Name: 含脂脂的微流体生产-温度敏感脂质体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 了解使用交错鱼骨微混合器微流控设备制备温度敏感脂质体的方法，实现阿霉素与吲哚菁绿的共包封及光热触发释放，用于可控药物递送系统。

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感谢英国前列腺癌基金会（CDF-12-002 研究员项目）和工程与物理科学研究委员会（EPSRC）（EP/M008657/1）提供的经费支持。

1. 仪器设置
<ol>
	<li>按以下步骤组装注射泵和SHM。
	<ol>
		<li>使用泵对泵网络电缆，将次级注射泵（泵02，用于水溶液）的“连接至计算机”端口与主注射泵（泵01，用于乙醇脂质溶液）的“连接至网络”端口相连（图1，黄色）。</li>
		<li>使用PC对泵网络电缆，将主泵的“连接至计算机”端口与计算机的“RS232串行”端口相连（图1，蓝色）。</li>
		<li>使用螺母和卡套将管路连接至SHM的各个入口和出口。使用另一个螺母、卡套和连接组件，将两个入口的管路末端转换为雌性鲁尔接头。入口处使用较长的管路可更方便地连接至注射器（图2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置泵控制软件。
	<ol>
		<li>使用注射泵上的“设置”按钮，将主注射泵和次级注射泵的地址分别设置为“Ad:01”和“Ad:02”。此操作仅需在首次使用时进行。</li>
		<li>在计算机上打开泵控制软件。两个注射泵应被自动识别，并伴随一声蜂鸣音。若未识别，请点击泵和搜索泵以更新连接（图3）。</li>
		<li>选择“HSW Norm-Ject 5 cc (Dia=12.45)”以设置直径为12.45（mm）。</li>
		<li>将泵01（乙醇脂质溶液）的流速设为0.25 mL/min，泵02（水溶液）的流速设为0.75 mL/min。该流速对应总流速（TFR）为1 mL/min，水相与乙醇相流速比（FRR）为3。</li>
		<li>将体积设置为大于5 mL的任意值。 
		注：目标输注体积应大于装载的液体体积，以考虑管路的死体积。</li>
		<li>为两个泵选择INF（输注）模式。</li>
		<li>按下设置以确认参数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备 LTSLs
<ol>
	<li>制备 LTSL10 或 LTSL10-ICG 脂质混合物（见表 1）。</li>
	<li>使用两个 5 mL 鲁尔锁紧注射器，分别吸取 1 mL 脂质混合物和至少 3 mL 的 (NH4)2SO4 溶液。</li>
	<li>将两个注射器垂直安装到注射泵上，方法是将注射器筒体的凸缘滑入泵的注射器固定架，将注射器推杆的凸缘对准泵的推块（图 4）。</li>
	<li>将加热带的一端缠绕在装有水相溶液的注射器上。将加热带的另一端和恒温器的温度探头缠绕在装有脂质溶液的注射器周围。建议先用空注射器练习此步骤，以便更顺利地完成组装（图 5A）。</li>
	<li>将两个注射器连接至 SHM 上对应入口的雌性鲁尔接头。确保装有脂质混合物和 (NH4)2SO4 溶液的注射器分别连接至乙醇入口和水相入口。调整推杆位置，以排除注射器中的气泡（图 5B）。 
	注意：确保注射器仍牢固地固定在泵的注射器固定架上。</li>
	<li>使用加热带以 10 秒为一个加热周期，将注射器加热至 51 °C 以上。等待恒温器更新注射器的温度。在后续步骤中重复此操作，以在输注过程中维持温度。 
	警告：加热 10 秒后应关闭加热带，以防止温度过冲，并让恒温器更新实际温度。操作加热带时需格外小心，因其升温迅速。持续加热可能因恒温器存在测温延迟而损坏设备和注射器。</li>
	<li>当温度升至 51 °C 以上后，按下泵控制软件中的运行全部按钮，启动注射泵（图 3）。</li>
	<li>确保液体流动无气泡且无泄漏。将出口流出的初始液体（约 0.5 mL）作为废液弃去。 
	注意：该初始废液体积并非固定值，取决于装置的内部体积，即液体从注射器经管路和 SHM 流至出口所需的体积。</li>
	<li>将后续流出的液体收集至微量离心管或小瓶中，作为脂质体样品。</li>
	<li>当任一注射器中的液体即将耗尽时，暂停或停止输注。 
	注意：应手动停止泵，因为当注射器为空时，泵可能无法准确检测推杆位置。</li>
