Name: 翻译核糖体亲和纯化（TRAP）以研究细胞类型特异性尺度下阿拉伯生物基塔利亚纳根发育 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学习翻译核糖体亲和纯化技术，用于研究拟南芥根发育过程中的细胞类型特异性基因表达。该方法结合超低量RNA文库制备，为植物发育生物学研究提供高质量数据。

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我们感谢苏黎世遗传多样性中心的 Jean-Claude Walser 在本项目初期阶段提供的关键性专业建议。Vermeer 实验室的工作得到了瑞士国家科学基金会（SNSF）授予 JEMV 的 SNF 教授职位资助（PP00P3_157524）和 R'EQUIP 设备资助（316030_164086）的支持。

作者无任何利益冲突需要披露。

验证 RPL18 的定位模式 
避免对任何 TRAP 实验数据产生误读的关键在于标记核糖体亚基的正确表达模式。因此，将 GFP 作为表位标签融合到 RPL18 上，可优雅地实现对目标表达模式的验证，并随后从同种组织中沉淀多聚核糖体组分。为确保启动子驱动模式正确，Jiao 和 Mayerowitz 于 2010 年采用过更为侵入性的方法，该方法需要进行 GUS 染色；Tian 等人于 2019 年的方法则依赖于使用抗 FLAG 抗体的免疫染色58,59。
我们强烈建议在每一代中都检测定位模式，因为T-DNA转基因株系容易发生沉默，从而导致信号强度减弱或表达种子的比例下降。由于构建体中包含了GFP标签，这些常规检测可通过显微镜轻松完成。
然而，即使进行详尽的共聚焦分析，在某些情况下也可能得出错误的结论。我们希望通过在构建对照TRAP品系时的失败尝试来强调这一问题。迄今为止...

