Name: 诱导毛茸茸的根由农业细菌根- 在塔特里巴克麦的中介转化 （法戈皮鲁姆塔塔里库姆） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 了解利用发根农杆菌介导转化技术在苦荞麦中诱导毛状根的方法。该技术简便经济，适用于苦荞麦及其他双子叶植物的基因组学和微生物组学研究。

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本工作由中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金ZXKT17002资助。

本研究中使用的结核分枝杆菌被命名为BT18，该菌株来源于 &#34;金桥二号&#34; 由中国农业科学院山西小杂粮研究中心培育。本方案的主要步骤如图所示。 图1.
注意：操作外植体相关步骤时应迅速进行，尽可能保持培养皿处于关闭状态，以避免外植体失水萎蔫和污染。除非另有说明，所有外植体的培养均在25 °C、14小时光照/10小时黑暗的光周期条件下进行。除非另有说明，所有涉及外植体或细菌的操作均须在超净工作台内的无菌条件下完成。A. rhizogenes 及离体植物培养所用培养基成分详见表1。调节pH后，所有培养基均在120 °C下高压灭菌20分钟。制备固体培养基时，将25 mL培养基倒入直径为9 cm的培养皿中，静置使其凝固。
警告：将所有基因改造细菌和植物放入适当的废弃物容器中。所有危险化学品须在通风橱内操作，并将其放入危险废弃物容器中。
1. 结核病组织外植体的制备
<ol>
	<li>结核种子的准备
	<ol>
		<li>选取饱满且无损伤的结核种子（图1A1），该种子应保存在低于−20 °C的条件下，保存时间不超过2年。</li>
		<li>将种子置于28 °C的水中浸泡约20分钟，以便种皮易于剥离（图1A2）。如有需要，可用剪刀在种子上切一小口，以利于剥皮。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结核种子的灭菌
	<ol>
		<li>将100–200粒去皮种子放入一个100 mL的无菌锥形瓶中。</li>
		<li>用75%乙醇对种子消毒30秒。</li>
		<li>倒去乙醇，加入5%次氯酸钠溶液，继续消毒15分钟。 
		注：若灭菌效果不理想，可选用1 g/L的升汞溶液替代次氯酸钠进行消毒，处理时间为8分钟。 
		注意：升汞具有毒性，且对环境不友好。如使用升汞，必须在通风橱中操作，并将其废液倒入指定的危险废物容器中。</li>
		<li>倒去次氯酸钠溶液。</li>
		<li>用无菌去离子水清洗种子5次。</li>
		<li>用无菌吸水纸吸干种子表面水分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结核幼苗的制备
	<ol>
		<li>在300 mL植物组织培养瓶中配制50 mL添加了30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂粉的MS（Murashige和Skoog，1962）基础培养基（MSSA）（表1）。</li>
		<li>在高压灭菌前将pH值调节至5.8。</li>
		<li>每瓶MSSA培养基中均匀接种10粒种子。</li>
		<li>将种子置于培养室中，在25 °C ± 1 °C、光照条件下培养7–10天，使其萌发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>无菌外植体的制备
	<ol>
		<li>当两片子叶完全展开时，选择生长健壮的结核幼苗（图1C）。</li>
		<li>从根部切断幼苗（图1C 红色虚线箭头），注意避免接触培养基。</li>
		<li>将幼苗放入无菌培养皿中。</li>
		<li>将下胚轴切成0.8–1 cm长的片段，子叶剪成约0.5 cm大小的片状。</li>
		<li>将这些外植体在光照条件下于MSSA培养基上预培养24小时。</li>
		<li>将其转移至100 mL无菌锥形瓶中，准备用于后续侵染实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 根癌农杆菌（A. rhizogenes）转化前的准备
注意：A. rhizogenes 菌株 ACCC10060 由药用植物研究所慷慨提供，并保存于 −80 °C。将 A. rhizogenes 转化至含有 T-DNA 的双元载体 pK7GWIWG2D (II) 中，该 T-DNA 携带 b4 基因，同时以 GFP 作为报告基因，以及卡那霉素抗性基因作为筛选标记。基因 b4 属于转录因子 bHLH 家族，目前尚未发表。为评估 TB 毛状根的潜力，将 A. rhizogenes 转化至含有 MYB116 基因的双元载体 pK7WG2D 中，以研究其对类黄酮等次生代谢物在基因表达水平及代谢分析中的影响。活化的 A. rhizogenes 应与外植体同时充分准备。
<ol>
	<li>根癌农杆菌（A. rhizogenes）的活化
	<ol>
		<li>将根癌农杆菌（A. rhizogenes）置于冰上解冻</li>
		<li>蘸取菌液，均匀划线接种于添加了15 g/L琼脂粉、50 mg/L利福平和50 mg/L链霉素的酵母提取物-甘露醇培养基（YEB）上（YEBARS，pH 7.0）</li>
		<li>在28 °C条件下培养12–16小时</li>
		<li>挑取单克隆菌落，按上述相同方法接种至另一个培养皿中进行培养</li>