	<li>将收集的脂质体溶液置于 60 °C 水浴中退火 1.5 小时。 
	注意：此步骤对于实现药物装载至脂质体中至关重要。</li>
	<li>将溶液转移至透析管中，在 37 °C 条件下用 1 L 的 240 mM (NH4)2SO4 溶液透析至少 4 小时，以获得纯化的脂质体。 
	注意：此步骤可作为暂停点。此阶段的脂质体磷脂浓度为 5 mM。纯化后的脂质体可在 4 °C 下保存。</li>
	<li>为清洁 SHM 以便重复使用，需依次用去离子水、乙醇冲洗，并用氮气吹干。</li>
</ol>
3. 通过跨膜 pH 梯度将阿霉素（DOX）远程载入 LTSLs
<ol>
	<li>使用尺寸排阻色谱法（SEC）将LTSLs的外部缓冲液置换为HEPES缓冲盐水（HBS），以建立跨膜pH梯度。
	<ol>
		<li>向SEC柱顶部加入共25 mL的HBS以平衡色谱柱。让所有洗脱液流出色谱柱，并弃去流出液。</li>
		<li>将步骤2.12制备的1 mL透析后脂质体加入色谱柱中，并弃去流出液。</li>
		<li>向色谱柱中加入1.5 mL HBS，并弃去流出液。</li>
		<li>向色谱柱中加入3 mL HBS，并收集3 mL的洗脱液。 
		注：本步骤可暂停。此时收集脂质体，磷脂浓度为1.67 mM。缓冲液置换后的脂质体可在4 °C下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将LTSLs与阿霉素（DOX）孵育并纯化LTSLs。
	<ol>
		<li>将DOX溶液按DOX与磷脂摩尔比1:20加入含有1 mL缓冲液置换后脂质体溶液（1.67 mmol）的螺口小瓶中。可通过加入48.4 µL浓度为1 mg/mL的DOX溶液（83.4 µmol）实现。</li>
		<li>将螺口小瓶置于37 °C水浴中孵育1.5小时，使DOX载入脂质体中。</li>
		<li>在黑色96孔板中，将10 µL脂质体与170 µL HBS和20 µL 1% (v/v) Triton X-100溶液混合。重复三孔。这些孔对应“纯化前”的DOX含量。</li>
		<li>若制备LTSL10-ICG，则在透明96孔板中将40 µL脂质体与160 µL DMSO混合。重复三孔。这些孔对应“纯化前”的ICG含量。</li>
		<li>按照步骤3.1所述方法纯化脂质体溶液。 
		注：若需重复使用色谱柱进行后续纯化，应在执行步骤3.1.1前，先向柱中加入1 mL稀释的0.5 M NaOH溶液清洗游离DOX。游离DOX呈红色，会转变为紫蓝色并快速流出色谱柱。</li>
		<li>在黑色96孔板中，将30 µL纯化后的脂质体溶液与150 µL HBS和20 µL 1% (v/v) Triton X-100溶液混合。重复三孔。这些孔对应“纯化后”的DOX含量。</li>
		<li>对于LTSL10-ICG，在透明96孔板中将40 µL纯化后的脂质体溶液与160 µL DMSO混合。重复三孔。这些孔对应“纯化后”的ICG含量。</li>
		<li>使用酶标仪测量纯化前（步骤3.2.3）和纯化后（步骤3.2.6）各孔的DOX荧光强度（λex = 485 nm，λem = 590 nm）。</li>
		<li>通过纯化前后荧光强度的比值计算DOX包封率（DOX EE）。 
		<img alt="阿霉素包封率公式，DOX EE%=纯化后/纯化前荧光强度 × 100，方程。" src="/files/ftp_upload/60907/60907eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 1"></li>
		<li>使用酶标仪测量纯化前后各孔的ICG吸光度（600 至 1000 nm）。</li>
		<li>根据纯化前后792 nm处吸光度的比值，并考虑纯化过程中稀释倍数（3倍），计算ICG包封率（ICG EE）。 
		<img alt="ICG包封率公式；吸光度方程；纯化分析。" src="/files/ftp_upload/60907/60907eq2a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 2"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 动态光散射（DLS）
<ol>
	<li>将50 µL脂质体溶液（步骤2.12）加入450 µL去离子水中。</li>
	<li>将比色皿放入动态光散射（DLS）仪器中，并根据制造商的说明进行测量。</li>
