含溶血磷脂的温度敏感脂质体的微流控制备

微流控技术是一种新兴方法，可用于制备粒径可调、重现性高且可放大的纳米级脂质体。本方案能够连续高效地生产对低温敏感的脂质体，并实现与阿霉素等化疗药物及吲哚菁绿等荧光染料的共载。细胞制备主要采用自上而下的方法，例如脂质膜水化法和挤出法。

制备用于临床应用的大规模且可重复的批次仍然具有挑战性。微流控技术的一个主要优势在于，能够在空间和时间上高度可控地处理微量液体，并以连续和自动化的方式运行。本次实验操作将由我实验室的博士后研究人员马广龙和阿玛利亚·鲁伊斯演示，与蔡 Calvin Cheung 一同完成。

组装注射泵时，使用泵间网络电缆将从注射泵的“连接计算机”端口连接到主注射泵的“连接网络”端口。使用计算机至泵的网络电缆将主泵的“连接计算机”端口连接到计算机的 RS-232 串行端口。组装交错鱼骨形微混合器微流控装置时，使用螺母和卡套将管路连接至装置的各个入口和出口。

然后使用第二个螺母、卡套和连接组件，将两根进样管的末端均转换为雌性鲁尔接头。设置泵控制软件时，使用注射泵上的设置按钮，将主注射泵和次级注射泵的地址分别设置为 Ad:01 和 Ad:02，然后在计算机上打开泵控制软件。两个注射泵应被自动识别，并伴随一声蜂鸣音。

选择 HSW Norm-Ject 5cc，其直径等于 12.45，将直径设定为 12.45 毫米。将泵一的流速设为 0.25 毫升/分钟，泵二的流速设为 0.75 毫升/分钟。将体积设置为大于 5 毫升的任意值，并为两个泵选择输注模式。

然后点击“设置”以确认参数。要配制 LTSL10 或 LTSL10 ICG 脂质混合物，使用一支 5 毫升鲁尔锁扣注射器吸取 1 毫升脂质混合物，并用另一支 5 毫升鲁尔锁扣注射器吸取至少 3 毫升硫酸铵溶液。将注射器筒体的凸缘滑入泵上的注射器固定架中，将装有液体的注射器以直立位置安装到注射泵上，并将注射器推杆的凸缘连接至泵的推块，再将加热带的另一端和带有恒温器的温度探头缠绕在装有脂质溶液的注射器周围。

将加热带末端包裹在装有水溶液的注射器上，将装有脂质混合物的注射器连接至乙醇入口，将装有硫酸铵溶液的注射器连接至水相入口。必要时调整推杆位置，以排除注射器中的任何气泡，并以10秒为间隔反复插拔加热带电源，直至注射器温度达到约51摄氏度。当温控器显示温度适宜时，在泵控制软件中点击“运行全部”以启动注射泵，检查流体流动是否无气泡且无泄漏。

将脂质体样品收集到小瓶中，并在任一注射器即将排空时暂停或停止输注。收集的脂质体溶液在60摄氏度水浴中退火1.5小时，随后转移至透析袋中，在37摄氏度下用1升240毫摩尔硫酸铵溶液透析至少4小时。然后将纯化的脂质体在4摄氏度下保存。

为通过跨膜 pH 梯度实现脂质体的远程载药，将 25 毫升 HBS 加载至尺寸排阻色谱柱顶部，并使所有洗脱液流过色谱柱。将 1 毫升透析后的脂质体加样至该色谱柱。当所有脂质溶液均通过色谱柱后，向柱中加入 1.5 毫升新鲜 HBS。

当所有缓冲液流经层析柱后，向柱中加入三毫升新鲜的 HBS 缓冲液并收集流出液。接下来，按 1:20 的 DOX:磷脂摩尔比将 DOX 溶液加入一毫升透析置换缓冲液后的脂质体溶液中，置于 Biju 小瓶内，将小瓶放入 37 摄氏度水浴中孵育 1.5 小时。载药完成后，按前述方法通过尺寸排阻色谱法纯化脂质体。

为通过激光加热触发脂质体内容物的释放，将水浴温度设置为37摄氏度。待温度稳定后，向透明96孔板的每孔中加入200微升载有阿霉素（DOX）的脂质体，并将该板放入水浴中，使板底浸入水中。然后将激光系统电流设置为2.27安培，并将激光系统准直器置于96孔板表面垂直上方5厘米处。

打开激光器，并使用光纤温度探头每分钟监测一次温度。在5分钟和10分钟时，从透明96孔板的每个孔中吸取10微升载药阿霉素（DOX）的脂质体，加入190微升HBS缓冲液至黑色96孔板的三个独立孔中。为评估药物的完全释放，将10微升脂质体与170微升HBS缓冲液以及20微升1% Triton X-100去垢剂溶液混合于黑色96孔板的三个独立孔中。

然后使用酶标仪测定阿霉素（DOX）的荧光强度。LTSL4 的微流控制备产生一种凝胶状的黏稠溶液，表现为含有大量滞留的气泡，而 LTSL10 的制备则形成一种澄清且无黏性的液体。在 51 摄氏度下制备的 LTSL10 的动态光散射测量结果显示，其 Z 平均直径和分散度符合预期，表明实验成功。

然而，当在 20 摄氏度下制备 LTSL10 时，所得脂质体粒径较大且分布更分散，导致产品次优。通过传统的脂质膜水化结合挤出法制备的 LTSL，其阿霉素（DOX）包封效率为 50–80%。经过退火处理后，采用微流控技术制备的 LTSL10 的 DOX 包封效率显著提高，平均达到 85%，表明 DOX 的远程载药成功，并形成了跨膜 pH 梯度。LTSL10 的 DOX 释放曲线已被证实具有温度敏感性。

LTSL10具有相对较宽的相变过程，起始温度为41.6摄氏度，峰值出现在42.6摄氏度。ICG的装载效率取决于初始ICG浓度以及样品的粒径和分散性。此外，使用近红外激光照射LTSL10中的ICG可产生光热效应，从而触发DOX的释放。

进行该操作时，必须确保流体流动稳定，从而使流体混合及脂质体的形成具有可重复性。脂质体退火和透析是确保获得高载药量稳定脂质体制剂的两个关键步骤。此外，还可通过体内实验评估LTSL10的生物分布、药物释放及抗肿瘤活性。

本方案可用于成功制备不含胆固醇但含有溶血磷脂的热敏脂质体，适用于药物递送应用。