		<li>选取单克隆菌落，接种于含有20 mL YEB培养基（添加50 mg/L利福平和50 mg/L链霉素，YEBRS，pH 7.0）的100 mL无菌锥形瓶中，在28 °C、200 rpm条件下振荡培养16–18小时，直至OD600值达到2.0</li>
		<li>取上述培养物的2%–4%，接种至另一含有20 mL YEBRS培养基的100 mL锥形瓶中，在28 °C、200 rpm条件下培养4–5小时，直至OD600值达到约0.5（图1D）</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 结核病组织外植体的感染与筛选
注意：本实验方案的目的是获得遗传转化的毛状根。野生型根被用作阴性对照，以评估转基因表达。在本方案中，根癌农杆菌（A. rhizogenes）预先转化了携带 FtMYB116 基因的双元载体 pK7WG2D，或携带 b4 基因的双元载体 pK7GWIWG2D (II)。
<ol>
	<li>根癌农杆菌（A. rhizogenes）的重悬
	<ol>
		<li>将步骤 2.1.6 中获得的菌液转移至一个 50 mL 的无菌离心管中。</li>
		<li>在 20 °C 条件下，以 4,000 × g 离心 10 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，用添加了 30 g/L 蔗糖和 300 μM 乙酰丁香酮（AS）的 MS 培养基（MSSAS，pH 5.8）重悬菌体沉淀，调节菌液浓度至 OD600 ≈ 0.2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外植体的侵染
	<ol>
		<li>将步骤 3.1.3 中获得的菌悬液注入含有步骤 1.4.6 制备的外植体的锥形瓶中，浸泡 10 分钟（图 1E）。</li>
		<li>取出外植体，用无菌吸水纸吸干表面液体。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 外植体与A. rhizogenes的共培养
<ol>
	<li>将一张无菌的直径为 9 cm 的滤纸放置在 MS 培养基上，该培养基使用 7 g/L 琼脂粉固化，并添加 30 g/L 蔗糖和 100 μM 乙酰丁香酮（MSSAAS 培养基，pH 5.2）。</li>
	<li>将外植体置于滤纸上，在 25 °C 黑暗条件下共培养 3 天（图 1F）。</li>
</ol>
5. 诱导与选择性培养
<ol>
	<li>将约20个感染的外植体放置在添加了500 mg/L头孢噻肟和50 mg/L卡那霉素（Kan）的MSSA培养基（MSSACK，pH 5.8）上（图1G）。</li>
	<li>在25 °C ± 1 °C条件下垂直置于光照环境中培养。毛状根大约在培养1周后出现（图1H中黑色虚线箭头指示毛状根的出现）。 
	注意：如有需要，每15天更换一次MSSACK培养基。</li>
</ol>
6. 结核病毛状根的继代培养
注意：本实验旨在收获生长旺盛的毛状根。在继代培养过程中应定期观察毛状根的生长情况，及时去除被污染或失活的根系。如有需要，可重复以下步骤以扩增更多毛状根。从继代培养到收获大约需要10–14天。
<ol>
	<li>选择呈现白色外观且生长迅速的毛状根。</li>
	<li>将其切成 2–3 cm 的小段。</li>
	<li>在洁净工作台上进行清晰编号。</li>
	<li>将毛状根转接到含有 5 mL MS 培养基的 100 mL 灭菌锥形瓶中，培养基中添加 30 g/L 蔗糖和 50 mg/L 卡那霉素（MSSK，pH 5.8），于 25 °C、80 rpm 振荡、避光培养，直至毛状根蔓延至瓶底（图 1I）。</li>
</ol>
7. 转化毛状根的鉴定与保存
注意：转化的毛状根可根据形态学和基因水平的特征进行鉴定。也可根据毛状根基因组及抗性进行鉴定，但本方案未涵盖这些方法。本实验流程主要聚焦于报告基因和目的基因的鉴定。
<ol>
	<li>去除黄褐色及受污染的毛状根，挑选外观呈白色的毛状根。</li>
	<li>在蓝光/双波长紫外透射仪下观察是否存在绿色荧光。</li>
	<li>将干燥后的毛状根（用吸水纸吸干）在编号试管中或用标记的锡箔纸包裹后，挑选显示强荧光信号的毛状根。</li>
	<li>在液氮中冻干后，将所有收获材料储存于−80 °C，以备进一步分析。</li>
	<li>基因鉴定
	<ol>
		<li>将0.1 g毛状根在液氮中研磨成细粉。</li>
		<li>采用改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法，根据植物基因组DNA提取试剂盒说明书，提取TB独立转基因株系的基因组DNA25。</li>
		<li>以100 ng基因组DNA为模板，使用 表2 所列引物进行聚合酶链式反应（PCR）。</li>
		<li>扩增循环程序如下：94 °C预变性5 min，随后进行36个循环：94 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸30 s，最后在72 °C延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。</li>
		<li>用核酸染料染色后，在紫外光下观察凝胶结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

