Name: 使用冷冻胚胎进行转基因小鼠高效生产 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 了解利用CRISPR/Cas9电穿孔技术对冷冻单细胞期小鼠胚胎进行基因编辑的高效方法。该方案通过优化冷冻保存与快速电穿孔流程，实现高发育率、高编辑效率及低嵌合率的转基因小鼠快速制备，适用于基因功能研究与疾病模型构建。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢佐田仁美和伊丽莎白·加西亚在动物护理方面提供的帮助。本研究由KAKENHI（15K20134、17K11222、16H06276和16K01946）以及北海道医学研究基金（资助H.N.）和Jichi医科大学青年研究者奖（资助H.U.）提供支持。&#160;大塚利志美奖学金基金会为M.D.提供了资助。

本研究中所有动物护理和操作均按照《实验动物护理和使用指南》的规定和要求进行。实验方案已获得富山大学、东京大学、慈惠医科大学和马克斯·普朗克佛罗里达神经科学研究所实验动物护理委员会的批准。所有试剂的相关信息见材料表。
1. CRISPR 试剂设计
<ol>
	<li>crRNA 设计
	<ol>
		<li>访问 CRISPR direct19（https://crispr.dbcls.jp/）以设计特异性高且脱靶位点较少的 crRNA。 
		注意：还有许多其他有用的工具可用于设计 crRNA20（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/wereview/crisprtools/）。</li>
		<li>输入目标核苷酸序列，并进行以下设置： 
		PAM 序列要求 = NGG 
		特异性检查 = 小鼠（Mus musculus）基因组，GRCm38/mm10（2011 年 12 月） 
		注意：例如，为构建酪氨酸酶（Tyr）基因敲除小鼠，选择外显子 2（核苷酸序列 9476–9692）作为靶向区域。</li>
		<li>点击 Design，为获得高度特异性的结果，勾选 Show Highly Specific Target Only。</li>
		<li>为降低潜在的脱靶效应，应选择在 &#34;12 mer+PAM&#34; 和 &#34;8 mer+PAM&#34; 列中数值最低的靶序列。 
		注意：这些列中的数值（&#34;1&#34;）表示该序列仅在目标位点有唯一完全匹配，大于 1 的数值则表明存在潜在的脱靶位点。</li>
		<li>向 crRNA 合成公司订购所得的寡核苷酸（补充表 1）。 
		注意：针对 Tyr 基因外显子 2，本研究使用的靶序列如下：GGACCACTATTACGTAATCC，其 PAM 序列为 +TGG（图 2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于 HDR 介导编辑实验的单链寡脱氧核苷酸（ssODN）设计（例如，用于构建基因敲入小鼠）。
	<ol>
		<li>设计 ssODN 的长度约为 80–180 bp，两侧包含 30–60 个核苷酸（nt）的同源臂。 
		注意：长度为 75–85 nt 的 ssODN，包含 30–35 nt 的同源臂且与 gRNA 互补，已显示出较高的基因敲入编辑效率21。</li>
		<li>在 PAM 序列处或若不可行时，在 PAM 序列的 5′ 邻近碱基处引入预期的修饰和沉默突变，以防止基因组编辑后被再次切割。 
		注意：本研究中使用的 crRNA 和 ssODN 列于 补充表 1 中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 体外受精、胚胎冷冻保存及冻融
<ol>
	<li>体外受精
	<ol>
		<li>通过腹腔注射使4周龄或8周龄的C57BL/6J雌性小鼠超数排卵&#160;孕马血清促性腺激素（PMSG）处理，48小时后注射7.5 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG）。 
		注意：使用超数排卵技术可使排卵卵母细胞数量增加约3倍22.</li>
		<li>从性成熟的 C57BL/6J 雄性小鼠（3–5 月龄）中取出附睾尾。 
		注意：可以在不处死雄性小鼠的情况下收集精子。</li>
		<li>用解剖针提取精子凝块，并将其孵育于200 µL人输卵管液滴中&#160;液态（HTF）在CO中2 孵育器中孵育1.5小时以进行获能。</li>
		<li>从hCG注射后16–18小时的输卵管中收集卵丘-卵母细胞复合体（COCs），并在新鲜的200 µL液滴中孵育&#160;HTF 培养基覆盖石蜡油置于 CO₂ 培养箱中2 培养箱（5% CO₂）2，37 °C）孵育不超过2小时。 