随着新一代测序技术应用的日益广泛，发育生物学中的空间分辨率得以提升。近年来的研究致力于将组织解析至特定的细胞类型，甚至达到单细胞水平1,2,3,4。为此，过去五十年中已开发出大量不同的方法（见图1A）5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。
植物科学中的许多工具都是对动物研究中首创的技术进行改造而来的。但我们在此详细介绍的方法却并非如此。2005年，Bailey-Serres实验室凭借其在蛋白质翻译领域的深厚背景，着手对核糖体蛋白进行改造，以实现后续的亲和纯化16。这样便可避免耗时且劳动强度大的多聚核糖体分析技术——该技术依赖于蔗糖梯度超速离心，自20世纪60年代以来一直用于评估正在翻译的核糖体17,18。该方法此后被称为翻译核糖体亲和纯化（translational ribosome affinity purification, TRAP）16。在植物中成功开展转译组研究后，Heiman等人将TRAP技术改造用于动物19，随后其他研究者又将其应用扩展至酵母20、Drosophila21、Xenopus22以及斑马鱼23,24。
尽管对模式系统进行遗传改造是 TRAP 技术的前提条件，这限制了其在易于遗传转化的物种之外的应用，但这一限制也可被同时利用，以靶向那些特别感兴趣且在完整组织/器官中原本极难分离的特定细胞亚群25（例如小鼠大脑中高度分支的树突细胞或受感染植物组织中的真菌菌丝）。在植物中，所有细胞均通过细胞壁固定在原位，而细胞壁构成了静水骨架的基础26。为了从该基质中释放植物细胞，科学家要么通过激光捕获显微切割（LCM）27将细胞从周围组织中物理切割出来，要么对细胞壁进行酶解消化28。在后一类方法获得的细胞（即所谓的原生质体）中，目标细胞群体可通过荧光激活细胞分选（FACS）7进行荧光标记并分离。LCM 通常需要将样品固定并包埋于石蜡中，这最终会降低其 RNA 的质量29。基于 FACS 的方法可获得高质量的 RNA，但原生质体制备过程本身会引入基因表达的差异30，且具有修饰化和厚的次生细胞壁的组织难以处理。此外，人们认为植物中的许多发育过程依赖于机械传导的信号，因此细胞壁的完整性至关重要31。有两种方法通过在细胞核水平上操作，绕过了细胞分离的步骤，即荧光激活核分选（FANS）和特定细胞类型中标记细胞核的分离（INTACT）。与 TRAP 类似，这些方法利用细胞类型特异性的启动子标记细胞核，随后分别通过分选或免疫沉淀富集标记的细胞核8,15。所有这些方法面临的一个主要挑战是从组织中的细胞亚群中获取足够量的 RNA 材料。由于 TRAP 仅捕获细胞内 RNA 的一小部分，样本收集成为显著的瓶颈。因此，需要特别灵敏的文库制备方案，以从极低输入量的样本中获得高质量的数据。
自从建立以来，TRAP 技术要么与 DNA 微阵列联用，要么随着近年来测序成本显著降低，与 RNA-seq10,32,33联用。大量研究问题已得到阐明，如 Sablok 等人所综述34。我们相信，随着该技术在结合不同启动子以靶向特定细胞类型方面表现出的高度灵活性，未来几年将会有更多相关报道出现。最终，该技术还将实现可诱导的方式，并可能与探究植物对多种生物和非生物胁迫因素反应的方法相结合。此外，在无法获得稳定转基因株系的情况下，毛状根表达系统也已成功用于番茄和苜蓿中的 TRAP 分析35,36。
<img alt="RNA测序方法示意图；展示了细胞转录组分析的工作流程，包括RNA提取、流式细胞分选（FACS）以及TRAP测序，并包含可视化数据采集阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：核糖体亲和纯化（TRAP）技术补充了“组学”分析工具集。 A. 通过多种方法或其组合，可实现越来越高的分析精度，达到单细胞甚至亚细胞分辨率。该示意图概述了目前在植物和动物领域可用的技术工具。通过LCM或FACS等方案可在细胞分辨率下采集组织样本，并进一步结合标准转录组或核糖体谱型/翻译组分析。TRAP和INTACT将组织捕获与RNA提取整合于一体，其原理基于表位标记。然而，INTACT仅针对细胞核进行采样，因此属于转录组分析的一种特殊情况。图中以小兔子图标标注了动物领域新近开发的方法：SLAM-ITseq和Flura-seq依赖于在表达许可酶的细胞中利用修饰的尿嘧啶碱基对新生RNA进行代谢标记，而Slide-seq则使用带有DNA条形码的包被玻片，以提供细胞尺度的空间位置信息。APEX-seq采用邻近标记策略，用于特异性地捕获特定亚细胞区室中的RNA。值得注意的是，分辨率的提升通常需要构建转基因材料（星号标注），因此这些方法主要应用于模式物种。TRAP特别适用于涉及细胞壁（CW）或机械信号传导的研究，以及那些难以从细胞壁基质中分离的细胞类型。 B. TRAP实验的详细湿实验步骤：在特定细胞类型（例如根内皮层）中表达GFP标记核糖体蛋白的幼苗，在培养皿中生长七天后，通过速冻法收集根组织材料。在通过离心去除碎片前，从匀浆粗提物中收集一份总RNA对照样品。向澄清的提取液中加入磁性抗GFP微珠，进行免疫沉淀。经过孵育及三次洗涤步骤后，直接通过苯酚-氯仿抽提法获得与多聚核糖体结合的RNA（TRAP/多聚核糖体RNA）。LCM：激光捕获显微切割，FACS/FANS：荧光激活的细胞/细胞核分选，APEX-seq：基于工程化抗坏血酸过氧化物酶的方法，INTACT：特定细胞类型中标记细胞核的分离，SLAM-ITseq：组织中RNA代谢测序的巯基（SH）连接烷基化法，Flura-seq：氟尿嘧啶标记RNA测序（使用Biorender.com创建） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
本文的目的是详细介绍TRAP方法，强调关键步骤，并为可能的文库制备方法提供指导。
一个通用的 TRAP 实验基本包含以下步骤（另见图1B）：（1）植物材料的准备，包括核糖体标记载体的克隆、转基因株系的构建与筛选、种子的扩繁、种子的灭菌与点板、施加/处理胁迫（可选）以及组织取材；（2）免疫纯化，包括组织匀浆与粗提物澄清、磁珠洗涤与免疫纯化，以及洗涤步骤；（3）RNA 提取与质量评估；以及（4）文库构建。
的 拟南芥 根自被引入作为模式植物以来，一直是研究植物发育的模式系统37,38在此，展示了TRAP技术在植物侧根发育研究中的应用。在植物中，整个根系的形成依赖于该程序的执行，因此对生物体的生存至关重要。39。在 拟南芥，侧根起源于位于木质部导管旁的中柱鞘组织，因此被称为木质部极中柱鞘（XPP；参见 图 2C)40一些位于根部内部较深处的XPP细胞获得起始细胞特性，并在局部激素信号的诱导下，通过膨大和垂周分裂开始增殖。41然而，由于存在刚性的细胞壁基质，该过程会对周围组织施加机械应力。特别是覆盖其上方的内皮层会受到影响，因其位于侧根生长轴的路径上42,43,44确实，新形成的原基必须穿过其上方的内皮层细胞生长。图 2C2而皮层和表皮细胞则被推向两侧，以便原基最终突出形成45,46最近，我们实验室的研究表明，内皮层在主动促进中柱鞘细胞增殖过程中发挥重要作用。特异性阻断内皮层的激素信号通路，足以抑制初生木质部原形成层（XPP）细胞的首次分裂。47因此，中柱鞘-内皮层间的通讯构成了侧根发育的早期重要检查点 拟南芥然而，目前尚不清楚这种串扰是如何实现的。为了揭示这一机制，我们采用了TRAP-seq方法来靶向XPP和内胚层细胞。为了富集处于侧根发育程序中的细胞，我们通过外源施加生长素类似物（1-萘乙酸，NAA）来模拟激素诱导。48同时能够对侧根形成的初始阶段进行时间上的解析。