结核病已在多个与次级代谢产物相关的遗传和代谢水平研究中被使用1,2,5,27,28毛状根培养作为一种独特的代谢物生产来源，在代谢工程中发挥着关键作用29 并通过插入相关基因来改变代谢通路。Kim 等2 首次提出通过TB诱导建立毛状根培养体系 A. rhizogenes-介导的转化以实现酚类化合物的生产。他们在TB毛状根中获得的芦丁含量比野生型根高出10倍以上。在本研究中，引入了 FtMYB116 导致rutin相关基因的表达升高，并显著增加了TB毛状根中rutin的产量。该技术已被证实适用于苯丙烷代谢途径相关基因的表型鉴定及其表达分析，例如 FtF3H 和 FtFLS...

苦荞麦（TB）（Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn）是一种双子叶植物，属于蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum）1。作为一种药食同源的植物，苦荞麦因其独特的化学成分以及对多种疾病的广泛生物活性而受到广泛关注。苦荞麦富含碳水化合物、蛋白质、维生素、类胡萝卜素，以及多酚类物质，如酚酸和黄酮类化合物1。研究表明，黄酮类化合物具有多种生物学和药理学活性，包括抗氧化、抗高血压2、抗炎、抗癌和抗糖尿病等特性3。
Agrobacterium rhizogenes 是一种土壤细菌，可通过感染伤口位点导致多种高等植物（尤其是双子叶植物）产生毛状根病4,5。该过程始于根诱导（Ri）质粒中的T-DNA转移5,6，通常伴随着外源基因在Ri质粒上的整合与表达，以及随后毛状根表型的形成7。A. rhizogenes 介导的转基因毛状根作为植物生物技术领域的一种有力工具，因其稳定且高效的产物表达能力以及可在短时间内便捷获得而被广泛应用。此外，由 A. rhizogenes 诱导产生的毛状根在无激素培养基中表现出明显的向地性生长受抑制和高度分枝的生长特征，易于识别8。毛状根可用于多个研究领域，包括人工种子生产、根瘤研究，以及与其他生物（如菌根真菌、线虫和根部病原体）相互作用的研究7,9。此外，毛状根转化培养物已被广泛用作实验系统，用于研究生物化学途径和化学信号传导，并用于生产作为药物、化妆品和食品添加剂使用的植物次生代谢物8,10。数十年来，研究人员已在多种物种中对野生型毛状根中合成的多种有价值的次生代谢物进行了研究，包括吲哚类生物碱、乌头碱、托烷类生物碱、萜类化合物和黄酮类化合物，例如人参（Panax ginseng）中的人参皂苷11、Ammi majus 中的香豆素12，以及TB中酚类化合物的研究2,13。
利用A. rhizogenes已在27个科的79种植物中成功诱导出毛状根14。例如，已有报道在大豆15,16、Salvia17、Plumbago indica18、Lotus japonicus19以及菊苣（Cichorium intybus L.）20中通过A. rhizogenes介导的转化获得毛状根。TB毛状根转化体系也已被研究2。目前关于携带或不携带双元载体的A. rhizogenes介导毛状根诱导的详细实验方案仍较为有限。例如，Sandra等人21提出了一种在野生型植株茎段中持续产生转基因马铃薯毛状根的方法。将携带gus报告基因的A. rhizogenes注入马铃薯植株茎节后，约5–6周即可观察到完全发育的毛状根。另一项研究也报道了利用携带gusA报告基因的A. rhizogenes在黄麻（Corchorus capsularis L.）中诱导出转基因毛状根系统22。此外，Supaart等人23利用经含有Δ1-四氢大麻酸（THCA）合酶基因的表达载体pBI121转化的A. rhizogenes，获得了转基因烟草毛状根，以实现THCA的生产。
然而，关于高效产生毛状根转化的逐步操作流程，尤其是在土贝母（TB）中的相关方法，目前报道较少。本研究中，我们详细描述了一种利用携带报告基因（GFP）、选择标记基因（Kan）和目的基因（b4，即本课题组鉴定但尚未发表的属于碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）家族的基因）的根癌农杆菌（A. rhizogenes）在土贝母中实现毛状根遗传转化的技术方案。该实验从种子接种到毛状根生成共耗时5至6周，包括外植体准备、侵染、共培养、继代培养及后续扩繁等步骤。此外，本研究还使用携带含有土贝母转录因子Myb116（FtMYB116）基因的双元质粒的A. rhizogenes，通过土贝母毛状根转化体系，验证FtMYB116是否能在基因和代谢水平上促进土贝母中黄酮类物质（尤其是芦丁）的积累。FtMYB116是一种光诱导型转录因子，可在不同光照条件下调控芦丁的合成5。查尔酮合酶（CHS）、黄烷酮-3-羟化酶（F3H）、黄酮-3'-羟化酶（F3'H）和黄酮醇合酶（FLS）24是芦丁生物合成代谢途径中的关键酶。因此，本研究展示了在土贝母毛状根中过表达FtMYB116后，关键酶基因的表达水平以及芦丁和其他黄酮类物质（如槲皮素）含量的变化情况。

