高光谱成像作为研究基于镧系元素分子单晶中光学各向异性的工具

高光谱成像技术能够在样品的特定位置获取精确的光谱信息。例如，可用于揭示单晶水平上的光学各向异性。通过对样品同时生成光谱和空间数据，可以实现比单独使用光谱学或荧光显微镜更为详细的样品分析。

大量影响分辨率的可调参数起初可能令人不知所措。然而，制定一份清单有助于熟悉系统。该技术需要手动调节成像硬件以及软件操作。

必须通过可视化方式同时展示这两个方面，以说明两种方法如何相互补充。本次操作演示将由本实验室的博士后研究员 Emily Rodrigues 与 Nelson Rutajoga 共同完成。为了设置高光谱成像映射的成像配置，从显微镜载物台开始，沿发射光路向探测器方向进行调整，需将紧邻光学显微镜位置处的光学立方体位置留空，并将共聚焦显微镜的光学立方体放置在该位置，以引导样品发射光通过可见光路传播。

沿着光路朝向探测器方向观察，将包含用于引导可见光发射至检测光路的二向色镜和滤光片的可见光光学立方体安装到指定位置。继续沿光路向探测器方向，将共聚焦针孔光学立方体放置在正确位置，以引导光线通过可见光检测光路；随后沿此光路，将共聚焦光谱仪光学立方体置于适当位置，使发射光能够到达探测器。当所有光学立方体就位后，手动调节探测器的狭缝开度，使其与所选针孔的尺寸相匹配。

然后，在 PHySpec 软件中选择针孔的孔径。对于铽铕双嘧啶三氟乙酰丙酮单晶的高光谱成像 mapping，手动将光学显微镜的 20 倍物镜移至样品下方，并按下显微镜左侧的白色按钮以打开白光照明。旋转按钮下方的旋钮以调节亮度。

将显微镜右侧的前向旋钮设置为 R，使 20% 的信号传输至相机，80% 的信号传输至检测器。在 PHySpec 软件中点击彩色相机窗口的播放按钮，以启动实时扫描。如果彩色相机窗口显示的图像过暗或为黑色，请在彩色相机选项卡下增加曝光时间 和/或 增益值。

如果图像过亮，请缩短曝光时间和/或降低增益值。为对样本进行聚焦，请旋转显微镜的旋钮，调节物镜与载物台之间的距离，并打开宽带光源快门，使样本接受紫外激发。然后旋转强度调节旋钮至所需位置，以控制宽带光源激发的强度。

单击“显示/隐藏比例尺”以在晶体的明场光学显微镜图像上添加比例尺，并在紫外光全照射或限定照射下观察晶体图像。通过使用操纵杆和旋钮调节紫外灯场光阑的大小，可在限定照射与宽场照射之间进行选择。在 SpectraPro SP 2300 选项卡下，选择一个波长以观察样品发射，并调节探测器的曝光时间。

为了在测序仪中获取高光谱立方数据，单击加号以添加新节点，然后单击共聚焦成像仪。单击多光谱采集，并输入所需的 X 和 Y 方向位置数量以及所需的步长。选择相机同步的硬件选项，并为可见光发射成像选择相应选项，然后单击确定。

在测序仪中，单击新添加的多光谱采集线以高亮显示该节点，然后单击播放按钮运行所选节点。为分析采集的高光谱成像数据，例如图像的光谱分布，在“处理”菜单中选择“数据”和“裁剪与弯曲”，以提高图像的信噪比。对于发射强度分布曲线，可右键单击立方体图像并选择“创建X方向分布曲线”，以分析某一行的数据。

拖动以选择区域，然后右键单击目标区域。选择“添加到图表”，以显示目标物理位置对应的发射强度。

强度分布曲线将显示在新图表中。要获取样品特定区域的发射光谱，可将光标悬停在立方体图像上，右键单击，然后选择矩形选择。拖动并单击以在目标区域绘制选定的形状。

然后右键单击目标区域，选择“将选定内容添加到图表”。在“添加到图表”窗口中，选择“创建新图表”以显示目标物的发射光谱，然后点击确定。接着在选择新区域之前，保存已获取的光谱。

此处显示的是将样品调整至合适焦距后拍摄的晶体明场图像。晶体的针状形貌清晰可见。此处还可观察到同一晶体在紫外光激发下，分别采用全视野照明和局部限定照明所获得的图像。

受限照明可用于研究晶体内部可能引发类似波导行为的能量或光传递效应。例如，在此图像中，一个未被直接激发的位点检测到强烈的发射信号，表明能量在晶体中发生了有效的迁移。从获取的高光谱数据立方体中，还可以获得以图像形式呈现的光谱分布，用以表示特定波长的信息。

特定发射波长的强度分布以及获取的高光谱立方体中任意像素或区域的发射光谱。例如，本分析的发射光谱显示了铕离子最具特征性的发射带。此外，沿不同晶面的空间分布表明，晶体尖端和侧面的发射更强，且可与三个空间方向上的镧系元素/镧系离子间距相关联。

为了在合理的高光谱立方体采集时间内获得良好的信号，调整显微镜的配置、焦距以及探测器的曝光时间至关重要。该技术不仅可采用紫外激发和可见光发射，也可利用近红外激发和近红外发射检测，因此适用于多种发光材料。

将光信号与一系列相关特征进行关联，使该技术在研究结构与性能关系方面具有重要意义，包括用于纳米-生物相互作用的体外评估。