利用无细胞细菌提取物、脂质体和乳剂转移制备蛋白质合成型人工细胞
2020年4月27日
本方案描述了自下而上构建可合成RNA和蛋白质的人工细胞的方法、材料、设备及步骤。人工细胞的内部水相包含S30细菌裂解液，该裂解液通过水包油乳液转移法被封装于脂质双层（即稳定的脂质体）内。
可产生蛋白质的合成细胞为研究生命起源以及开发基于合成细胞的先进药物递送疗法提供了多功能平台。该方法在RNA和蛋白质表达方面操作简便且成本低廉，可用于在体内直接进行现场治疗性蛋白质生产。该系统可用于治疗多种疾病，从代谢性疾病和蛋白质替代疗法，到癌症乃至糖尿病。
该多步实验方案具有明确的暂停点。首次操作时，建议将工作分在数天内完成。合成细胞制备方案始于无细胞 S30-T7 裂解液的制备。
接下来，制备膜脂和细胞营养液，以模拟细胞内环境并支持蛋白质的合成。最后一步是制备合成细胞本身。在100毫升锥形瓶中制备两份平行的起始培养物。
向每个锥形瓶中加入5毫升LB培养基，其中添加50微克/毫升氨苄青霉素，并接种单个大肠杆菌菌落。将培养物置于摇床培养箱中，于37摄氏度、250 rpm条件下过夜培养。接着，准备含有500毫升TB培养基的2升挡板式锥形瓶，培养基中添加50微克/毫升氨苄青霉素。
用5毫升的种子培养液接种每个2升的锥形瓶。将锥形瓶置于摇床中，在250 rpm和37°C条件下培养。使用分光光度计定期监测培养物，并继续培养至OD600在0.8至1.0之间。
为了诱导T7 RNA聚合酶表达，向每个烧瓶中加入3毫升100毫摩尔的IPTG，使其终浓度达到0.6毫摩尔。继续培养菌液，直至OD600达到约4。当菌液达到目标光密度后，将每个锥形瓶中的菌悬液转移至两个250毫升的灭菌离心管中。
在4 °C条件下，以7,000 × g离心10分钟。弃去上清液。根据需要，使用搅拌器将每个沉淀重悬于250 mL冷的S30裂解缓冲液中。
在4°C条件下，以7,000 × g离心10分钟。弃去上清液，并将所有沉淀物一同重悬于15毫升冰冷的S30裂解缓冲液中。使用纱布垫过滤悬浮液。
在进行下一步之前，将用于储存裂解液的1.5毫升离心管中的枪头预先冷却。将悬浮液匀浆两次。使用15,000 PSI的工作压力和4 bar的气压进行细胞破碎。
收集匀浆液。每10毫升匀浆悬浮液中加入100微升0.1摩尔的DTT。在4摄氏度下，以24,700 × g离心30分钟。
DTT 和氯仿被归类为刺激性与有害物质，因此应谨慎操作。后续步骤中使用的氯仿必须在具备通风橱的区域操作。为保持裂解液的活性，该步骤应迅速完成。
将上清液分装至预冷的离心管中，每管200微升，并立即用液氮速冻。将样品管储存于负80摄氏度，以备后续使用。分别将POPC和胆固醇各自溶于氯仿中，配制成终浓度为100毫克/毫升的溶液。
分别涡旋每个小瓶。将组分加入一个2毫升的玻璃小瓶中。加入50 µL胆固醇-氯仿溶液、50 µL POPC-氯仿溶液和500 µL矿物油。
涡旋小瓶，然后在化学通风橱中于80摄氏度加热约一小时，以蒸发氯仿。在开始合成细胞制备阶段之前，按照论文所述配制外层溶液、预内层溶液和喂养溶液。随后，将1.2毫升外层溶液加入15毫升离心管中，并从第一个玻璃小瓶中缓慢加入500微升油中脂质溶液，形成一层。
将试管在室温下孵育 20 分钟。为完成内相溶液的制备，加入 S30-T7 裂解液和 DNA 质粒，在冰上混合至终体积为 100 微升。取 100 微升含有裂解液和质粒的内相溶液，加入第二个含有 500 微升油中脂质溶液的 2 毫升玻璃小瓶中。
剧烈吹打一分钟，然后在五档转速下涡旋震荡另一分钟。将所得乳液在碎冰上孵育10分钟后，缓慢将其加至15毫升离心管中油相的上层。在4°C条件下以100 × g离心10分钟。
然后在400 × g、4 °C条件下离心10分钟。离心结束后，应在离心管底部观察到沉淀。为提取沉淀，首先去除多余的油层。
接下来，用剪切过的移液枪头吸取约 400 微升外层溶液，利用该枪头收集沉淀，并在枪头穿过油相时释放外层溶液。擦拭移液枪头后，将沉淀转移至一支洁净的 1.5 毫升离心管中。在 4 摄氏度条件下，以 1,000 × g 离心 10 分钟。
去除上清液，将沉淀重悬于100 µL培养液中。进行蛋白表达时，将悬液在37 °C下孵育2小时，不振荡。表达模型蛋白sfGFP和海肾荧光素酶的质粒被引入无细胞蛋白合成（CFPS）大量反应及合成细胞中。
通过多种方法评估了蛋白质的表达。Western 印迹分析检测到在无细胞蛋白合成（CFPS）整体反应体系以及合成细胞内均有 sfGFP His6 的表达。纯化的 sfGFP His6 被用作阳性对照。
使用明场和GFP滤光片的荧光显微镜观察表达sfGFP的合成细胞。采用流式细胞术分析表达sfGFP的合成细胞。活性合成细胞群体的计算基于阴性DNA样本（以红色直方图表示）所定义的sfGFP荧光强度阈值。