		注意：最好在麻醉状态下通过颈椎脱位处死小鼠，因为通过CO₂安乐死2 吸入影响体外受精与胚胎发育23.</li>
		<li>将1–5 µL受精培养基界面处的精子悬液加入含有卵母细胞-冠丘复合体（COCs）的200 µL HTF培养基液滴中，并在CO₂培养箱中孵育2 3小时恒温培养箱培养。</li>
		<li>用添加钾的简单优化培养基（KSOM）清洗卵母细胞3次，以去除残留的精子和卵丘细胞。</li>
		<li>使用倒置显微镜检查原核形成情况及单细胞胚胎的等级。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单细胞胚胎的冷冻保存
	<ol>
		<li>将单细胞胚胎在含有20% FBS（不覆盖石蜡油）的200 µL HTF液滴中，于CO₂培养箱中孵育10分钟。2 培养箱</li>
		<li>将20–100个胚胎转移至50 µL的1 M二甲基亚砜（DMSO）溶液中24.</li>
		<li>将含有100个胚胎的5 µL溶液转移至冻存管底部，使用冷却器或冰上于0 °C冷却5分钟。</li>
		<li>沿管壁缓慢加入45 µL DAP213溶液（含2 M二甲基亚砜、1 M乙酰胺和3 M丙二醇），盖紧管盖，于0 °C冰箱或冰上静置5分钟。 
		注意：不要将管盖拧得过紧，以便在样本解冻时能够轻松打开。</li>
		<li>将试管迅速置于液氮中保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎解冻
	<ol>
		<li>打开冻存管盖，弃去残留的液氮，加入900 µL预热至37 °C的0.25 M蔗糖溶液。 
		注意：0.25 M 蔗糖溶液必须预先加热至 37 °C，因为使用低温溶液会降低胚胎解冻后的存活率。</li>
		<li>快速移液10次，将冻存管中的内容物转移至塑料培养皿中。 
		注意：移液操作应小心进行，避免产生气泡，以免损伤胚胎。</li>
		<li>用石蜡油覆盖的KSOM培养基将形态正常的受精卵清洗两次，并置于CO₂培养箱中2 孵育至电穿孔。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. CRISPR 试剂的组装与电穿孔
注意：对于电穿孔，我们使用了先前描述过的铂板电极（高度：0.5 mm，长度：10 mm，宽度：3 mm，间隙：1 mm）和一种一步式电穿孔仪8（材料表）。也可使用两步式电穿孔仪（材料表）。
<ol>
	<li>CRISPR 试剂的准备与组装
	<ol>
		<li>订购 CRISPR 试剂（即 crRNA、tracrRNA 和 Cas9 蛋白），若进行 HDR 介导的编辑实验，还需订购 ssODN（材料表 和 补充表 1）。</li>
		<li>按以下步骤配制退火溶液。
		<ol>
			<li>将 crRNA 和 tracrRNA 分别用低血清最低必需培养基溶液配制成 1 μg/µL（材料表），各取 6 µL 加入 42 µL 无核酸酶缓冲液中。</li>
			<li>将混合液在干式加热器中 95 °C 孵育 3 分钟，随后在室温冷却 5 分钟。</li>
			<li>将 HiFi Cas9 蛋白用 Opti-MEM I 稀释至 1 μg/µL，取 6 µL 加入上述混合液中，总体积为 60 µL。</li>
			<li>若进行 HDR 介导的编辑实验，加入 6 µL 浓度为 1 μg/µL 的 ssODN。由于最终体积应为 60 µL，因此在步骤 3.1.2.1 中使用 36 µL 无核酸酶水。 
			注：crRNA、tracrRNA、Cas9 蛋白和 ssODN 的最终浓度均为 100 ng/µL。</li>
			<li>将最多 100 个胚胎转移至 25 µL 的最终混合液（RNP 复合物）中，置于单孔载玻片上，在 37 °C 孵育 10 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电穿孔
	<ol>
		<li>用 6 µL 新配制的 CRISPR 试剂混合液填充电极间隙，并将 20–25 个胚胎加入该混合液中。 
		注：应避免胚胎与电穿孔电极接触，以防电脉冲过程中损伤胚胎。</li>
		<li>使用单步型电穿孔仪时，设置如下条件进行电穿孔： 
		电压：25 V，脉冲方向（Pd）+ 
		开启时间（ON）：3 ms，关闭时间（OFF）：97 ms 
		重复次数：5 次 
		注：电穿孔应在解冻后 1 小时内完成，以确保基因组编辑在首次 DNA 复制前发生，防止嵌合体产生。</li>
		<li>使用双步型电穿孔仪时，设置条件如下： 
		穿孔脉冲 = 40 V，Pd + 
		开启时间（ON）= 1 或 2.5 ms；脉冲间隔 = 50 ms 
		重复次数：4 次，衰减 10% 
		 