	<li>记录每份样品三次测量的平均Z均粒径和分散度。</li>
</ol>
5. 差示扫描量热法（DSC）
<ol>
	<li>使用离心过滤装置将1 mL脂质体样品（步骤2.12）浓缩至0.5 mL（最终脂质浓度为10 mM）。使用固定角转子，在7500 × g 条件下离心约15分钟。</li>
	<li>分别取20 µL (NH4)2SO4 溶液和脂质体样品加入两个差示扫描量热仪（DSC）样品坩埚中。使用DSC样品压盖工具包将坩埚用密封盖密封。</li>
	<li>使用差示扫描量热仪，以1 °C/min的升温速率，测量样品在30 °C至60 °C范围内的热力学变化。</li>
	<li>使用适当的软件分析数据。以相变起始温度（Tm）作为相变（熔融峰）的起始点，该温度通过最大斜率点切线与x轴交点确定。</li>
</ol>
6. 阿霉素释放
<ol>
	<li>使用水浴将 HBS 预热至指定温度（37 或 42 °C）。准备冰水浴用于淬灭样品。</li>
	<li>将 100 µL 纯化的载药阿霉素脂质体（步骤 3.2.5）加入含有 1.9 mL HBS 的微量离心管中。将该管置于指定温度的水浴中。</li>
	<li>立即从管中取出 200 µL 样品，并迅速放入冰水浴中，以终止后续药物释放。此样品对应初始时间点（t = 0）。</li>
	<li>在后续时间点（t = 5、10、15、30、60 分钟）分别取出 200 µL 样品，并迅速放入冰水浴中以终止药物释放。</li>
	<li>在黑色 96 孔板中，将每个时间点的 50 µL 样品与 150 µL HBS 混合。使用酶标仪测定阿霉素的荧光强度。</li>
	<li>向步骤 6.5 中随机选择的孔中加入 20 µL 的 1%（v/v）Triton X-100。使用酶标仪测定这些孔的阿霉素荧光强度。这些数值对应完全释放（t = ∞；100% 释放）时间点。</li>
	<li>通过将各时间点的荧光强度（I(t)）与初始（I(0)）和完全释放（I(∞)）的荧光强度进行比较，计算并绘制阿霉素释放百分比。 
	<img alt="阿霉素释放公式；药物释放研究方程，I(t)，I(0)，I(∞)，百分比。" src="/files/ftp_upload/60907/60907eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 3"></li>
</ol>
7. 激光加热与触发释放
<ol>
	<li>将水浴温度设置为 37 °C，并等待温度稳定。</li>
	<li>向透明的 96 孔板中加入 200 µL 载有 DOX 的 LTSL10-ICG（[ICG] = 10 µg/mL），然后将其放入水浴中，保持底部浸入水中。</li>
	<li>将激光系统的电流设置为 2.27 A。将激光系统的准直器置于 96 孔板表面正上方 5 cm 处，对应的能量通量为 0.5 W/cm2 [图 6]。 
	警告：激光系统的操作应符合相关的激光安全规范。</li>
	<li>开启激光，使用光纤温度探针每分钟监测一次温度。</li>
	<li>在 5 分钟和 10 分钟时，从透明 96 孔板中取出 10 µL 经激光照射的脂质体，加入到黑色 96 孔板的三个孔中，每孔预先加入 190 µL HBS，并混匀。</li>
	<li>在黑色 96 孔板的另外三个孔中，将 10 µL 脂质体与 170 µL HBS 及 20 µL 1% (v/v) Triton X-100 溶液混合。这些孔代表“100% 释放”的 DOX 含量。测量 DOX 的荧光强度，并按照步骤 6.7 所述方法计算 DOX 的释放量。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了使用交错人字形微混合器（SHM）制备低温敏感脂质体（LTSLs）的方法。LTSL10配方可在临床可实现的42 °C热疗温度下，于5分钟内实现阿霉素的温度触发式爆发性释放。吲哚菁绿（ICG）也可共载入脂质体，用于光热加热触发DOX释放。该方法基于以下三个步骤：（i）在SHM中通过乙醇与硫酸铵溶液的快速、混沌混合，形成均一的溶剂环境，促使磷脂自组装形成脂质体11；（ii）对脂质体进行退火处理，以维持脂质双分子层的完整性，这对DOX的载药至关重要；（iii）利用硫酸铵pH梯度实现DOX的远程载药17。由于本方案所用设备均为市售现成产品，且参数已优化，因此即使无微流控经验或相关背景知识的操作人员亦可顺利实施该方法。
