Name: 生理条件下猪心的切片和培育 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 学习在生理条件下切片和培养猪心组织的方法，用于心力衰竭治疗药物疗效评估和急性心脏毒性检测。该培养系统可建立可靠的临床前预测模型，提高药物测试准确性。

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TMAM 受美国国立卫生研究院（NIH）资助 P30GM127607 和美国心脏协会资助 16SDG29950012 支持。RB 受 P01HL78825 和 UM1HL113530 资助支持。

所有动物实验均遵循路易斯维尔大学的机构指南，并经机构动物护理和使用委员会批准。
1. 切片前准备（切片前一日）
<ol>
	<li>振动切片机的准备
	<ol>
		<li>将陶瓷刀片放入刀架中，步骤如下：小心拆开刀片包装后，先将刀刃部分插入刀具槽内。然后，松开刀架臂上的两个螺丝，将刀片滑入每个垫圈下方，并用力向后推至后部限位挡块处。拧紧螺丝以固定刀片。 
		注意： 螺钉不应过度拧紧。</li>
		<li>根据制造商的方案，使用校准协议和工具对刀片进行校准。 
		注意： 简而言之，为了便于刀片与运动轴对齐并最大限度减少Z轴偏转，振动切片机采用了一个可拆卸的校准装置。当校准装置插入仪器时，其存在将被自动检测，振动切片机会自动控制并调节刀片的振幅和频率至最适合调整刀片对准误差的数值。
		<ol>
			<li>按压 切片 点击按钮启动对准程序，系统将自动移动刀片，使其刃口相对于校准装置处于最佳位置，以实现最精确的对准评估。根据屏幕上的提示，使用提供的螺丝刀调节刀片，确保Z轴对准精度在1 µm以内。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>高压灭菌振动切片机的内槽及所有金属部件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将大型金属托盘（用于收集切片和浸泡电刺激板盖）、所有玻璃容器、普通矩形刀片、镊子、剪刀、打印机同步带（将其切割成6 mm宽的条状）、金属垫圈以及5 L双蒸水（ddH₂O）进行高压灭菌2O</li>
	<li>对一个1 L广口瓶、一个500 mL广口瓶以及一个用于心脏原位和离体灌注的塑料托盘进行灭菌处理，灌注液为心脏停跳液。</li>
	<li>在2 L烧杯中配制2 L切片用Tyrode's溶液。
	<ol>
		<li>配制1 L切片用Tyrode's溶液：加入3 g/L 2,3-丁二酮单肟（BDM）、140 mM NaCl（8.18 g）、6 mM KCl（0.447 g）、10 mM D-葡萄糖（1.86 g）、10 mM HEPES（2.38 g）、1 mM MgCl₂（0.203 g）、1.25 mM NaH₂PO₄（0.15 g）和2.5 mM CaCl₂（0.275 g）。2 (1 mL 的 1 M 溶液)，1.8 mM CaCl₂2 （1.8 mL 1 M 溶液），加 ddH₂O 定容至 1 L2O. 使用 NaOH 将 pH 调至 7.40。然后使用 1,000 mL、0.22 µm 真空过滤/储存系统过滤溶液，并于 4 °C 下过夜保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备4升心脏停跳液。
	<ol>
		<li>配制1 L停搏液，需混合110 mM NaCl（6.43 g）、1.2 mM CaCl₂2 （1.2 mL 1 M 溶液），16 mM KCl（1.19 g），16 mM MgCl₂2 (3.25 g)，10 mM NaHCO₃3 (0.84 g)，1 U/mL 肝素，加 ddH₂O 至 1 L2O. 使用 NaOH 将 pH 调至 7.40。然后使用 1,000 mL、0.22 µm 真空过滤/储存系统过滤溶液，并于 4 °C 下静置过夜。 
		注意： 在切片当天的心肌停搏液中加入1,000 U/L肝素（见步骤2.1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在生物安全柜中，于原瓶内新鲜配制500 mL培养基：混合M199培养基、1×胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）添加剂、10%胎牛血清（FBS）、5 ng/mL血管内皮生长因子（VEGF）、10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（FGF-basic）和2×抗生素-抗真菌剂。通过0.22 µm真空过滤/储存系统过滤除菌，4 °C过夜保存。 