		转移脉冲 = 5 或 7 V；Pd +/– 
		开启时间（ON）：50 ms；脉冲间隔 = 50 ms 
		重复次数 = 5 次；衰减 = 40% 
		注：必须调整液体体积，以维持阻抗在制造商指定的特定范围内。</li>
		<li>用改良 Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液 2（M2）清洗胚胎 3 次，随后用石蜡油覆盖的 KSOM 培养基液滴清洗 2 次。</li>
		<li>将清洗后的胚胎（置于 KSOM 培养基中）在 CO2 培养箱中孵育过夜，以备后续移植。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 胚胎移植
<ol>
	<li>准备假孕雌性小鼠。在胚胎移植（ET）前一天，将ICR品系雌性小鼠（3–6月龄）与结扎雄性小鼠交配。 
	注意：应在次日早晨检查小鼠是否有交配栓。有交配栓的小鼠视为假孕小鼠，可用于胚胎移植（ET）。</li>
	<li>交替吸取空气和KSOM（不含石蜡油）进入玻璃毛细管中，每段2–3 mm，作为成功植入的标记。</li>
	<li>将20–24枚胚胎移入200 μL KSOM液滴中（不加石蜡油），并用玻璃毛细管各吸取10–12枚胚胎，分别植入每侧输卵管。</li>
	<li>使用异氟烷（吸入）或腹腔注射混合溶液（分别含美托咪啶 0.3 mg/kg、咪达唑仑 4.0 mg/kg 和布托啡诺 5.0 mg/kg）对雌性小鼠进行麻醉。将麻醉后的小鼠俯卧位固定于加热垫上。用保湿凝胶保护麻醉小鼠的眼睛。</li>
	<li>沿背部中线的下部剃毛，并用聚维酮碘消毒，随后用70%乙醇擦拭。</li>
	<li>沿背侧中线平行方向做一个长约1厘米的切口。</li>
	<li>取出输卵管并置于无菌塑料铺巾上，使用温热的无菌生理盐水保持湿润。</li>
	<li>将输卵管置于体视显微镜下。</li>
	<li>用微弹簧剪在输卵管漏斗部与壶腹部之间、靠近壶腹部上游几毫米处的管壁上打一个小孔。</li>
	<li>将装有胚胎的玻璃毛细管尖端插入孔中，轻轻向毛细管持握器的吹嘴吹气，排出胚胎直至在膨大部可见到一个气泡。 
	注意：每侧输卵管移植10–12枚胚胎。</li>
	<li>将玻璃毛细管从输卵管壁撤出，并轻轻将生殖器官推回体腔内。</li>
	<li>重复上述步骤，将胚胎引入另一侧输卵管。</li>
	<li>完成ET手术后，使用单纯间断缝合法缝合腹膜（5&#173;0，可吸收合成编织缝线）缝合，然后采用单纯间断缝合或皮下间断埋线方式（6&#173;0 非&#173;可吸收单股合成缝线</li>
	<li>将小鼠置于37 °C加热板上保温，直至其从麻醉状态恢复。</li>
	<li>术后每天监测动物健康状况，持续7天。</li>
</ol>
5. 基因分型与序列分析
<ol>
	<li>基因组DNA提取 
	注意：我们使用NucleoSpin组织DNA提取试剂盒，按照制造商的建议从小鼠耳组织中提取基因组DNA。
	<ol>
		<li>向样品中加入180 µL Buffer T1和25 µL蛋白酶K溶液，涡旋混匀10秒。</li>
		<li>在56 °C孵育2小时，或直至组织完全裂解。每30分钟涡旋10秒。</li>
		<li>加入200 µL Buffer B3，剧烈涡旋30秒，然后在70 °C孵育10分钟。</li>
		<li>向样品中加入210 µL 100%乙醇，并剧烈涡旋。</li>
		<li>对每个样品，将一个组织柱放入收集管中，然后将样品加入柱中。</li>
		<li>在11,000 x g离心1分钟，弃去穿流液，并将柱重新放回收集管中。</li>
		<li>加入500 µL Buffer BW洗涤样品（第一次洗涤），在11,000 x g离心1分钟，弃去穿流液，并将柱重新放回收集管中。</li>
		<li>向柱中加入600 µL Buffer B5（第二次洗涤），在11,000 x g离心1分钟，弃去穿流液，并将柱重新放回收集管中。</li>
		<li>在11,000 x g离心1分钟以干燥硅胶膜，然后将NucleoSpin组织柱转移至一个1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>加入100 µL Buffer BE，在室温孵育1分钟，然后在11,000 x g离心1分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR扩增与纯化
	<ol>
		<li>使用primer3 plus网站（https://primer3plus.com/）设计引物，以扩增目标位点周围400–500 bp的序列。</li>
		<li>设计新的PCR程序并进行实证测试。</li>
		<li>纯化PCR产物，以去除不需要的酶、核苷酸、引物和缓冲液成分。可采用以下标准纯化方法：
		<ol>
			<li>向50 µL PCR产物中加入50 µL苯酚，涡旋混匀。</li>
			<li>在11,000 x g离心1分钟，将上层透明液体转移至新管中。</li>
			<li>加入120 µL 99.5%乙醇和20 µL 5 M醋酸铵，涡旋30秒。</li>
			<li>室温放置10分钟，然后在11,000 x g离心10分钟。</li>
			<li>弃去上清液，用1 mL 70%乙醇洗涤DNA沉淀。</li>
			<li>在室温干燥沉淀10分钟，然后溶于10 µL无RNase的水中。 
			注意：推荐使用基于PCR柱的纯化试剂盒，因为苯酚对人体具有毒性。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sanger测序
	<ol>
		<li>进行DNA定量分析（参见材料表），以定量纯化的PCR扩增产物。</li>
		<li>将PCR产物和测序引物送至测序服务提供商。</li>
		<li>使用现有的在线网站分析序列。 
		注意：本研究中使用CRISP-ID25（http:/crispid.gbiomed.kuleuven.be/）进行序列分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2Fcas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA+-+guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA - guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-822 (2012).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FVCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
<li>Mashiko, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mutant+mice+by+pronuclear+injection+of+circular+plasmid+expressing+Cas9+and+single+guided+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA.</a> Scientific Reports. 3, 3355(2013).</li>
<li>Yen, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mosaicism+and+allele+complexity+induced+by+CRISPR%2FCas9+RNA+injections+in+mouse+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes.</a> Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).</li>
<li>Kaneko, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+genome+editing+of+rodent+intact+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation.</a> PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR%2Fcas9-mediated+genome+editing+in+mice+by+zygote+electroporation+of+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease.</a> Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).</li>
<li>Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+knockout+by+electroporation+of+engineered+endonucleases+into+intact+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos.</a> Scientific Reports. 4, 6382(2014).</li>
<li>Hashimoto, M., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+enables+the+efficient+mRNA+delivery+into+the+mouse+zygotes+and+facilitates+CRISPR%2FCas9-based+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing.</a> Scientific Reports. 5, 11315(2015).</li>
<li>Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li>
<li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+mouse+genome+engineering+by+CRISPR-EZ+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).</li>