该方案中最关键的步骤之一是确保整个装置正确固定，并能顺利注入液体（步骤2.5）。由于脂质体自组装的可重复性依赖于均一的溶剂环境，任何不稳定性（例如注射器松动或引入气泡）都会干扰液体流动的稳定性，导致脂质体粒径和分散性不理想。这也是步骤2.8的原理所在：在达到稳定流动之前，...

LTSL 制剂是一种具有临床相关性的脂质体制剂，已开发用于递送化疗药物阿霉素（DOX），并可在临床可实现的轻度热疗条件（T ≈ 41 °C）下实现药物的快速爆发性释放1。LTSL 制剂由1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）、溶血脂质1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（MSPC；M 代表 &#34;mono&#34;）以及聚乙二醇化脂质1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（DSPE-PEG2000）组成。当达到相变温度（Tm ≈ 41 °C）时，溶血脂质与 DSPE-PEG2000 共同促进膜孔的形成，从而导致药物的快速释放2。LTSL 的制备主要采用整体自上而下的方法，即脂质膜水合与挤出法。目前仍难以稳定地制备出性质一致且足以满足临床应用需求的大批量产品3。
微流控技术是一种用于制备脂质体的新兴方法，具有可调节纳米颗粒尺寸、良好的重现性和可扩展性3。一旦优化了生产工艺参数，即可通过并行化方式提高产量，所得产物的性质与实验室规模制备的样品完全一致3,4,5。相较于传统的批量制备方法，微流控技术的主要优势在于通过微型化实现了对微小液体体积在空间和时间上的高度可控操作，从而加快工艺优化进程，并实现连续化和自动化运行6。微流控装置通过自下而上的纳米沉淀法实现脂质体制备，该方法无需均质化步骤（如挤出或超声处理），因而更加节省时间和能量7。通常，将脂质（及疏水性载药物质）的有机溶液（例如乙醇）与可混溶的非溶剂（例如水和亲水性载药物质）混合。随着有机溶剂与非溶剂混合，脂质的溶解度降低，最终达到临界浓度，从而触发沉淀过程7。脂质的纳米级沉淀物逐渐长大并闭合形成脂质体。决定脂质体尺寸和均一性的主要因素包括非溶剂与溶剂的比例（即水相与有机相的流速比，FRR）以及脂质自组装形成脂质体过程中溶剂环境的均一性8。
因此，微流控中高效的流体混合对于制备均一脂质体至关重要，已有多种混合器设计被应用于不同场景9。交错人字形微混合器（SHM）代表了一类新一代的被动式混合器，可在低稀释倍数条件下实现高通量（范围达 mL/min），性能优于传统的微流控流体动力学混合装置8,10。SHM 具有图案化的人字形沟槽，可通过混沌对流实现流体的快速混合9,11。SHM 的混合时间尺度极短（&#60; 5 ms，小于典型的 10–100 ms 聚集时间尺度），使得脂质自组装过程发生在均一的溶剂环境中，从而生成粒径分布均匀的纳米颗粒3,12。
然而，与传统的脂质体制剂相比，采用微流控技术制备LTSLs并不那么简单，原因在于其不含胆固醇8，而缺乏胆固醇会导致脂质双分子层易受乙醇诱导的分子间交错排列影响13,14,15。迄今为止，微流控法制备脂质体过程中残留乙醇的影响尚未被充分理解。已有文献报道的大多数配方本身具有抗交错排列的特性（含有胆固醇或不饱和脂质）16，而LTSLs则不同，其脂质成分为饱和且不含胆固醇。
本文所述方案采用 SHM 方法制备用于温度触发释放药物的 LTSL。在本方法中，我们通过动态光散射（DLS）确认微流控法制备的 LTSL 粒径为纳米级（100 nm），且粒径分布均匀（分散度 &#60; 0.2）。此外，我们采用跨膜硫酸铵梯度法（亦称远程载药）17 将 DOX 封装，以验证 LTSL 脂质双分子层的完整性。DOX 的远程载药需要脂质体维持 pH 梯度，才能实现高包封效率（EE），而这一过程若无完整的脂质双分子层则难以实现。本方法与典型的微流控脂质体制备方案不同，在去除乙醇之前需进行退火步骤，以实现远程载药能力，即恢复脂质双分子层的完整性。
如前所述，可在LTSLs形成过程中，将亲水性和疏水性载药分子引入初始溶液，从而实现载药分子的同步包封。为验证该概念，将美国食品药品监督管理局（FDA）批准的近红外荧光染料吲哚菁绿（ICG）——一种具有前景的光热试剂——加入初始脂质混合物中，并成功共载入LTSLs。使用808 nm激光照射负载DOX/ICG的LTSLs，可在5分钟内成功诱导光热加热触发的DOX爆发性释放。
所有仪器和材料均为市售即用型，无需定制。由于脂质体热敏脂质体（LTSL）制备的全部参数均已优化，因此即使没有微流控技术经验的研究人员，按照本方案也可制备LTSL，从而构建热敏药物递送系统的基础。