	注意： 不要调节pH值，使用前新鲜加入VEGF和FGF。</li>
	<li>制备4%琼脂凝胶平板。
	<ol>
		<li>加入 200 mL 灭菌的 ddH₂O2在500 mL灭菌烧瓶中加入O。称取8 g琼脂糖，轻轻倒入烧瓶中。在微波炉中煮沸2分钟，然后在室温下冷却5分钟。</li>
		<li>在生物安全柜中，将25 mL培养基倒入每个100 mm培养皿中（共准备6个），静置1小时使其凝固。随后用石蜡膜密封培养皿，再用洁净保鲜膜包裹，于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将200-proof的无水乙醇用高压灭菌的ddH₂O稀释，配制4 L的70%乙醇2O.</li>
	<li>制备含双倍浓度抗生素-抗真菌剂的无菌 ddH₂O 溶液2O：混合980 mL无菌ddH₂O2在生物安全柜中，用20 mL抗生素-抗真菌剂处理。</li>
</ol>
2. 猪心脏灌注
<ol>
	<li>向每1升停跳液中加入1 mL浓度为1,000 U/mL的肝素。将溶液置于冰上保存。 
	注意： 转移至组织培养室期间，心脏灌注和保存至少需要3 L溶液。</li>
	<li>将以下物品带至猪手术室：一个装满冰的大号冰桶、一个已灭菌的金属托盘（用于心脏灌流，放置于冰桶上）、一个已灭菌的500 mL广口瓶、一个1 L广口瓶（用于将含有停跳液的心脏转移回组织培养室，置于冰上），以及一个装满冰的已灭菌塑料托盘（用于将停跳液保持在冰上）。</li>
	<li>准备一个原位心脏灌注系统，该系统包含三通旋塞、60 mL注射器、18 G蝶形针导管以及通向心脏停搏液储液器的延长管。</li>
	<li>首先通过肌肉注射氯胺酮（20 mg/kg）和赛拉嗪（2 mg/kg）混合物对约克夏雄性猪（2−3月龄，20−25 kg）进行麻醉。通过下颌张力消失确认麻醉效果。随后将猪转移至手术室，进行气管插管并按照先前所述方法实施机械通气14.</li>
	<li>使用（1.5−2%）异氟烷维持麻醉。</li>
	<li>将动物置于右侧卧位，剃除胸部区域的毛发。用酒精擦拭皮肤，然后用10% (w/v) 聚维酮碘溶液对手术部位进行消毒。</li>
	<li>通过左侧开胸切口，使用手术刀在第4肋间打开胸腔th 肋间隙，并使用胸腔牵开器置于肋骨之间以撑开胸腔，暴露心脏。 
	注意： 本操作请使用所有已灭菌的器械。</li>
	<li>将蝶形针导管插入左心房，并用荷包缝合法固定针头。静脉注射肝素（100 U/kg）推注剂量后，通过左心房导管原位灌注500 mL冰冷的心脏停跳液（以减慢心率）。</li>
	<li>用5%异氟烷深度麻醉猪。使用手术剪迅速将心脏从胸腔中取出。用主动脉插管插入主动脉，并以另一升冰冻心脏停跳液（100 mL/min）进行体外灌注，以冲洗血管内的血液。</li>
	<li>心脏灌注后，将心脏置于盛有冰冷心脏停跳液的1 L广口瓶中，并在转移至组织培养室期间保持冰上保存。</li>
</ol>
3. 猪心脏组织切片
<ol>
	<li>在振动切片机上设置组织浴槽，在组织浴槽的冷却夹层中加入冰块，然后向组织浴槽中加入台氏液。准备一个1 L的塑料瓶，用于收集组织浴槽冷却夹层融化的冰水。</li>
	<li>在生物安全柜内，将猪心脏转移至含有1 L新鲜冷停跳液的托盘中。</li>
	<li>使用可伸缩的无菌手术刀解剖心脏，分离左心室。然后使用矩形剃须刀片将左心室切成每块1−2 cm3的组织块。取其中一块用于切片，其余组织块如需后续使用，应保存在装有冷台氏液的50 mL离心管中，并置于冰上。 
	注意：切片前用手轻轻按摩组织，尤其是当使用的是第二块组织时。按摩有助于恢复正确的肌纤维排列，防止心肌组织块僵硬。</li>
	<li>在金属样品托上滴加1−2滴组织胶（材料表），并将一块4%琼脂（表面积约为1 cm2）粘附在托上。</li>
	<li>在琼脂表面再滴加1−2滴组织胶。</li>
	<li>将心肌组织块粘附在琼脂上，使心外膜朝下接触组织胶，并确保其尽可能平整。然后将带有心肌组织块的样品托转移至振动切片机切片浴槽中的指定位置。</li>