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;灭菌&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠溶液，13%</td><td>Sigma</td><td>71696</td><td></td></tr><tr><td>烧杯</td><td>VWR</td><td>214-1172/74/75</td><td></td></tr><tr><td>带瓷板的干燥器（DURAN）</td><td>Sigma/Merck</td><td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，分析纯</td><td>Honeywell</td><td>02860-1L</td><td></td></tr><tr><td>盐酸，37%</td><td>Roth</td><td>4625.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;平板培养与收获&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS盐，基础盐混合物，含MES缓冲液</td><td>Duchefa</td><td>M0254</td><td></td></tr><tr><td>植物细胞培养用琼脂</td><td>Applichem/Panreac</td><td>A2111.1000</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Rubis Switzerland</td><td>5-SA 型号</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾（KOH）</td><td>Fluka</td><td>60370</td><td></td></tr><tr><td>微孔胶带/外科手术胶带</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>萘乙酸（NAA）</td><td>Duchefa</td><td>N0903</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 120×120 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>688102</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>VWR/Swann-Morton</td><td>233-5454</td><td></td></tr><tr><td>中性双层擦拭纸</td><td></td><td></td><td>任选供应商</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;免疫沉淀&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP磁珠：gtma-100 GFP-Trap_MA</td><td>Chromotek</td><td>例如 gtma-100</td><td></td></tr><tr><td>Brij-35</td><td>Sigma</td><td>P1254-500G</td><td></td></tr><tr><td>离心管（与离心机匹配）</td><td>Beckman Coulter</td><td>357001</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Applichem</td><td>C0378-25G</td><td></td></tr><tr><td>棉质手套</td><td>VWR</td><td>113-7355</td><td></td></tr><tr><td>放线菌酮，HPLC级</td><td>Sigma</td><td>01810-1G</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>VWR</td><td>E174</td><td>可能交货周期较长</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Fluka</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）</td><td>Sigma</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>DUALL 23型匀浆器</td><td>KONTES GLASS CO (通过VWR购买)</td><td>SCERSP885450-0023（整套）</td><td>仅研杵 SCERSP885451-0023；仅研钵 SCERSP885452-0023；交货周期较长</td></tr><tr><td>Igepal CA-360</td><td>Sigma</td><td>I3021-100ml</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexahydrat）</td><td>Roth</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>研钵和研杵</td><td>VWR</td><td>470148-960 &amp; 470019-978</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Roche</td><td>10 837 091 001</td><td></td></tr><tr><td>聚氧乙烯-(10)-十三醇醚（PTE）</td><td>Sigma</td><td>P2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>无RNase水</td><td>Roth</td><td>T143.3</td><td></td></tr><tr><td>RNAZap</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9780/AM9782</td><td>用于表面清洁</td></tr><tr><td>Tris，>99.3%</td><td>Roth</td><td>AE15.3</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100（Triton X-100）</td><td>Fluka</td><td>T8787-250ml</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ml</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA提取&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙醇，分析纯</td><td>Sigma</td><td>33539-1L-GL-R</td><td></td></tr><tr><td>氯仿，HPLC级</td><td>Scharlau</td><td>CL02181000</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，分析纯</td><td>Honeywell</td><td>02860-1L</td><td></td></tr><tr><td>低吸附微量离心管，1.5 ml</td><td>Eppendorf/Sigma</td><td>Z666548-250EA</td><td>LoBind</td></tr><tr><td>无RNase的DNase试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniElute 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol试剂</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;文库构建&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15/50 mL 管磁力分离器</td><td>Abraxis</td><td>PN 472250</td><td></td></tr><tr><td>AMPure磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Index Kit A</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>Index Kit D</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2004</td><td></td></tr><tr><td>钕磁铁</td><td>Amazon/其他</td><td>6 × 1.5 mm，N42级（NdFeB）</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT试剂盒</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024/1096</td><td>&lt;a href=&quot;https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;https://emea.support.illumina.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PCR排管</td><td>ThermoScientific</td><td>AB-0266</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer v4试剂盒</td><td>Takara Bioscience</td><td>634892</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;https://www.takarabio.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td>用于RNA/DNA质量控制的专用设备</td></tr><tr><td>Tapestation</td><td>Agilent</td><td>4200 Tapestation Instrument</td><td>用于RNA/DNA质量控制的专用设备</td></tr><tr><td>Fragment Analyzer</td><td>Agilent</td><td>5400 Fragment Analyzer System</td><td>用于RNA/DNA质量控制的专用设备（高通量）</td></tr><tr><td>LabChip</td><td>PerkinElmer</td><td>LabChip GX Touch 核酸分析仪</td><td>用于RNA/DNA质量控制的专用设备（高通量）</td></tr><tr><td>Qubit 4 荧光计</td><td>ThermoFisher</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;Q33239&lt;/a&gt;</td><td>用于RNA/DNA浓度测定的专用设备</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;qRT-PCR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATA23</td><td>Microsynth</td><td></td><td>正向引物：AGTGAGAATGAA&lt;br/&gt; AGAAGAGAAGGG；&lt;br/&gt; 反向引物：GTGGCTGCGAAT&lt;br/&gt; AATATGAATACC</td></tr><tr><td>GH3.3</td><td>Microsynth</td><td></td><td>正向引物：CAAACCAATCCT&lt;br/&gt; CCAAATGAC；&lt;br/&gt; 反向引物：ACTTATCCGCAA&lt;br/&gt; CCCGACT</td></tr><tr><td>LBD29</td><td>Microsynth</td><td></td><td>正向引物：TCTCCAACAACA&lt;br/&gt; GGTTGTGAAT；&lt;br/&gt; 反向引物：AAGGAGCCTTAG&lt;br/&gt; TAGTGTCTCCA</td></tr><tr><td>UBC21</td><td>Microsynth</td><td></td><td>正向引物：TGCGACTCAGGG&lt;br/&gt; AATCTTCT；&lt;br/&gt; 反向引物：TCATCCTTTCTT&lt;br/&gt; AGGCATAGCG</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>#172-5270</td><td></td></tr><tr><td>iScript Adv cDNA合成试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>#172-5038</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Falcon管，Cellstar</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon管，Cellstar</td><td>Greiner bio-one</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 滤芯吸头</td><td>Axygen</td><td>TF-1000-R-S</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;l 滤芯吸头</td><td>Axygen</td><td>TF-10-R-S</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;l 滤芯吸头</td><td>Axygen</td><td>TF-100-R-S</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;l 滤芯吸头</td><td>Axygen</td><td>TF-20-R-S</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l 滤芯吸头</td><td>Axygen</td><td>TF-200-R-S</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>SARSTEDT</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma</td><td>P4170-100MG</td><td></td></tr><tr><td>测序公司</td><td>Novogene</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://en.novogene.com&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;en.novogene.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