<table><tbody><tr><td>2*Taq PCR MasterMix</td><td>Aidlab，中国</td><td>PC0901</td><td></td></tr><tr><td>琼脂粉</td><td>Solarbio生命科学，北京，中国</td><td>A8190</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 2720 梯度PCR仪</td><td>ThermoFisher Scientific，美国</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>AS</td><td>Solarbio生命科学，北京，中国</td><td>A8110</td><td>用DMSO溶解，100 mM</td></tr><tr><td>双元载体</td><td>ThermoFisher Scientific (invitrogen)，美国</td><td>/</td><td>pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)</td></tr><tr><td>头孢噻肟钠</td><td>Solarbio生命科学，北京，中国</td><td>C8240</td><td>用水溶解，200 mg/mL</td></tr><tr><td>CF15RXII高速冷冻离心机</td><td>日立，日本</td><td>No. 90560201</td><td></td></tr><tr><td>一次性培养皿</td><td>广华医疗器械厂，扬州，中国</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>DYY-6C电泳仪</td><td>北京六一，中国</td><td>ECS002301</td><td></td></tr><tr><td>EASYspin Plus植物RNA提取试剂盒</td><td>Aidlab，中国</td><td>RN38</td><td></td></tr><tr><td>ELGA purelab ultra bioscience纯水系统</td><td>ELGA LabWater，英国</td><td>82665JK1819</td><td></td></tr><tr><td>Epoch微孔板分光光度计</td><td>biotek，美国</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP/LR反应酶</td><td>ThermoFisher Scientific (invitrogen)，美国</td><td>11789100/11791110</td><td></td></tr><tr><td>HYG-C多功能摇床</td><td>苏州培英实验设备有限公司，中国</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Kan</td><td>Solarbio生命科学，北京，中国</td><td>K8020</td><td>用水溶解，100 mg/mL</td></tr><tr><td>MLS-3750高压灭菌器</td><td>三洋，日本</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>含维生素的MS盐</td><td>Solarbio生命科学，北京，中国</td><td>M8521</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Solarbio生命科学，北京，中国</td><td>S8210</td><td></td></tr><tr><td>其他未指明化学品</td><td>北京化工厂，中国</td><td></td><td>乙醇、升汞等</td></tr><tr><td>PHS-3C pH计</td><td>上海仪电科学仪器股份有限公司，中国</td><td>a008</td><td></td></tr><tr><td>植物基因组DNA提取试剂盒</td><td>天根生化科技（北京）有限公司</td><td>DP305</td><td></td></tr><tr><td>利福平</td><td>Solarbio生命科学，北京，中国</td><td>R8010</td><td>用DMSO溶解，50 mg/mL</td></tr><tr><td>壮观霉素</td><td>Solarbio生命科学，北京，中国</td><td>S8040</td><td>用水溶解，100 mg/mL</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Solarbio生命科学，北京，中国</td><td>S8270</td><td></td></tr><tr><td>Trans2K DNA Marker</td><td>全式金生物技术，北京，中国</td><td>BM101-01</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Solarbio生命科学，北京，中国</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Whatman直径9 cm滤纸</td><td>杭州沃华滤纸有限公司</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物粉末</td><td>Solarbio生命科学，北京，中国</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