<table><tbody><tr><td>1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DPPC）</td><td>Lipoid</td><td>PC 16:0/16:0 (DPPC)</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（DSPE-PEG2000）</td><td>Lipoid</td><td>PE 18:0/18:0-PEG 2000&lt;br/&gt; （MPEG 2000-DSPE）</td><td></td></tr><tr><td>1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷胆碱（MSPC）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>855775P-500MG</td><td>由 Sigma-Aldrich 分销；也称为 Lyso 16:0 PC&lt;br/&gt; （注意：不要与也称为MSPC的14:0/18:0 PC混淆）</td></tr><tr><td>4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-100G</td><td></td></tr><tr><td>适配器，雌性鲁尔锁扣转1/4&quot;-28UNF</td><td>IDEX Health &amp;科学</td><td>P-624</td><td>需要2个单元。用于入口</td></tr><tr><td>接头，连接组件，1/4&quot;-28UNF</td><td>IDEX Health &amp;科学</td><td>P-630</td><td>需要 2 个单位。（每个单位包含 2 个螺母和 2 个卡套）</td></tr><tr><td>硫酸铵 ((NH4)2SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31119-1KG-M</td><td></td></tr><tr><td>比约小瓶</td><td>VWR</td><td>216-0980</td><td>7 mL，透明，聚苯乙烯小瓶</td></tr><tr><td>离心过滤装置</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC801008</td><td>10 kDa 截留分子量，Amicon Ultra-4 离心滤过装置</td></tr><tr><td>离心</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Heraeus Megafuge 8R</td><td>使用 HIGHConic III 固定角转子</td></tr><tr><td>比色皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>11602609</td><td>一次性聚苯乙烯比色皿，低容量，用于动态光散射测量</td></tr><tr><td>透析试剂盒 - Pur-A-Lyzer Maxi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PURX12015-1KT</td><td>12-14 kDa 分子量截留值</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34943-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>DLS 仪器</td><td>马尔文帕纳科</td><td>Zetasizer Nano ZS90</td><td></td></tr><tr><td>盐酸阿霉素（DOX）</td><td>Apollo Scientific</td><td>BID0120</td><td></td></tr><tr><td>DSC 仪器</td><td>TA Instruments</td><td>TA Q200 DSC</td><td></td></tr><tr><td>DSC Tzero 密封盖</td><td>TA Instruments</td><td>901684.901</td><td>用于DSC测量</td></tr><tr><td>DSC Tzero 坩埚</td><td>TA