	<li>将氧气管连接至切片浴槽，以及用于收集切片的盛有台氏液的金属托盘（充氧台氏液浴）。然后在金属托盘中放入40 µm细胞筛网，以便切割后收集切片。</li>
	<li>调整切片位置
	<ol>
		<li>使用振动切片机的操作软件和控制面板，调节刀片/样品的高度。选择高度按钮，并根据屏幕提示调整高度。理想情况下，刀片应接近组织顶部，但位于乳头肌下方，并确保在切片前液体已覆盖组织和刀片。</li>
		<li>通过选择进样按钮来设定切片起始位置。按下切片按钮，并旋转旋钮加快速度，使刀片向组织边缘移动。然后再次按下切片按钮停止，再按下进样按钮以终止该过程。</li>
		<li>调整切割参数：进样速度 = 0.03 mm/s，振动频率 = 80 Hz，水平振动幅度 = 2 mm。然后选择切片按钮开始切片。</li>
		<li>让振动切片机持续切片，直至接近组织末端，但在刀片接触标本托后端之前停止。此时再次按下切片按钮停止切片，按下返回按钮使刀片回到起始位置。</li>
		<li>选择自动重复（点击两次），可使振动切片机自动重复切片过程最多99次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集切片
	<ol>
		<li>等待切片达到完整长度且形态良好（已通过乳头肌层后），即可开始收集切片。</li>
		<li>使用装有冷台氏液的塑料巴斯德吸管轻轻从浴槽中拾取切片。如有必要，可使用镊子和弹簧剪将切片与心肌组织块分离，以防组织仍附着。</li>
		<li>将切片转移至充氧台氏液浴中的一个细胞筛网上（见步骤3.7），并用塑料巴斯德吸管中的液体使组织平铺于筛网上，然后在上方放置一个金属垫圈以固定组织。 
		注意：切片需在台氏液中孵育至少1小时后方可进行后续处理（此步骤旨在使BDM充分松弛组织）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 心脏切片的培养
<ol>
	<li>准备切片用于培养
	<ol>
		<li>修剪切片边缘，避免出现不平整的边缘。然后使用组织胶将切片两端粘附到已灭菌的宽6 mm聚氨酯打印机同步带（内嵌金属丝）上。</li>
		<li>将带有支撑的心脏切片转移至6孔板中，每孔加入6 mL培养基。</li>
		<li>将刺激板盖（材料表）放置在6孔板上方，并将盖子连接至细胞培养电刺激仪（材料表）。调节刺激仪，持续以10 V、1.2 Hz对心脏切片进行电刺激。 
		注意：接通刺激后，心脏切片将开始跳动，此运动在视觉上明显可见。</li>
		<li>将培养板转移至培养箱中，在37 °C、加湿空气及5% CO2条件下维持培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每天更换培养基3次，每次更换时每孔添加6 mL新鲜培养基。 
	注意：每次更换培养基前需对培养基进行5分钟的氧合处理。每天至少更换一次培养基；必要时周末也可操作。每日仅更换一次培养基的情况最多连续进行两天，此为已验证的极限条件。</li>
	<li>每天更换一次刺激板盖，以防止有毒石墨颗粒释放到培养基中（通常在中午换液时进行）。
	<ol>
		<li>从培养皿上取下刺激板盖，并在盖子与细胞培养电刺激仪电缆连接处插入白色泡沫塞，以防止电路受潮损坏。</li>
		<li>将板盖放入含有2倍抗生素-抗真菌剂的灭菌水浴中，过夜浸泡（即冲洗浴）。</li>
		<li>次日，将板盖转移至70%乙醇浴中浸泡5−15分钟以去污染。在更换溶液前，轻轻甩去设备表面多余液体。</li>
		<li>随后，将板盖转移至第三步也是最后一步的冲洗浴（即清洁浴），其中含有灭菌水和2倍抗菌-抗真菌剂，以彻底冲洗残留的乙醇。</li>
		<li>在清洁浴中冲洗完毕后，使用洁净无绒布（预先喷有乙醇）擦干塑料部件上的残留水分，然后取下白色泡沫块，并小心地将板盖重新放回培养板上。 
		注意：切勿触碰插入孔内的黑色石墨电极，否则会导致设备失去无菌状态。</li>
		<li>使用无菌镊子确保组织位于孔中央，避免板盖接触组织。确认板盖的弧形侧与培养板的斜角侧对齐，且方形角位置匹配。 
		注意：为尽量减少刺激板盖的污染，实验结束后应将其存放于洁净且空置的6孔板中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据Ou等人的方法13，在新鲜猪心脏切片（第0天）以及培养6天后，进行MTT检测、钙离子测量和收缩功能评估。</li>
</ol>