<li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA%2FCas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Scientific Reports. 8, 474(2018).</li>
<li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+knockout+mice+by+DNA+microinjection+of+various+CRISPR%2FCas9+vectors+into+freeze-thawed+fertilized+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Darwish, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+high-efficient+generation+of+mutant+mice+using+freeze-thawed+embryos+of+the+C57BL%2F6J+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).</li>
<li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+Cas9+protein%2FsgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+frozen-thawed+oocytes+for+efficient+production+of+normal+offspring+from+cryopreserved+mouse+spermatozoa+showing+low+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility.</a> Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).</li>
<li>Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRdirect%3A+Software+for+designing+CRISPR%2FCas+guide+RNA+with+reduced+off-target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites.</a> Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).</li>
<li>Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WeReview%3A+CRISPR+Tools-Live+Repository+of+Computational+Tools+for+Assisting+CRISPR%2FCas+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments.</a> Bioengineering. 6 (3), 63(2019).</li>
<li>Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+genome+editing+for+single-base+substitutions+using+optimized+ssODNs+with+Cas9-RNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs.</a> Scientific Reports. 9, 4811(2019).</li>
<li>Takeo, T., Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superovulation+using+the+combined+administration+of+inhibin+antiserum+and+equine+chorionic+gonadotropin+increases+the+number+of+ovulated+oocytes+in+C57BL%2F6+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).</li>
<li>Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia+via+CO2+inhalation+causes+premature+cortical+granule+exocytosis+in+mouse+oocytes+and+influences+in+vitro+fertilization+and+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development.</a> Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).</li>
<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+survival+rate+of+unfertilized+mouse+oocytes+after+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).</li>
<li>Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISP-ID%3A+Decoding+CRISPR+mediated+indels+by+Sanger+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing.</a> Scientific Reports. 6, 28973(2016).</li>
<li>Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-mediated+genome+editing+in+vitrified%2Fwarmed+mouse+zygotes+created+by+ivf+via+ultra-superovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation.</a> Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).</li>
<li>Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+albino+Xenopus+tropicalis+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases.</a> Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).</li>
<li>Hur, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+mice+by+electroporation+of+Cpf1+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins.</a> Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).</li>
<li>Dumeau, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+gene+deletions+by+mouse+zygote+electroporation+of+Cas12a%2FCpf1%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1.</a> Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-READI%3A+Efficient+Generation+of+Knockin+Mice+by+CRISPR+RNP+Electroporation+and+AAV+Donor+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection.</a> Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).</li>
<li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-embryo+Gene+Cassette+Knockin+by+CRISPR%2FCas9-Mediated+Genome+Editing+with+Adeno-Associated+Viral+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+RNA-guide+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li>
<li>Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Roles+of+RZZ+and+Bub1-KNL1+in+Mitotic+Checkpoint+Signaling+and+Kinetochore+Expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion.</a> Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).</li>
<li>Smits, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Plasticity+Rescues+Target+Activity+in+CRISPR+Knockouts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts.</a> Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).</li>
</ol>