合成细胞中sfGFP的平均荧光强度基于有活性的合成细胞群体计算，并以阴性DNA样本为基准进行归一化处理。有活性合成细胞的直径分布根据sfGFP信号计算得出。Renilla荧光素酶活性通过发光检测进行定量。
该方法具有高度的通用性，可通过改变裂解液来源、脂质组成以及内部溶液浓度，针对不同的目标蛋白进行优化。可通过流式细胞术（FACS）分析产生荧光标记蛋白的合成细胞，以定量测定具有活性的合成细胞所占比例。蛋白质印迹（Western blot）分析可用于检测蛋白的表达水平。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本方案概述了利用油包水乳液转移法制备可合成RNA和蛋白质的人工细胞。该人工细胞将S30细菌裂解液包裹于脂双层内，为治疗应用提供了平台。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物技术
- 合成生物学
- 无细胞系统
背景
- 合成细胞可以模拟生物功能。
- 它们可用于研究生命的起源。
- 这些细胞可用于现场治疗性蛋白质的生产。
- 应用包括多种疾病的治疗。
研究目的
- 开发一种合成细胞的制备方法。
- 促进RNA和蛋白质的表达。
- 探索在药物递送中的治疗应用。
使用的方法
- 制备无细胞 S30-T7 裂解液。
- 将裂解液封装于脂双层中。
- 采用水包油乳液转移法。
- 具有明确暂停点的多步操作流程。
主要结果
- 成功将S30裂解液封装于合成细胞中。
- 展示了在现场进行蛋白质生产的潜力。
- 为多种治疗应用提供了多功能平台。
- 该方案可在数天内分步完成，以提高效率。
结论
- 合成细胞是用于研究和治疗的一种有前景的工具。
- 该方法简单且具有成本效益。
- 在治疗代谢性疾病和癌症方面具有潜在应用价值。
常见问题
行业重要性概要
该方案通过自下而上的方式组装合成细胞，实现可控的蛋白质生产，为早期发现阶段的靶点验证和机制性风险降低提供了一个多功能平台。通过将无细胞表达系统包裹在脂质囊泡中，该方法可支持可重复的定量输出，适用于检测方法开发和表型筛选。该策略有助于从发现阶段到临床前阶段的转化连续性，尤其适用于治疗性蛋白质生产和药物递送应用。
生物制药研发中的策略性应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够在分离的、模拟细胞的环境中研究转录和翻译机制。
- 操作价值：通过可测量的蛋白质产出提供一个明确的系统，用于功能靶点的验证。
- 预测价值：通过快速测试遗传构建体的蛋白质表达效率，支持先导分子的鉴定。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成定量的荧光和发光读数，用于遗传变异的高内涵筛选。
- 操作价值：通过封装裂解液和可控的内溶液组成，实现蛋白质表达检测的标准化。
- 可扩展性：可大规模生产数百万个人工细胞，用于可重复的化合物或构建体评估。
转化与临床前研究
- 转化相关性：作为治疗性蛋白质按需生产的可控平台，支持临床前概念验证。
- 机制去风险化：可在独立条件下研究蛋白质/RNA的活性，减少信号通路解读中的不确定性。
- 预测可靠性：可在整合到细胞系统之前，评估表达产量和稳定性。
流程与工作流整合
该方法通过提供一种无细胞表达系统，将基因设计与功能验证相连接，并在基于细胞的检测和临床前模型之前进行，从而整合到早期发现工作流程中。
- 发现生物学：通过在最简系统中直接测量蛋白质合成，支持对基因构建体的假设验证。
- 筛选：提供即用型合成细胞，具有定量输出（荧光、发光），用于评估表达性能。
- 分析：通过sfGFP强度阈值和活性细胞群体计算，实现蛋白质生产数据的标准化。
- 转化研究：通过在具备递送能力的体系中展示治疗性蛋白质生产的潜力，衔接临床前研究。
- 企业级复用：通过裂解液和质粒的可互换性，建立适用于多个靶标的可重复使用蛋白质生产平台。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低细胞复杂性并分离转录-翻译过程，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化裂解液制备、脂质包封和乳液转移步骤，增强实验可重复性。
- 战略价值：在投入细胞系统之前，通过快速、低成本地迭代表达载体，提高资本使用效率。
- 项目组合影响：通过提供关于蛋白产量和功能的早期定量数据，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备细菌培养、无细胞裂解液制备和脂质操作方面的专业知识。
- 依赖于分光光度计、离心机、匀浆器以及荧光/发光检测仪等仪器设备。
- 需要在不同团队之间对裂解液活性、脂质组成和内溶液配方进行标准化。
- 需根据质粒构建体和目标蛋白的不同，通过调整裂解液来源和浓度来适应实验条件。
- 存在实际限制，例如需低温操作、氯仿处理时需使用通风橱，以及多日实验需明确设定暂停节点。