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</ol>

TMAM 持有 Tenaya Therapeutics 的股权。其他作者报告无利益冲突。

本文详细描述了我们近期发表的一种简化中等通量（每个装置可处理多达48个切片）视频实验方案，该方法能够将猪心脏切片在体外长期培养，足以用于急性心脏毒性测试13。所提出的培养条件模拟了心脏所处的生理环境，包括电刺激频率、营养物质供应以及间歇性供氧。我们认为，这种仿生刺激培养体系能够延长心脏切片的存活时间，关键在于尽可能重现完整心脏所处的生理环境。这一观点得到了我们的数据支持：单独进行电刺激而未提供必要营养成分时，不足以维持心脏切片的存活能力13。因此，培养基中新增的组分是延长心脏切片在体外存活和功能维持的主要因素。我们发现，在培养基中添加胎牛血清（FBS）对维持切片存活至关重要，这可能是由于心脏组织在体内通常依赖血清提供多种脂肪酸、微量元素、酶、蛋白质、大分子、化学成分以及激素17。此外，我们发现向培养基中添加成纤维细胞生长因子（FGF）和血管内皮生长因子（VEGF）有助于增强组织的存活能力。FGF和VEGF是已知的促血管生成因子，对维持体外培养的内皮细胞至关重要...

药物诱导的心脏毒性是导致药品退市的主要原因之一1在21世纪的最后一个十年th 世纪以来，有八种非心血管药物因导致心室心律失常引发的猝死而被撤出市场2此外，多种抗癌疗法（尽管在许多情况下有效）可能导致一系列心脏毒性效应，包括心肌病和心律失常。例如，传统的（如蒽环类药物和放射治疗）和靶向的（如曲妥珠单抗）乳腺癌治疗均可能在部分患者中引发心血管并发症。3心脏病学家与肿瘤学家之间的密切合作（通过新兴的 cardio-oncology 领域） &#34;心脏肿瘤学&#34;) 有助于使这些并发症得到控制，确保患者能够得到有效治疗2较不明确的是新型药物（包括Her2抑制剂和PI3K抑制剂）的心血管效应，尤其是这些疗法联合使用时的情况。因此，在开展人体临床试验之前，迫切需要建立可靠的临床前筛查策略，以评估新兴抗癌疗法相关的心血管毒性。目前，可用于药物毒性检测的功能性和结构性均保持稳定超过24小时的人类心肌组织培养系统尚不可及，这限制了心脏毒性检测的可靠性。因此，亟需建立一种能够在生理条件下可靠培养人类心肌组织的系统，用于药物毒性测试。
近年来，在心脏毒性测试中使用人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）在一定程度上缓解了这一问题；然而，hiPSC-CMs 的不成熟特性以及与心脏组织的多细胞结构相比所缺失的组织完整性，是该技术的主要局限性4。最近一项研究通过在水凝胶上由 hiPSC-CMs 构建心脏组织，并随时间逐步增加电刺激，部分克服了这一局限5。然而，其电机械特性仍未达到成人人心肌组织的成熟水平。此外，心脏组织在结构上更为复杂，由多种细胞类型组成，包括内皮细胞、神经元以及多种类型的基质成纤维细胞，并通过特定组合的细胞外基质蛋白相互连接6。成年哺乳动物心脏中非心肌细胞群体的这种异质性7,8,9，是利用单一细胞类型模拟心脏组织的一大障碍。这些主要局限性凸显了开发能够培养完整心脏组织的方法的重要性，以实现对心脏生理和病理条件的最优研究5。
培养人的心脏切片是研究完整人心肌的一种有前景的模型。该技术提供了一个完整的三维多细胞系统，类似于人心肌组织，能够可靠地反映人心肌的生理或病理状态。然而，由于心脏切片在体外培养中的存活时间极短，其应用受到了严重限制；根据截至2018年报道的最优化方案，存活时间也不超过24小时10,11,12。这一限制主要由多种因素导致，包括采用气液界面法培养切片，以及使用无法满足心肌组织高能量需求的简单培养基。我们近期开发了一种浸没式培养系统，可提供持续的电刺激，并优化了培养基成分，使心肌组织切片的存活时间延长至6天13。该培养系统有望成为一种强大的、用于急性心脏毒性测试的预测性人源原位模型，从而弥合临床前与临床试验结果之间的差距。在本文中，我们将详细描述以猪心为例的心脏切片制备与培养方案。该方案同样适用于人、狗、羊或猫的心脏。通过本方案，我们希望将该技术推广至科学界其他实验室。