作者没有相关的财务披露。

本方案可高效、低嵌合率地制备转基因小鼠（表1）。该方法利用了生殖工程与基因组编辑技术领域的最新且最具实用价值的进展——CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物与冻融胚胎的电穿孔技术，使不具备高级胚胎操作技能的研究人员也能便捷地构建突变小鼠。这些技术进步显著简化并加速了转基因小鼠的制备过程。如图3所示，制备转基因小鼠约需4周时间。与其他采用类似策略的方案相比26，本方法在效率、出生率和嵌合率方面均具有优势。
在冷冻保存前，将单细胞胚胎在胎牛血清（FBS）中孵育，对于提高胚胎的发育率至关重要。方案中所述的冷冻保存胚胎的电穿孔条件，能够在CRISPR试剂的编辑效率与胚胎存活率之间取得平衡。事实上，过于剧烈或过于温和的电穿孔条件可能分别影响胚胎的发育率和编辑效率16。电穿孔的时机（图2B）至关重要，可克服 founder 个体中的嵌合现...

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR 相关蛋白 9（Cas9）系统是一项科学突破，可在基因组中实现前所未有的靶向修饰1。CRISPR/Cas9 系统由 Cas9 蛋白和向导 RNA（gRNA）组成，其中 gRNA 包含两个分子组分：靶点特异性的 CRISPR RNA（crRNA）和反式激活的 CRISPR RNA（tracrRNA）2。gRNA 将 Cas9 蛋白引导至基因组中的特定位点，该位点包含与 crRNA 互补的 20 个核苷酸序列，并紧邻原间隔序列邻近基序（PAM）。Cas9 蛋白结合靶序列后，诱导产生双链断裂（DSBs），这些断裂可通过易错的非同源末端连接（NHEJ）或高保真的同源定向修复（HDR）进行修复3,4,5。NHEJ 会导致插入和/或缺失（indels），当编码序列被靶向时，从而引起基因功能丧失。HDR 则在存在包含同源序列的修复模板时，实现精确的基因组编辑3,4,5。NHEJ 和 HDR 已分别被用于构建基因敲除和基因敲入小鼠模型。
尽管CRISPR/Cas9系统显著加快了高效且精准的转基因小鼠的制备，但应用这些方法的科研人员常面临技术上的挑战。首先，传统方案需要通过显微注射将CRISPR编辑工具导入受精卵的原核中6,7。该技术耗时较长，通常需要大量培训。因此，多个研究团队已用电穿孔技术取代显微注射8,9,10,11,12,13。然而，在早期的电穿孔方案中，需使用新鲜胚胎进行电穿孔，这带来了另一个问题，即每次实验前准备新鲜胚胎较为困难14。
近期，我们及其他研究者将冻融胚胎与电穿孔技术相结合用于基因组编辑，从而促进了转基因小鼠的制备15,16。该方案使不具备高级胚胎操作技能的研究人员也能高效、快速地构建人类疾病动物模型。该方案还显著降低了制备转基因小鼠过程中的实际困难，例如首建鼠（founders）中存在的遗传异质性问题16。为克服嵌合现象，我们在胚胎解冻后1小时内即进行CRISPR试剂的电穿孔操作，以确保基因编辑发生在基因组首次复制之前。另一项改进是使用Cas9蛋白而非Cas9 mRNA，以减少不必要的嵌合效应17。此外，我们开发了一种优化的一细胞胚胎冷冻保存方法，可提高胚胎发育至二细胞阶段的比率16：使用胎牛血清（FBS）可显著改善冻融卵母细胞受精后的存活率，其机制可能与提高冻融未受精卵母细胞抗逆性的作用机制相同18。
本文介绍了一种利用冻融胚胎制备转基因小鼠的综合实验方案，其中包括对单细胞C57BL/6J胚胎进行冷冻保存的改良方法。本方案涵盖以下步骤：1）gRNA设计、CRISPR试剂的制备与组装；2）单细胞胚胎的体外受精（IVF）、冷冻保存及解冻；3）将CRISPR试剂通过电穿孔导入冻融后的胚胎；4）将胚胎移植至假孕雌鼠的输卵管中；以及5）对F0代 founder 动物进行基因型鉴定和序列分析。