细胞类型特异性尺度下研究拟南芥（arabidopsis thaliana）根发育的核糖体亲和纯化（trap）技术转化应用

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

本文中，我们提供了通过核糖体亲和纯化（TRAP）方法及后续优化的低起始量文库制备技术，从不同Arabidopsis thaliana根部细胞类型中获取转译组数据的详细实验操作指南。
我们采用表达GFP标记的核糖体蛋白RPL18的植物品系作为起始材料，该表达通过使用适当的启动子实现细胞类型特异性。在免疫纯化和RNA提取之前，组织被迅速冷冻，以保持组织完整性，同时允许进行具有高时间分辨率的时间序列研究。值得注意的是，细胞壁结构保持完整，这是其他方法（如基于荧光激活细胞分选的技术）的主要缺陷，后者依赖于原生质体化来分离特定细胞群体。此外，与基于激光捕获显微切割的技术不同，本方法无需组织固定，因而能够获得高质量的RNA。
然而，从细胞亚群中取样并仅分离与多聚核糖体结合的RNA会严重限制RNA的得率。因此，有必要采用足够灵敏的文库制备方法，以确保通过RNA测序成功获取数据。
TRAP 为植物研究提供了一种理想的工具，因为许多发育过程都涉及细胞壁相关和机械信号通路。利用启动子靶向特定细胞群体，能够弥补器官水平与单细胞水平研究之间的空白，而这些传统方法往往分别受限于分辨率不足或成本过高。在此，我们应用 TRAP 技术研究侧根形成过程中的细胞间通讯。

为进行质量评估，应对上述流程的多个中间步骤进行检测：包括在植株中验证表达模式、对分离的多聚核糖体RNA以及最终文库进行质量控制。此外，还可通过已知标记基因进行qRT-PCR，以确认对处理条件的响应或优化实验条件。
共聚焦分析 GFP 信号分布 
为了检测内胚层和 XPP 的表达模式，我们通过共聚焦显微镜分析了 pELTP::GFP-RPL18 和 pXPP::GFP-RPL18 的纯合品系。图 2A 和 图 2B 显示了具有 GFP 信号（绿色）的代表性植株，其细胞壁经碘化丙啶复染（品红色）以清晰界定。在 图 2A1<...

核糖体亲和纯化（TRAP）技术能够在对器官和组织进行最少处理的情况下，解析发育过程。该方案可从表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的核糖体亚基的靶向细胞中提取高质量RNA。通过qRT-PCR或RNA-seq等下游分析工具，可揭示组织和细胞类型特异性的基因表达谱。

细胞类型特异性尺度下研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）根发育的核糖体亲和纯化（TRAP）技术转化应用