<table><tbody><tr><td>1,000 mL，0.22 &amp;micro;m，真空过滤/储存系统</td><td>VWR</td><td>28199-812</td><td></td></tr><tr><td>2,3-丁二酮单肟（BDM）</td><td>Fisher</td><td>AC150375000</td><td></td></tr><tr><td>500 mL，0.22 &amp;micro;m，真空过滤/储存系统</td><td>VWR</td><td>28199-788</td><td></td></tr><tr><td>6孔C型培养皿盖（电刺激板盖）</td><td>Ion Optix</td><td>CLD6WFC</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Fisher</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Bioline USA</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Thermo</td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>C-Pace EM（细胞培养电刺激仪）</td><td>Ion Optix</td><td>CEP100</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机用陶瓷刀片</td><td>Campden Instruments</td><td>7550-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Cooley 胸部牵开器</td><td>Millennium Surgical</td><td>63-G5623</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀 #20</td><td>Biologyproducts.com</td><td>DS20X</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 细胞筛，无菌，Corning</td><td>VWR</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo</td><td>A3160502</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 镊子</td><td>Fisher</td><td>NC9475675</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl BLUE 组织胶</td><td>Amazon</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/&quot; target=&quot;_blank">https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>虹膜弹簧剪</td><td>Fisher</td><td>NC9019530</td><td></td></tr><tr><td>虹膜直剪</td><td>Fisher</td><td>731210</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷，USP</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>ITS 液体培养基添加剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146-5ML</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮（500 mg/10 mL）</td><td>West-Ward</td><td>NDC 0143-9508</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Mayo SuperCut 外科剪刀</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>AROSuperCut&amp;trade; 07.164.17</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199，Earle's 盐</td><td>Thermo</td><td>11-150-059</td><td></td></tr><tr><td>氧气调节器</td><td>Praxair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氧气瓶 -</td><td>Praxair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料巴斯德吸管</td><td>Fisher</td><td>13-711-48</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Fisher</td><td>AC193780010</td><td></td></tr><tr><td>打印机同步带</td><td>Amazon</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/&quot; target=&quot;_blank">https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>矩形剃须刀片</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>重组人血管内皮生长因子</td><td>R&amp;D Systems</td><td>293-VE-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>可伸缩手术刀</td><td>Fisher</td><td>22-079-716</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Fisher</td><td>AC217125000</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Fisher</td><td>AC327300010</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Campden Instruments</td><td>7000 SMZ-2</td><td></td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪（100 mg/mL）</td><td>Heartland Veterinary Supply</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