<table><tbody><tr><td>0.25 M 蔗糖</td><td>ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本)</td><td>SUCROSE</td><td></td></tr><tr><td>1 M DMSO</td><td>ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本)</td><td>1M DMSO</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (东京, 日本)</td><td>Vetorphale 5mg</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 蛋白：Alt-R&amp;reg; S.p. HiFi Cas9 核酸酶 3NLS</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>Japan SLC (滨松, 日本)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DAP213</td><td>ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本)</td><td>DAP213</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)</td><td>ES-009-C</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (东京, 日本)</td><td>HCG Mochida 3000</td><td></td></tr><tr><td>HTF</td><td>ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本)</td><td>HTF</td><td></td></tr><tr><td>ICR 小鼠</td><td>Japan SLC (滨松, 日本)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO)</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>KSOM</td><td>ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本)</td><td>KSOM</td><td></td></tr><tr><td>液氮罐</td><td>Chart Industries (Ball Ground, GA)</td><td>XC 34/18</td><td></td></tr><tr><td>M2</td><td>ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, 日本)</td><td>M2</td><td></td></tr><tr><td>美托咪定</td><td>Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (郡山, 日本)</td><td>1124401A1060</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon Co. (东京, 日本)</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>咪达唑仑</td><td>Sandoz K.K. (东京, 日本)</td><td>1124401A1060</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶缓冲液</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td><td>1072570</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin DNA 提取试剂盒</td><td>Takara Bio Inc (草津, 日本)</td><td>740952 .5</td><td></td></tr><tr><td>单孔载玻片</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd. (岸和田, 日本)</td><td>S339929</td><td></td></tr><tr><td>一步法电穿孔仪</td><td>BEX Co., Ltd. (东京, 日本)</td><td>CUY21EDIT II</td><td></td></tr><tr><td>石蜡油</td><td>NACALAI TESQUE Inc. (京都, 日本)</td><td>SP 26137-85</td><td></td></tr><tr><td>铂金板电极</td><td>BEX Co., Ltd. (东京, 日本)</td><td>LF501PT1-10, GE-101</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>ASKA Animal Health Co., Ltd (东京, 日本)</td><td>SEROTROPIN 1000</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY)</td><td>C12400</td><td></td></tr><tr><td>减血清最低必需培养基：OptiMEM I</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)</td><td>22600134</td><td></td></tr><tr><td>两步法电穿孔仪</td><td>Nepa Gene Co., Ltd. (市川, 日本)</td><td>NEPA21</td><td></td></tr></tbody></table>

利用冻融胚胎高效制备基因修饰小鼠

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

转基因小鼠的应用对于理解基因功能和解析人类疾病潜在机制至关重要。CRISPR/Cas9 系统使研究人员能够以前所未有的效率、准确性和简便性对基因组进行修饰。利用该技术，研究人员正致力于建立一种快速、高效且操作简便的转基因小鼠制备方案。本文介绍了一种改进的一细胞胚胎冷冻保存方法，可显著提高冻融后胚胎的发育率。结合优化的电穿孔条件，该方案可在短时间内高效地获得低嵌合率的基因敲除和基因敲入小鼠。此外，我们逐步详细阐述了优化后的实验流程，涵盖 CRISPR 试剂制备、体外受精、一细胞胚胎的冷冻保存与复苏、CRISPR 试剂的电穿孔、小鼠品系建立以及 founder 小鼠的基因型鉴定。采用本方案，研究人员将能够以前所未有的便捷性、速度和效率制备转基因小鼠。