Instruments</td><td>901683.901</td><td>用于DSC测量</td></tr><tr><td>DSC Tzero 样品压片工具包</td><td>TA Instruments</td><td>901600.901</td><td>用于DSC测量</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td>绝对的 &amp;ge;99.8%</td></tr><tr><td>FC-808 光纤耦合激光系统</td><td>CNI Optoelectronics Tech</td><td>FC-808-8W-181315</td><td>包含 FOC-01-B 光纤准直器。</td></tr><tr><td>卡套，1/4&quot;-28UNF 至 1/16&quot; 光密度</td><td>IDEX Health &amp;科学</td><td>P-200</td><td>出口处</td></tr><tr><td>光纤温度探针</td><td>Osensa</td><td>PRB-G40</td><td></td></tr><tr><td>玻璃交错人字形微混合器（SHM）</td><td>达尔文微流控</td><td>人字形混合器 - 玻璃芯片</td><td></td></tr><tr><td>加热带</td><td>Omega</td><td>DHT052020LD</td><td>可替换为其他注射泵加热器，例如 &quot;高通量连续制备&quot; 或 &quot;SRT系列&quot; 用于较慢的加热。240V 型号需手动接线至三针插头</td></tr><tr><td>吲哚菁绿</td><td>Adooq</td><td>A10473-100</td><td>由英国Bioquote Limited公司经销</td></tr><tr><td>鲁尔锁式注射器，5 mL</td><td>VWR</td><td>613-2043</td><td>Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 三件式注射器，外径 12.45 mm</td></tr><tr><td>微孔板读板仪</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar Omega</td><td>安装有485 nm（激发）和590 nm（发射）滤光片</td></tr><tr><td>96孔微孔板，黑色，平底</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>611F96BK</td><td>用于微孔板读数仪中的荧光测定</td></tr><tr><td>96孔微孔板，透明，平底</td><td>Grenier</td><td>655101</td><td>用于吸光度测定的微孔板读数仪</td></tr><tr><td>螺母，1/4&quot;-28UNF 转 1/16&quot; 光密度</td><td>IDEX Health &amp;科学</td><td>P-245</td><td>出口处</td></tr><tr><td>Aladdin 泵网络电缆，7 英尺</td><td>World Precision Instruments</td><td>NE-PC7</td><td>可选：注射泵可手动操作</td></tr><tr><td>泵控制软件 - SyringePumpPro 软件许可（2 个）</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYRINGE-PUMP-PRO-02</td><td>可选：注射泵可手动操作</td></tr><tr><td>Aladdin 泵到泵网络电缆，7 英尺</td><td>World Precision Instruments</td><td>NE-NET7</td><td>可选：注射泵可手动操作</td></tr><tr><td>尺寸排阻色谱柱（SEC）</td><td>GE生命科学</td><td>17085101</td><td>PD-10 脱盐柱中的 Sephadex G-25 树脂</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-1KG-M</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>注射泵 &amp;amp; Cable（DUAL-PUMP-NE-1000）</td><td>World Precision Instruments</td><td>ALADDIN2-220/AL1000-220</td><td></td></tr><tr><td>恒温器温度控制器</td><td>Inkbird</td><td>ITC-308</td><td>可替换为其他注射泵加热套件/恒温器</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>管路，ETFE（1/16英寸）&quot; OD</td><td>IDEX Health &amp;科学</td><td>1516</td><td></td></tr><tr><td>USB 转 RS-232 转换器</td><td>World Precision Instruments</td><td>CBL-USB-232</td><td>可选：适用于无 RS-232 端口的计算机</td></tr><tr><td>水浴</td><td>Grant Instruments Ltd.</td><td>JB Nova 12</td><td></td></tr></tbody></table>

含溶血磷脂的温度敏感脂质体的微流控制备

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

本方案可实现低温敏感脂质体（LTSLs）的高通量连续制备，此类脂质体能够包载化疗药物（如阿霉素，DOX）。为实现该目的，将乙醇脂质混合物与硫酸铵溶液注入交错人字形微混合器（SHM）微流控装置中。SHM可使两种溶液快速混合，为脂质体的自组装提供均一的溶剂环境。收集所得脂质体后，首先进行退火处理，随后透析以去除残留乙醇。通过尺寸排阻色谱法置换外部溶液，建立硫酸铵pH梯度。随后，DOX可通过远程加载方式高效包载入脂质体中（包封效率&#62; 80%）。所获得的脂质体粒径均一，Z均粒径为100 nm。在轻度热疗（42 °C）条件下，脂质体可实现包载DOX的温度触发式爆发性释放。此外，还可将吲哚菁绿（ICG）共载入脂质体，以实现近红外激光触发的DOX释放。该微流控方法可确保LTSLs的高通量、可重复且可放大的制备过程。

通过微流控技术制备LTSLs需要使用DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000（80/10/10，摩尔比；LTSL10）的脂质组成。图7A（左）显示了步骤2.9制备的LTSL10的外观，为澄清且无黏性的液体。LTSL10配方是在传统配方LTSL4（DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000，86/10/4，摩尔比）基础上开发的，因为LTSL4会形成凝胶状的黏性样品，如样品中滞留大量气泡所示（图7A；右）。
LTSL10 的 DLS 测量结果（图 7B，红色）显示，LTSL10 的 Z-平均直径和分散度分别为 95.28 ± 7....

本方案介绍了利用交错人字形微混合器微流控装置制备热敏脂质体的优化参数。该方法还可实现阿霉素和吲哚菁绿的共包封，并通过光热触发释放阿霉素，从而实现可控/触发式药物释放。

本方案可实现低温敏感脂质体（LTSLs）的高通量连续制备，该脂质体能够包载……

微流控技术是一种新兴方法，可用于制备粒径可调、重现性高且可放大的纳米级脂质体。本方案能够连续高效地生产对低温敏感的脂质体，并实现与阿霉素等化疗药物及吲哚菁绿等荧光染料的共载。细胞制备主要采用自上而下的方法，例如脂质膜水化法和挤出法。制备用于临床应用的大规模且可重复的批次仍然具有挑战性。微流控技术的一个主要优势在于，能够在空间和时间上高度可控地处理微量液体，并以连续和自动化的方式运行。本次实验操作将由我实验室的博士后研究人员马广龙和阿玛利亚·鲁伊斯演示，与蔡 Calvin Cheung 一同完成。组装注射泵时，使用泵间网络电缆将从注射泵的“连接计算机”端口连接到主注射泵的“连接网络”端口。使用计算机至泵的网络电缆将主泵的“连接计算机”端口连接到计算机的 RS-232 串行端口。组装交错鱼骨形微混合器微流控装置时，使用螺母和卡套将管路连接至装置的各个入口和出口。然后使用第二个螺母、卡套和连接组件，将两根进样管的末端均转换为雌性鲁尔接头。设置泵控制软件时，使用注射泵上的设置按钮，将主注射泵和次级注射泵的地址分别设置为 Ad:01 和 Ad:02，然后在计算机上打开泵控制软件。两个注射泵应被自动识别，并伴随一声蜂鸣音。