在生理条件下切片与培养猪心脏

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

许多新药由于心脏毒性副作用而在临床研究中失败，因为目前可用的体外检测方法和体内动物模型难以准确预测人类心脏相关风险，给制药行业带来了数十亿美元的负担。因此，在开展耗资巨大且耗时漫长的首次人体试验之前，全球迫切需要更有效的方法来识别药物的心脏毒性。目前，仅使用不成熟的心脏细胞（人诱导多能干细胞来源的心肌细胞 [hiPSC-CMs]）来测试药物疗效和毒性，因为它们是唯一可长期培养以满足药物疗效和毒性测试需求的人类心脏细胞。然而，单一细胞类型无法模拟由多种细胞类型构成的复杂三维心脏组织的表型。尤为重要的是，药物效应需要在成人心肌细胞上进行测试，因为其特性及对毒性的反应与不成熟的 hiPSC-CMs 存在差异。培养人类心脏切片是一种有前景的完整人心肌模型。该技术提供了一个完整的多细胞系统，能够模拟人类心脏组织，并反映人心肌的生理或病理状态。近期，通过优化培养基成分以及培养条件，包括施加1.2 Hz的持续电刺激和对培养基进行间歇性供氧，我们开发出一种新的培养体系，可在体外维持人和猪心脏切片的活力与功能达6天之久。在本实验方案中，我们以猪心脏为例详细描述其切片与培养方法。该方案同样适用于人、狗、羊或猫心脏组织切片的培养。该培养体系有望成为一种强有力的、用于急性心脏毒性测试的预测性人源原位模型，从而弥合临床前与临床试验结果之间的差距。

使用一种可同时容纳八个6孔板的商用细胞培养电刺激仪，我们通过施加生理频率（1.2 Hz）的电刺激来模拟成年心脏的微环境，并筛选出可延长猪心脏切片在体外培养中功能维持时间的基本培养基成分13。由于猪心脏与人类心脏在大小和解剖结构上相似15，我们首先利用猪心脏开发了一种仿生心脏切片培养系统，随后在人源心脏切片中进行了验证。本文详细描述了猪心脏切片的实验方案，该方案与人源心脏切片的制备和培养流程完全相同。本研究所描述的新型仿生培养体系可通过MTT法评估证实，能够将猪心脏切片的存活状态维持达6天之久（图1A）。我们通过检测钙稳态和收缩力进一步确认了这些切片在6天内的功能性活力。在培养的前6天内，心肌细胞无自发性钙瞬变，且对体外电刺激以及β-肾上腺素能刺激的反应与新鲜心脏切片相似（图1B）。此外，培养的...

本方案描述了在生理条件下对心脏组织进行切片并培养6天的方法。该培养系统可作为测试新型心力衰竭治疗药物有效性的平台，也可用于在三维心脏模型中可靠地检测急性心脏毒性。

许多新型药物由于心脏毒性副作用而在临床研究中失败，因为目前可用的体外检测方法和体内动物模型 poorly...