本文中，我们提供了通过翻译核糖体亲和纯化技术从拟南芥（Arabidopsis thaliana）根部不同细胞类型获取转译组数据的详细实验操作指南。

利用TRAP技术，我们可以在细胞水平上研究发育过程。我们使用特定细胞类型的启动子来驱动带有标签的核糖体亚基，从而分离多聚核糖体RNA。该方案能够获得高质量的RNA，但产量非常有限，因此需要采用专门针对超低起始量的方法，以可靠地构建高质量的RNA文库。TRAP 是植物研究的理想工具，因为许多发育过程依赖于细胞壁相关和机械信号通路。我们利用 TRAP 研究侧根形成过程中的细胞间通讯。由于获取高质量 RNA 的过程比我们预期的更为复杂，我们希望这个逐步讲解的视频教程能够提高 TRAP 技术的可应用性，并推动这一强大技术的广泛应用。为对扩繁的纯合品系进行灭菌，将少于300微升的种子均匀铺在12厘米×12厘米的培养皿中，并将培养皿叠放在60升的干燥器上。经过过夜气体灭菌后，待气体挥发完毕，再将种子收集至50毫升储存管中。在接种前，用0.1%琼脂稀释灭菌后的种子，使每块平板获得1毫升吸胀种子混合液。为播种种子混合物，使用方形培养皿盖制作成层压模板架，用于在每块培养板上种植三排种子，并将空的琼脂培养板放入该模板架中。将1 mL吸胀后的种子均匀分配到三排培养板上。然后将处理好的培养板叠放于超净工作台中，直至种子干燥。当种子粘附在琼脂表面后，盖上培养皿盖，并用微孔胶带密封每个培养皿。为了对拟南芥根进行外源处理，准备宽1.5至2厘米、长10厘米的滤纸条。将滤纸条浸入10 µM NAA溶液中，然后用镊子将滤纸条分别贴附于每排根上。然后轻轻挤出任何气泡，并倒掉培养板中多余的液体，再标记上时间。在适当的实验终点，用镊子小心地从每块培养板上取下滤纸条，注意不要使根部脱离，再用手术刀沿每排的地上部与根部交界处果断地一次性切割。用镊子沿每排根部轻轻刮取，将根系收集成三小束。将根系倒入装有液氮的50毫升离心管中，进行速冻。当每个处理组的所有根系样品采集完毕后，用管盖倾倒出多余的液氮，防止根系洒出。然后将离心管放入杜瓦瓶中，于-80摄氏度保存。进行组织研磨和匀浆时，需在标准实验手套内佩戴棉质手套，并在多聚核糖体提取缓冲液中加入PMSF。将组织样品倒入含有液氮的研钵中，用预冷的研杵小心研磨组织，直至所有材料呈白色粉末状。当组织完全研磨后，向样品中加入5 mL多聚核糖体提取缓冲液，在缓冲液冻结前迅速将冻结的组织碎片与粉末混合均匀。一旦混合物可以转移，立即将匀浆倒入冰上的玻璃匀浆器中，并用额外的 2 毫升多聚核糖体提取缓冲液冲洗研钵和研杵。手动研磨匀浆，直至提取物呈均一状态。然后，将粗根提取物倒入冰上预冷的 50 毫升离心管中，并按示范处理下一个样品。为收集总RNA，将每份粗提样品各200微升转移至单独的洁净、预冷并标记好的微量离心管中。为去除细胞壁、碎片及大型细胞器，对样品进行离心，并将上清液倾入新的预冷锥形管中进行第二次离心。在离心过程中，将每份样品60微升的磁性GFP珠子分装至1.5毫升离心管中。将离心管置于磁力架上，以方便去除上清液。随后，每次用一毫升冷洗涤缓冲液洗涤磁珠两次，并将磁珠重新悬浮于每份样品60微升的洗涤缓冲液中。离心后立即将澄清的上清液倾入已标记的15毫升离心管中，并向每份样品中加入60微升已洗涤的磁珠。然后，将所有样品水平放入冰桶中，在摇床上冰浴孵育两小时。孵育结束后，将样品置于冰上的磁力架上收集磁珠，并向剩余的多聚核糖体提取缓冲液中加入PMSF。弃去上清液后，向样品中加入约五毫升多聚核糖体提取缓冲液，并通过轻轻倾斜重新悬浮样品中的磁珠。将样品置于冰上，在振荡器上摇动15分钟，随后如所示在磁力架上用新鲜洗涤缓冲液洗涤两次。最后一次洗涤后，将样品转移至含有1毫升洗涤缓冲液的1.5毫升离心管中。再次将磁珠置于磁力架上，彻底去除上清液。然后将试管置于冰上，直到所有样品处理完毕。对于实验耗材的再处理，首先将所有设备中的残留物冲洗至化学废液容器中。用肥皂手洗研钵、研杵和匀浆器，然后彻底冲洗每件仪器。接下来，将设备放入耐热容器中，在高于220摄氏度的条件下烘烤材料过夜。在将离心管放置于带有边缘且可高压灭菌的托盘并置于通风橱之前，先用去污剂彻底刷洗所有离心管。将1毫升液体焦碳酸二乙酯与1升去离子水的溶液倒入离心管中，处理3至18小时。然后，在高压灭菌器中对试管托盘进行灭菌前，收集溶液。此处显示的是具有 GFP 信号的代表性植株。用碘化丙啶进行复染，以标记细胞壁轮廓。这些线条对应于内皮层和木质部极中柱鞘的定位模式。这些代表性数据来自多聚核糖体RNA，大多数样本的降解程度极低，RNA完整性数值在9到10之间。在这些图谱中，可以观察到成功构建的文库痕迹，表明尽管反应体系有所缩小，该实验步骤仍具有良好的稳健性。在生成覆盖全基因组的数据集之前，可通过定量RT-PCR检测预实验中的TRAP RNA，以验证处理效果和/或实验条件以及组织特异性。本分析中，对三个生长素响应基因的检测证实，经两小时处理后激素诱导成功。从测序数据中获得的组织特异性标记基因表达谱进一步确认了细胞类型的特异性。处理RNA时应遵循良好操作规范。在无菌操作台中进行工作，使用去除RNA的溶液清洁仪器，佩戴手套并在手套污染后立即更换。务必妥善处理和丢弃实验过程中使用过的所有有毒化学品和气体，特别是苯酚-DEPC、氯气以及液氮。在组学研究领域中，TRAP 占据着重要的地位，并已被用于解答许多生物学问题，尤其是在发育生物学中，TRAP 具有巨大的潜力。