诱导毛状根 根癌农杆菌-介导的苦荞转化fagopyrum tataricum)

Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

苦荞（TB）[Fagopyrum tataricum （L.）Gaertn] 因含有丰富的黄酮类等次生代谢产物，特别是芦丁，而具有多种生物活性和药理活性。 根癌农杆菌 已在世界范围内逐渐被用于诱导药用植物产生毛状根，以研究基因功能并提高次生代谢产物的产量。在本研究中，我们描述了一种生成毛状根的详细方法 A. rhizogenes-在TB中诱导毛状根。选取7–10天龄的子叶和下胚轴作为外植体进行感染。 A. rhizogenes 携带一个双元载体，该载体诱导产生不定毛状根，毛状根在1周后出现。通过形态学特征、抗性筛选（卡那霉素）和报告基因表达（绿色荧光蛋白）鉴定所获得的毛状根转化。随后，根据需要对转化的毛状根进行自体扩增。同时，一个骨髓母细胞病病毒癌基因（MYB）转录因子， FtMYB116，通过TB基因组转化 A. rhizogenes介导的毛状根以验证其功能 FtMYB116 在合成类黄酮方面。结果表明，类黄酮相关基因的表达以及类黄酮化合物（芦丁和槲皮素）的产量均显著升高（p &#60; 0.01）促进的 FtMYB116，表明 A. rhizogenes介导的毛状根可作为研究基因功能和次生代谢物生产的有效替代工具。本研究中描述的毛状根诱导的详细逐步操作方案，经适当调整后，可适用于任何遗传转化或其他药用植物。

Agrobacterium rhizogenes介导的TB毛状根转化 
本研究描述了利用A. rhizogenes获得遗传转化毛状根所建立的逐步实验方案。从TB种子接种到鉴定并收获毛状根，整个过程大约需要5–6周，其中一些关键步骤如图1（A–H）所示。简要而言，经灭菌处理的去壳种子被接种（图1B），以实现快速的无菌萌发。A. rhizogenes（图1D）和无菌外植体应分别提前活化和准备。随后进行若干关键步骤，包括用活化的A. rhizogenes感染外植体（图1E）、共培养（图1<strong...

我们描述了一种通过根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的遗传转化方法，用于在苦荞（Fagopyrum tataricum）中诱导产生毛状根。该方法可用于研究苦荞中基因功能及次生代谢产物的生成，适用于任何遗传转化实验，或经优化后用于其他药用植物的研究。

诱导毛状根 根癌农杆菌-介导的苦荞转化Fagopyrum tataricum)

苦荞（TB）[Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] 因含有丰富的活性成分而具有多种生物和药理活性……