我们改进的一细胞胚胎冷冻保存方法，包括在含20% FBS的HTF中孵育10分钟，随后在1 M DMSO和DAP213溶液中进行冷冻保存，显著提高了冻融胚胎发育至二细胞阶段的发育率（图1，p = 0.009，Student t检验）。冻融后的胚胎用于转基因小鼠的制备，并对电穿孔条件进行了优化：使用电穿孔仪，以25 V电压进行5次重复脉冲，每次脉冲持续3 ms，间隔97 ms，具体操作详见“实验方案”部分。通过制备白化病酪氨酸酶基因（Tyr）敲除小鼠验证了该方法的适用性（图2）。为此，设计了靶向外显子2的gRNA（图2A），CRISPR试剂的制备方法如“实验方案”部分所述。在胚胎解冻后1小时内进行电穿孔，以确保基因组编辑发生在基因组首次复制之前，从而避免创始人动物出现嵌合体（图2B）。所有获得的小鼠均为白化表型，仅一只小鼠为嵌合体，其毛色呈现白色与黑色斑块相间（图...

本文介绍了一种改良的一细胞胚胎冷冻保存方法，以及一种将冻融胚胎与电穿孔技术相结合的方案，用于高效制备基因修饰小鼠。

使用转基因（GM）小鼠对于理解基因功能及解析人类疾病潜在机制已变得至关重要。

本方案可简便、高效、快速地从小鼠单细胞胚胎制备基因编辑小鼠。本方案结合使用冻融的一细胞期胚胎和电穿孔技术，能够高效、低嵌合率地快速获得基因编辑小鼠，包括突变小鼠。进行体外受精时，首先通过腹腔注射7.5国际单位的孕马血清促性腺激素，对4周或8周龄的C57BL/6J雌性小鼠进行超数排卵处理，48小时后再次腹腔注射7.5国际单位的人绒毛膜促性腺激素。接下来，从性成熟、3至5月龄的C57BL/6J雄性小鼠中取出附睾尾部，并用解剖针提取精子凝块。随后将精子凝块置于200 µL HTF液滴中，在37°C、5% CO₂条件下孵育1.5小时以进行获能。在人绒毛膜促性腺激素注射后16至18小时，从输卵管中收集卵丘-卵母细胞复合体，并将复合体置于覆盖石蜡油的200 µL HTF液滴中，在细胞培养孵箱中孵育，时间不超过2小时。孵育结束时，从孵育液界面处加入一至五微升精子悬液至含有卵丘-卵母细胞复合体的200微升液滴中，将共培养体系置于细胞培养孵育箱中孵育三小时。孵育结束后，用添加钾离子的Simplex优化培养基洗涤卵母细胞三次，以去除残留的精子和卵丘细胞，并使用倒置显微镜观察单细胞胚胎的原核形成情况及其等级。对于单细胞胚胎的冷冻保存，将胚胎转移至新鲜的200微升HTF培养液滴中，该培养液添加20%胎牛血清，在细胞培养孵育箱中孵育10分钟。孵育结束后，将20至100个胚胎转移至50微升的一摩尔二甲基亚砜溶液中，并将最多100个胚胎分至5微升溶液中，置于冻存管底部。在0°C下冷却胚胎5分钟，然后沿管壁加入45微升DAP213溶液。盖紧管盖后，将细胞在0°C下继续放置5分钟，随后迅速将冻存管置于液氮中保存。在减血清最低必需培养基中配制浓度为一微克每微升的CRISPR RNA和一微克每微升的tracrRNA。将每种RNA溶液各六微升加入42微升无核酸酶的缓冲液中，并将混合物置于干式加热器中，在95摄氏度下孵育三分钟。孵育结束后，将混合物在室温下冷却五分钟，并用减血清最低必需培养基配制浓度为一微克每微升的HiFi Cas9蛋白。将6微升稀释后的HiFi Cas9溶液加入RNA溶液中，并将最多100个解冻的胚胎转移至载玻片上的25微升终体积的核糖核蛋白复合物溶液中。随后在37摄氏度孵育胚胎10分钟。进行胚胎电穿孔时，在孵育结束时设定电穿孔仪参数，并将载玻片装入电穿孔仪。为了确保基因组编辑在DNA首次复制前完成并防止嵌合体的产生，应在胚胎解冻后一小时内进行电穿孔。电穿孔后，用改良的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液洗涤胚胎三次，再用两滴添加了钾的Simplex优化培养基（覆盖液体石蜡）洗涤两次。随后将胚胎置于新鲜的添加钾的Simplex优化培养基中，在细胞培养孵箱中过夜孵育。采用这种改良的单细胞胚胎冷冻保存方法，可提高冻融胚胎发育至二细胞阶段的发育率。在此代表性实验中，所有获得的小鼠均为白化小鼠，仅有一只嵌合小鼠表现出黑白斑驳的被毛。此处可观察到一只携带 M1 等位基因的白化小鼠的代表性色谱图片段。如图所示，该方案能够高效地生成敲除和敲入小鼠，且嵌合率较低。事实上，纯合F0代后代的F1代子代均为杂合子，包含一个突变等位基因和一个野生型等位基因，无其他差异性突变。请注意，受精卵在单细胞阶段较为脆弱。添加胎牛血清可增强胚胎的强度。然而，每一步操作都必须小心谨慎。该方法通过促进转基因小鼠的快速高效生产，有助于基因功能分析及人类疾病相关研究。