translating-ribosome-affinity-purification-trap-to-investigate

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

翻译核糖体亲和纯化（TRAP）以研究细胞类型特异性尺度下阿拉伯生物基塔利亚纳根发育

本文展示了一种从植物材料中分离特定细胞类型的实验方法。该技术利用在特定细胞类型中表达荧光蛋白的转基因标记品系，结合细胞解离和荧光激活细胞分选技术进行细胞分离。此外，本文还建立了一种生长体系，便于在细胞分选前对Arabidopsis...

植物原生质体的荧光激活细胞分选

一种用于制备的方法 拟南芥 适用于荧光激活细胞分选（FACS）的叶片原生质体，可用于特定细胞群体的研究。该方法适用于任何 拟南芥...

细胞特异性分析 拟南芥 使用荧光激活细胞分选法分离叶片细胞

翻译核糖体亲和纯化（Translating Ribosome Affinity Purification,...

稀有细胞群体的核糖体亲和纯化技术（TRAP-rc） 黑腹果蝇 胚胎

结晶纤维素是植物细胞壁的重要组成成分。然而，在细胞分辨率下对其进行定量在技术上具有挑战性。本文中，我们报道了利用偏振光技术结合根部横切片，以获取具有时空分辨率的细胞壁组分信息。...

高分辨率定量分析结晶纤维素的积累 拟南芥 监测组织特异性细胞壁修饰的根部方法

本文介绍了一种应用于Arabidopsis...

植物原生质体mRNA相互作用组捕获

我们介绍一种通过在核糖体中特异性地对血管内皮细胞（ECs）的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）进行基因标记，并结合RNA纯化方法，直接从小鼠脑、肺和心脏组织中纯化核糖体结合的mRNA的技术。...

体内内皮细胞RNA分离的核糖体亲和纯化（TRAP）技术

我们使用简单的实验工具来观察拟南芥和苜蓿的根系结构（RSA）。将幼苗在网筛上进行水培培养，并用画笔将其展开以显露根系结构。通过扫描仪或高分辨率相机拍摄图像，然后使用ImageJ软件分析并绘制性状图谱。...

一种用于绘制植物根系构型性状的简易方案

高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）方法的可行性和有效性预示着植物研究进入单细胞时代。本文介绍了一种分离特定拟南芥（Arabidopsis...

植物细胞类型的分离与转录组分析

本文介绍了几种常用的研究质膜受体激酶膜运输事件的方法。文稿中描述了详细的实验方案，包括植物材料准备、药物处理以及共聚焦成像设置。...

基于图像的方法研究气孔谱系细胞中的膜运输事件

该过程结合使用共聚焦显微镜与荧光标记的细胞核及染色质标记品系 拟南芥 同时记录细胞核与染色质动态 拟南芥...

发育与环境胁迫过程中细胞核形态及染色质动态的定量活细胞成像 拟南芥 根

学习翻译核糖体亲和纯化技术，用于研究拟南芥根发育过程中的细胞类型特异性基因表达。该方法结合超低量RNA文库制备，为植物发育生物学研究提供高质量数据。

细胞类型特异性尺度下研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）根发育的核糖体亲和纯化（TRAP）技术转化应用

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