本方案旨在生理条件下对心脏组织切片进行六天的切片与培养，可用于急性心脏毒性测试以及心力衰竭疗法有效性的评估。该培养系统有望成为一种强大的预测性人源原位模型，用于急性心脏毒性测试，从而弥合临床前与临床测试结果之间的差距。本实验操作将由本实验室的实验室主管 Qinghui Qu 演示。为获取猪心脏组织切片，首先在振动切片机的组织浴冷却套中加入冰块，并向浴槽中加入台氏液。使用一个1升的塑料瓶收集组织浴冷却套融化的冰水，并将猪心脏转移至生物安全柜中盛有1升新鲜冷心脏停跳液的托盘内。使用可伸缩的无菌手术刀解剖心脏以分离左心室，并使用矩形剃须刀片将左心室切成1至2立方厘米大小的组织块。将一块组织留出用于切片，其余组织块放入盛有冰冷台氏液的50毫升离心管中，并置于冰上。轻轻按摩保留的组织块，向振动切片机的金属样品托上滴加一至两滴组织胶。取一块表面积约为1平方厘米的4%琼脂块粘附于胶上，再向琼脂块滴加一至两滴组织胶。将心脏组织块的心外膜面向下紧贴琼脂，并尽可能使组织平整地固定在持样器上，然后将带有心脏组织块的持样器放入振动切片机的切片浴中。关键是要将心脏组织块的心外膜面朝下粘附在琼脂上的组织胶中，并确保组织尽可能平整。随后，将供氧管连接至切片浴以及盛有Tyrode溶液的金属托盘，并在金属托盘上放置孔径为40微米的细胞筛，以收集切下的心脏组织切片。使用振动切片机操作软件调节刀片和样品的高度，使刀片接近组织顶部，但位于乳头肌下方，且液体覆盖组织和刀片。选择“前进”以调整开始切片的位置。按“切片”以提高速度，并使用旋钮将刀片移向组织边缘。再次按下切片按钮以停止并推进至失活该过程。然后根据指示调整切割参数，再按下切片按钮以开始切片组织。当刀片到达组织末端但尚未触及样本架末端时，再次按下切片按钮以停止，并按下返回按钮回到起始位置。当切片达到全长且质量良好时，使用装有冷Tyrode溶液的塑料巴斯德吸管，配合镊子和弹簧剪刀，必要时将切片从心脏上轻轻分离，并用吸管小心收集组织。将每一片收集到的切片放入盛有充氧Tyrode溶液的细胞筛中，用吸管中的溶液将组织轻压至细胞筛表面。然后将一个金属垫圈置于组织上方，以固定组织位置。在含氧的台氏液中孵育至少一小时后，修剪每片组织的外缘以去除不平整的边缘，并将每片组织的一端粘附到一片宽六毫米、已灭菌且内嵌金属丝的聚氨酯打印机同步带上。将带有支撑的心脏组织片放入六孔板中，每孔加入六毫升培养基，并使用无菌镊子确保组织位于孔的中央。注意避免板盖接触组织，并将板盖放置在培养板上，使板盖的弧形侧与板的斜角侧对齐，方形角相互对应。将切片放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。每天三次用六毫升新鲜的含氧培养基更换培养上清液。将盖子连接至细胞培养电刺激器，并调节刺激器以持续向心肌切片施加10伏特电压和1.2赫兹频率的电流。连接刺激装置后，心脏切片将开始跳动。每天中午更换培养基时，需将培养皿上的刺激板盖取出，以防止有毒的石墨颗粒释放到培养基中。在已使用的盖子与细胞电刺激仪电缆连接处插入白色泡沫塞，以防止电路受潮损坏，并将刺激板盖放入含有2倍抗生素/抗真菌剂的灭菌水中浸泡。第二天，将培养皿盖放入70%乙醇中消毒5至15分钟，随后将皿盖转移至新鲜的已添加2X抗生素/抗真菌剂的灭菌水浴中浸泡3分钟。冲洗培养皿盖后，使用喷有乙醇的洁净无绒擦拭布擦去塑料部分残留的水分，并移除白色泡沫塞。此时皿盖即可重新放回培养皿中。通过本研究所展示的新型仿生培养体系，猪心脏切片的活性在MTT法评估下可维持六天。在前六天内，与新鲜心脏切片观察到的反应相似，猪心脏切片的心肌细胞中未出现自发性钙瞬变。心肌细胞对外部电刺激和β-肾上腺素能刺激均有响应。此外，心脏切片在培养中维持了长达六天的收缩力以及对异丙肾上腺素的反应，与新鲜心脏切片中观察到的结果相似。可在心脏切片上进行多种结构和功能评估，包括 MTT 活力检测、免疫染色、电子显微镜检查、钙瞬变测量、收缩功能评估、代谢评估以及分析。目前，我们正在利用该培养系统在猪和人源心脏切片中测试感兴趣药物及基因治疗的急性心脏毒性和疗效。

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生理条件下猪心的切片和培育

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关键词：猪心脏，心脏摘除，心脏移植，器官获取，实验外科，移植医学

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利用人源类器官心脏切片的双电压与钙光学标测进行临床前心脏电生理学评估

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成年小鼠心脏中同时分离与培养心房心肌细胞、心室心肌细胞及非心肌细胞

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用于评估缺血性心脏病基因治疗疗效的大动物模型

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在生理条件下切片与培养猪心脏

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