通过本实验方案，我们将首次演示在苦荞中诱导产生毛状根的逐步操作流程。该技术为开展苦荞及其他植物的基因组学和微生物组学研究提供了一种简便且经济的方法。尽管本详细方法是针对苦荞建立的，但经过适当修改后，也可应用于其他双子叶植物。尽管该方法操作简便，但包含许多细节步骤。通过视频演示可帮助研究人员更高效地实现毛状根诱导。本实验操作将由我实验室的硕士研究生Guangtao Qian进行示范。首先选择饱满且无损伤的苦荞种子，将种子放入28摄氏度的水中浸泡约20分钟。当种皮易于去除时，取100至200粒去皮种子，放入含有75%乙醇的无菌100毫升锥形瓶中，浸泡30秒。消毒结束后，将乙醇更换为5%次氯酸钠。15 分钟后，倾去次氯酸钠溶液，用无菌去离子水将种子清洗五次。然后用无菌吸水纸将种子吸干。为获得苦荞麦幼苗，将 10 粒种子分别加入含有 50 毫升 MSSA 培养基的 300 毫升植物组织培养瓶中，每瓶接种 10 粒种子。然后，在培养室中于25 ± 1 °C条件下，在光照环境中使种子萌发。7至10天后，选取具有两片展开子叶的健壮幼苗，将幼苗与根部分离。将幼苗置于无菌培养皿中，并将下胚轴切成0.8至1厘米长的片段。将子叶剪切成约0.5厘米大小的片段，并将获得的外植体在光照条件下预培养24小时。次日，将外植体转移至已灭菌的100毫升锥形瓶中。为活化A.rhizogenes，先将菌种在冰上解冻，然后均匀涂布于含抗生素的YEB固体培养基上，在28°C下培养12至16小时。第二天早晨，挑选一个单克隆菌落，接种至新的培养皿中进行培养，操作方法如前所述。再经过12至16小时的培养后，将获得的单克隆菌落接种于已灭菌的100毫升锥形瓶中，瓶内含20毫升添加抗生素的YEB固体培养基，在28摄氏度、200转/分钟条件下振荡培养16至18小时，直至600纳米处的光密度达到2.0。随后，取2-4%的菌液转接至另一新的100毫升锥形瓶中，瓶内含20毫升新鲜的添加抗生素的YEB固体培养基，在28摄氏度、200转/分钟条件下继续培养4至5小时，直至600纳米处的光密度约为0.5。为了诱导毛状根转化，将农杆菌（A. rhizogenes）菌液转移至无菌的50毫升锥形管中，通过离心收集菌体。用MSSAS培养基重悬菌体沉淀，调节菌液光密度至约0.2，然后将菌液注入外植体培养瓶中。10分钟后，将外植体从培养瓶中取出，并用无菌吸水纸吸干表面液体。然后将一片无菌的直径为9厘米的滤纸放置于MSSAAS培养基平板上，并将外植体铺在滤纸上，于25摄氏度避光条件下培养3天。培养结束后，将约20个已感染的外植体转移至MSSACK培养基中，在25±1摄氏度、光照条件下垂直培养植株。经过10至14天的培养后，挑选表现出白色外观且生长迅速的毛状根，并将其切成2至3厘米长的小段。在洁净台面上对根系进行清晰编号。将根段转接至含有MSSK培养基的灭菌100毫升锥形瓶中，在25摄氏度、80转/分钟、避光条件下进行继代培养，直至根系蔓延至瓶底。为鉴定毛状根，需剔除呈褐色及受污染的毛状根，选取外观呈白色的毛状根。如果使用了报告基因，在蓝光或双波长紫外透射仪下检查根部的荧光，并选择表现出强荧光信号的毛状根。然后用吸水纸将根部擦干，并用标记好的铝箔包裹，立即进行分析。对于长期保存，将根部在液氮中冻干，然后置于-80摄氏度条件下保存，直至后续检测。经过遗传转化和培养后，如图所示，毛状根将在外植体的伤口部位呈现出蓬松的白色，并以偏地性生长方式形成高度分枝且相互交错的网络结构。可利用报告基因在蓝色或双光长波紫外透射光下便于区分转基因毛状根，或用于鉴定目标基因。此处展示了在苦荞毛状根转基因株系中光诱导转录因子的相对表达水平。值得注意的是，在代谢水平上，诱导转录因子过表达也能促进芦丁和槲皮素的生物合成。此外，三个转基因株系中类黄酮合成途径基因的相对表达量均显著高于对照组，表明在苦荞外植体中成功实现了毛状根转化。即种子的感染、外植体的选择以及菌液浓度会直接影响毛状根诱导的成功率。我们可以通过评估基因表达、DNA-蛋白质或蛋白质-蛋白质相互作用，以及次级代谢产物的大量生成，来研究次级代谢产物的转录调控。这些经过基因改造的细菌对人类及其环境具有潜在危害。请务必谨慎操作、使用并妥善处理这些细菌。

inducing-hairy-roots-agrobacterium-rhizogenes-mediated-transformation

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Genetics

遗传学

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了解利用发根农杆菌介导转化技术在苦荞麦中诱导毛状根的方法。该技术简便经济，适用于苦荞麦及其他双子叶植物的基因组学和微生物组学研究。

诱导毛状根根癌农杆菌-介导的苦荞转化Fagopyrum tataricum)

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