或8周龄的C57BL/6J雌性小鼠进行超数排卵处理，48小时后再次腹腔注射7.5国际单位的人绒毛膜促性腺激素。

接下来，从性成熟、3至5月龄的C57BL/6J雄性小鼠中取出附睾尾部，并用解剖针提取精子凝块。随后将精子凝块置于200 µL HTF液滴中，在37°C、5% CO₂条件下孵育1.5小时以进行获能。在人绒毛膜促性腺激素注射后16至18小时，从输卵管中收集卵丘-卵母细胞复合体，并将复合体置于覆盖石蜡油的200 µL HTF液滴中，在细胞培养孵箱中孵育，时间不超过2小时。

孵育结束时，从孵育液界面处加入一至五微升精子悬液至含有卵丘-卵母细胞复合体的200微升液滴中，将共培养体系置于细胞培养孵育箱中孵育三小时。孵育结束后，用添加钾离子的Simplex优化培养基洗涤卵母细胞三次，以去除残留的精子和卵丘细胞，并使用倒置显微镜观察单细胞胚胎的原核形成情况及其等级。对于单细胞胚胎的冷冻保存，将胚胎转移至新鲜的200微升HTF培养液滴中，该培养液添加20%胎牛血清，在细胞培养孵育箱中孵育10分钟。

孵育结束后，将20至100个胚胎转移至50微升的一摩尔二甲基亚砜溶液中，并将最多100个胚胎分至5微升溶液中，置于冻存管底部。在0°C下冷却胚胎5分钟，然后沿管壁加入45微升DAP213溶液。盖紧管盖后，将细胞在0°C下继续放置5分钟，随后迅速将冻存管置于液氮中保存。

在减血清最低必需培养基中配制浓度为一微克每微升的CRISPR RNA和一微克每微升的tracrRNA。将每种RNA溶液各六微升加入42微升无核酸酶的缓冲液中，并将混合物置于干式加热器中，在95摄氏度下孵育三分钟。孵育结束后，将混合物在室温下冷却五分钟，并用减血清最低必需培养基配制浓度为一微克每微升的HiFi Cas9蛋白。

将6微升稀释后的HiFi Cas9溶液加入RNA溶液中，并将最多100个解冻的胚胎转移至载玻片上的25微升终体积的核糖核蛋白复合物溶液中。随后在37摄氏度孵育胚胎10分钟。进行胚胎电穿孔时，在孵育结束时设定电穿孔仪参数，并将载玻片装入电穿孔仪。

为了确保基因组编辑在DNA首次复制前完成并防止嵌合体的产生，应在胚胎解冻后一小时内进行电穿孔。电穿孔后，用改良的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液洗涤胚胎三次，再用两滴添加了钾的Simplex优化培养基（覆盖液体石蜡）洗涤两次。随后将胚胎置于新鲜的添加钾的Simplex优化培养基中，在细胞培养孵箱中过夜孵育。

采用这种改良的单细胞胚胎冷冻保存方法，可提高冻融胚胎发育至二细胞阶段的发育率。在此代表性实验中，所有获得的小鼠均为白化小鼠，仅有一只嵌合小鼠表现出黑白斑驳的被毛。此处可观察到一只携带 M1 等位基因的白化小鼠的代表性色谱图片段。

如图所示，该方案能够高效地生成敲除和敲入小鼠，且嵌合率较低。事实上，纯合F0代后代的F1代子代均为杂合子，包含一个突变等位基因和一个野生型等位基因，无其他差异性突变。请注意，受精卵在单细胞阶段较为脆弱。

添加胎牛血清可增强胚胎的强度。然而，每一步操作都必须小心谨慎。该方法通过促进转基因小鼠的快速高效生产，有助于基因功能分析及人类疾病相关研究。