含脂脂的微流体生产-温度敏感脂质体

微流体是制备可调谐纳米粒子大小的脂质体，具有极大的可重复性和可伸缩性的新技术。该协议通过生产低温敏感脂质体，与多索鲁比辛等化疗药物和荧光染料（如丁二醇绿色）共同加载，实现连续高含量。细胞制备主要使用自上而下的方法，如脂质膜水化和挤出。

为临床应用准备大量可重复的批次仍然具有挑战性。微流体的一个主要优点是能够处理小液体体积，在空间和时间上具有高可控性，同时以连续和自动化的方式运行。与张光龙一起演示手术的将是马广龙和阿玛利亚·鲁伊斯，我实验室的博士后研究人员。

要组装注射器泵，请使用泵到泵网络电缆将辅助注射器泵的计算机端口连接到主注射器泵的网络端口。使用 PC 泵送网络电缆将主泵的计算机端口连接到计算机的 RS-232 串行端口。要组装雄鹿鱼骨微流体装置，请使用螺母和铁杉将管子连接到设备的每个入口和插座。

然后使用第二个螺母和铁杉和联合体将两个入口的管端子转换为母耳。要设置泵控制软件，请使用注射器泵的设置按钮将主注射器泵和辅助注射器泵的地址分别分配给 Ad:01 和 Ad:02，然后在计算机上打开泵控制软件。应自动检测两个注射器泵，然后发出蜂鸣声。

选择 HSW Norm-Ject 5cc 直径等于 12.45，将直径分配给 12.45 毫米。将泵 1 的速率设置为每分钟 0.25 毫升，泵 2 的速率设置为每分钟 0.75 毫升。将音量设置为超过五毫升的任何值，并选择两个泵的输液模式。

然后单击"设置"以确认设置。要准备 LTSL10 或 LTSL10 ICG 脂质混合物，请使用一个五毫升的 luer 锁注射器提取一毫升脂质混合物和另一个五毫升的 luer 锁注射器，以提取至少三毫升硫酸铵溶液。将注射器的筒法兰滑到泵的注射器固定器上，将加载的注射器安装到注射器泵上，将注射器的柱塞法兰连接到泵的推杆块上，将加热胶带的另一端和温度探头与带恒温器的注射器周围，并附着含有脂质溶液的注射器周围的温度探头。

将加热胶带的端端包裹到含有水溶液的注射器上，将含有脂质混合物的注射器连接到乙醇入口，然后将含有硫酸铵溶液的注射器连接到水性入口。根据需要调整柱塞位置，以清除注射器中的任何气泡，并每隔 10 秒插入并拔下加热胶带，直到注射器的温度达到约 51 度。当恒温器显示适当的温度时，单击泵控制软件中运行所有泵以运行注射器泵，并检查液流量是否无气泡和任何泄漏。

将脂蛋白酶样本收集到小瓶中，当任何一个注射器几乎是空的时，暂停或停止输液。将收集的脂体溶液在60摄氏度的水浴中冲洗1-1~2小时，然后将溶液转移到透析管中透析，对一升240毫摩尔硫酸铵进行透析，在37摄氏度下至少4小时。然后将纯化的脂质体储存在摄氏四度。

对于通过跨膜 pH 梯度对脂质体进行远程加载，将 25 毫升 HBS 加载到大小排除色谱柱的顶部，并允许所有 Eluent 流经柱。将一毫升透析脂质体加载到柱上。当所有脂质溶液都通过该列时，向列中加入 1.5 毫升的新鲜 HBS。

当所有缓冲区都通过柱时，向列中添加三毫升新鲜 HBS 并收集吸水器。接下来，在Biju小瓶中，以1:20 DOX:磷脂摩尔比添加 DOX 溶液，将缓冲液交换脂质体溶液加入一毫升，并将小瓶放在37摄氏度的水浴中1-1~2小时。装料后，通过大小排除色谱净化脂质体，正如刚才所证明的。

对于激光加热诱导的电触发释放脂体内容物，将水浴设置为37摄氏度。当温度稳定下来后，在透明96井板的每个井中加入200微升的DEX装脂体，并将板放在水浴中，底部浸入水中。然后将激光系统电流设置为 2.27 安培，将激光系统准直器垂直放置在 96 井板表面上方 5 厘米。

打开激光器并使用光纤温度探头每分钟监控一次温度。在5分钟和10分钟时，从透明96孔板的每个孔中吸入10微升的DEX，并将190微升的HBS加入到黑色96孔板的三个单独孔中。为了评估完整的药物释放，将10微升脂体与170微升的HBS和20微升的1%Triton X-100洗涤剂溶液混合在黑色96孔板的三个单独井中。

然后测量板读卡器上的 DOX 荧光强度。LTSL4 的微流体生产可产生凝胶状粘性溶液，如大量受困气泡所示，而 LTSL10 的制备则导致形成透明的非粘性液体。在51摄氏度下准备的LTSL10动态光散射测量表明，预计的Z平均直径和分散度表明实验成功。

然而，当 LTSL10 在 20 摄氏度下准备时，获得更大、更分散的脂质体，从而产生次优产品。由传统的带挤出的脂质薄膜水化方法编写的LTSL表明，在退火时，由微流体准备的LTSL10具有50-80%的 DOX 封装效率，使 DOX 封装效率显著提高，平均达到 85%，表明 DOX 的远程加载成功，并且存在跨膜 pH 梯度。LTSL10 的 DOX 释放配置文件已确定为温度敏感。

LTSL10 的相变相对较宽，发病温度为 41.6 摄氏度，峰值为 42.6 摄氏度。ICG 装载的效率取决于初始 ICG 浓度以及样品的大小和分散性。此外，LTSL10 ICG辐照与近红外激光诱导光热加热触发DEX的释放。

在尝试此程序时，必须确保稳定的流体流动，使流体的混合以及脂质体的形成保持可重复性。脂体退火和透析是确保稳定的脂体配方和高载荷能力的两个重要步骤。还可以进行体内测试，以评估 LTSL10 生物分布、药物释放和抗癌活性。

我们的协议可用于成功微流体生产无胆固醇含糖脂含热脂质体，用于药物输送应用。