use-freeze-thawed-embryos-for-high-efficiency-production-genetically

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用冷冻胚胎进行转基因小鼠高效生产

在本视频文章中，我们逐步演示如何采集并冷冻保存仓鼠卵母细胞，以获得较高的解冻后存活率。该方法同样可成功用于冷冻和解冻不同着床前发育阶段的小鼠胚胎。...

仓鼠卵母细胞与小鼠胚胎的采集及冷冻保存

本文介绍了一种基于乙二醇的小鼠胚胎玻璃化冷冻方法。该方法具有操作简便、胚胎毒性低的优点，因此可广泛适用于多种小鼠品系，包括近交系和基因修饰小鼠。...

基于乙二醇的玻璃化冷冻保存小鼠胚胎

本文展示了新开发的 I•Cryo 小鼠精子冷冻保存试剂盒。使用该试剂盒，在5种小鼠品系中，冻融精子获得的二细胞期胚胎发育率 consistently 得到提高。在1.5年期间，利用 I•Cryo...

小鼠精子冷冻保存与复苏——使用 I·Cryo 试剂盒

锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）等设计核酸酶可通过激活非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）通路，对小鼠着床前胚胎的基因组进行修饰。这些技术进步使得能够快速生成具有精确遗传修饰的小鼠。...

利用设计核酸酶进行小鼠基因组编辑

小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术（即外源基因的随机整合）以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展，特别强调质量控制和基因分型策略。...

通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠

关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

本文介绍一种无需使用新设备即可提高嵌合体生产效率的实验方案。通过简单改变胚胎注射时的方位，可增加所获得胚胎的数量，并可能缩短种系传递的时间进程。...

内细胞团内注射胚胎干细胞可提高嵌合率

本文介绍一种通过将慢病毒载体直接注射到受精卵的卵周隙中，以高效促进外源基因整合并制备首建者转基因小鼠的实验方案。...

慢病毒介导的转基因小鼠制备：一种用于直接研究 Founder 小鼠的简单高效方法

本实验方案描述了通过向受精卵显微注射CRISPR-Cas9系统和供体DNA，高效制备基因盒敲入和条件性敲除（floxed）小鼠的方法。...

通过受精卵显微注射在小鼠中构建基因盒敲入和Flox等位基因

本文介绍一种简单的方法，旨在高效产生名为“CRISPR RNP...

通过CRISPR显微注射对小鼠受精卵进行高效基因组编辑

本文介绍了一种利用胚胎干细胞构建基因修饰小鼠模型的实验方案，尤其适用于大片段DNA的基因敲入（KI）。该方案结合CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行优化，与传统的依赖同源重组的线性化DNA靶向方法相比，显著提高了基因敲入效率。...

利用CRISPR/Cas9在胚胎干细胞中实现高效基因靶向以构建基因编辑小鼠模型

本文介绍的宫颈操作方法可诱导小鼠假孕，无需使用输精管结扎雄鼠与雌鼠交配。假孕的诱导对于非手术胚胎移植和非手术人工授精的成功至关重要，这两种技术在本文中均有介绍。...

无需使用输精管结扎雄鼠诱导雌鼠假孕以进行非手术胚胎移植或人工授精

了解利用CRISPR/Cas9电穿孔技术对冷冻单细胞期小鼠胚胎进行基因编辑的高效方法。该方案通过优化冷冻保存与快速电穿孔流程，实现高发育率、高编辑效率及低嵌合率的转基因小鼠快速制备，适用于基因功能研究与疾病模型构建。

利用冻融胚胎高效制备基因修饰小鼠

探索更多视频