选择 HSW Norm-Ject 5cc，其直径等于 12.45，将直径设定为 12.45 毫米。将泵一的流速设为 0.25 毫升/分钟，泵二的流速设为 0.75 毫升/分钟。将体积设置为大于 5 毫升的任意值，并为两个泵选择输注模式。然后点击“设置”以确认参数。要配制 LTSL10 或 LTSL10 ICG 脂质混合物，使用一支 5 毫升鲁尔锁扣注射器吸取 1 毫升脂质混合物，并用另一支 5 毫升鲁尔锁扣注射器吸取至少 3 毫升硫酸铵溶液。将注射器筒体的凸缘滑入泵上的注射器固定架中，将装有液体的注射器以直立位置安装到注射泵上，并将注射器推杆的凸缘连接至泵的推块，再将加热带的另一端和带有恒温器的温度探头缠绕在装有脂质溶液的注射器周围。将加热带末端包裹在装有水溶液的注射器上，将装有脂质混合物的注射器连接至乙醇入口，将装有硫酸铵溶液的注射器连接至水相入口。必要时调整推杆位置，以排除注射器中的任何气泡，并以10秒为间隔反复插拔加热带电源，直至注射器温度达到约51摄氏度。当温控器显示温度适宜时，在泵控制软件中点击“运行全部”以启动注射泵，检查流体流动是否无气泡且无泄漏。将脂质体样品收集到小瓶中，并在任一注射器即将排空时暂停或停止输注。收集的脂质体溶液在60摄氏度水浴中退火1.5小时，随后转移至透析袋中，在37摄氏度下用1升240毫摩尔硫酸铵溶液透析至少4小时。然后将纯化的脂质体在4摄氏度下保存。为通过跨膜 pH 梯度实现脂质体的远程载药，将 25 毫升 HBS 加载至尺寸排阻色谱柱顶部，并使所有洗脱液流过色谱柱。将 1 毫升透析后的脂质体加样至该色谱柱。当所有脂质溶液均通过色谱柱后，向柱中加入 1.5 毫升新鲜 HBS。当所有缓冲液流经层析柱后，向柱中加入三毫升新鲜的 HBS 缓冲液并收集流出液。接下来，按 1:20 的 DOX:磷脂摩尔比将 DOX 溶液加入一毫升透析置换缓冲液后的脂质体溶液中，置于 Biju 小瓶内，将小瓶放入 37 摄氏度水浴中孵育 1.5 小时。载药完成后，按前述方法通过尺寸排阻色谱法纯化脂质体。为通过激光加热触发脂质体内容物的释放，将水浴温度设置为37摄氏度。待温度稳定后，向透明96孔板的每孔中加入200微升载有阿霉素（DOX）的脂质体，并将该板放入水浴中，使板底浸入水中。然后将激光系统电流设置为2.27安培，并将激光系统准直器置于96孔板表面垂直上方5厘米处。打开激光器，并使用光纤温度探头每分钟监测一次温度。在5分钟和10分钟时，从透明96孔板的每个孔中吸取10微升载药阿霉素（DOX）的脂质体，加入190微升HBS缓冲液至黑色96孔板的三个独立孔中。为评估药物的完全释放，将10微升脂质体与170微升HBS缓冲液以及20微升1% Triton X-100去垢剂溶液混合于黑色96孔板的三个独立孔中。然后使用酶标仪测定阿霉素（DOX）的荧光强度。LTSL4 的微流控制备产生一种凝胶状的黏稠溶液，表现为含有大量滞留的气泡，而 LTSL10 的制备则形成一种澄清且无黏性的液体。在 51 摄氏度下制备的 LTSL10 的动态光散射测量结果显示，其 Z 平均直径和分散度符合预期，表明实验成功。然而，当在 20 摄氏度下制备 LTSL10 时，所得脂质体粒径较大且分布更分散，导致产品次优。通过传统的脂质膜水化结合挤出法制备的 LTSL，其阿霉素（DOX）包封效率为 50–80%。经过退火处理后，采用微流控技术制备的 LTSL10 的 DOX 包封效率显著提高，平均达到 85%，表明 DOX 的远程载药成功，并形成了跨膜 pH 梯度。LTSL10 的 DOX 释放曲线已被证实具有温度敏感性。LTSL10具有相对较宽的相变过程，起始温度为41.6摄氏度，峰值出现在42.6摄氏度。ICG的装载效率取决于初始ICG浓度以及样品的粒径和分散性。此外，使用近红外激光照射LTSL10中的ICG可产生光热效应，从而触发DOX的释放。进行该操作时，必须确保流体流动稳定，从而使流体混合及脂质体的形成具有可重复性。脂质体退火和透析是确保获得高载药量稳定脂质体制剂的两个关键步骤。此外，还可通过体内实验评估LTSL10的生物分布、药物释放及抗肿瘤活性。本方案可用于成功制备不含胆固醇但含有溶血磷脂的热敏脂质体，适用于药物递送应用。

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科研

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Bioengineering

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