基于AFM的力光谱单分子共价附价
March 16th, 2020
探针分子附于原子力显微镜（AFM）悬臂尖端是研究其物理特性的关键技术。这使我们能够通过基于 AFM 的单分子力光谱，确定聚合物的拉伸力、解吸力和长度，具有高可重复性。
单分子力光谱使我们能够测量描述聚合物机械和粘合特性的物理参数。当使用基于AFM的力光谱来研究单个分子时，必须拥有可靠而高效的协议，将这些分子与AFM悬臂尖端共价结合。无论轮廓长度或疏水性如何，此协议均可用于许多不同的聚合物。
所有步骤都应在烟气罩中执行，以避免吸入有机蒸汽。此外，还需要耐溶剂玻璃、实验室涂层和眼睛保护。首先使用刚清洗的钳子将 AFM 悬臂芯片放在等离子室中。
选择"开始"和"是"，启动等离子室表面激活程序。验证等离子过程是否正常工作。含氧量高的等离子工艺显示浅蓝色。
当表面激活程序执行时，将硅烷-PEG-mal 溶解在甲苯中，以获得每毫升 1.25 毫克的浓度。将溶液的三毫升放在扁平的培养皿中。等离子过程完成后，通过选择确认，然后通风，使等离子体室通风。
立即执行下一步，以防止污染物的吸收。将芯片放在培养皿中，在60摄氏度下孵育3小时。从烤箱中取出培养皿，让其冷却至少 10 分钟。
接下来，冲洗芯片。对于 PEG 或聚苯乙烯结合，用甲苯冲洗三次。对于聚尼帕姆结合，芯片应用甲苯冲洗一次，用乙醇冲洗两次。
为了减少毛细管力对AFM悬臂的影响，冲洗时稍微倾斜芯片。AFM悬臂芯片需要正确冲洗，以去除任何可能影响实验的物理聚合物。应仔细进行冲洗，以防止对 AFM 直向发生任何损坏。
最后，准备至少两个芯片作为控制，不会进行共价聚合物附件。对于控制与PEG和聚苯乙烯芯片，用乙醇冲洗两次，一次用水冲洗。对于控制与多尼帕姆芯片，用水冲洗两次。
要执行PEG或聚苯乙烯的共价附着，以每毫升1.25毫克的浓度在甲苯中准备三毫升聚合物溶液。将溶液和碎屑加入培养皿中，在60摄氏度下孵育芯片一小时。使用PEG或聚苯乙烯孵育后，让芯片冷却10分钟。
用甲苯冲洗两次，用乙醇冲洗两次，用水冲洗一次。要执行聚尼帕的共价附着，在乙醇中以每毫升1.25毫克的浓度准备三毫升聚合物溶液。将溶液和芯片加入培养皿中，在室温下孵育芯片三小时。
使用多尼帕姆孵育后，用乙醇冲洗芯片两次，用水冲洗两次。要将芯片储存到实验使用，请将每个芯片分别放在装满水的一毫升培养皿中。将培养皿保持在摄氏四度。
首先，将功能化的 AFM 悬臂芯片插入芯片支架中。将制备的表面粘合到样品架中，以适合在液体中测量。使用移液器将芯片浸入水中。
将样品表面安装到 AFM 中。将样品表面浸入水中。将芯片支架连接到 AFM。
然后接近芯片到样品表面。使用环境面板设置目标温度，并打开模式和反馈单选按钮。然后让系统平衡约 15 分钟。
要采用力延伸曲线，请接近 AFM 悬臂尖端到曲面并选择单力。生成的曲线显示对压电距离的偏转，接近表面时以红色显示，缩回以蓝色显示。展开表示 AFM 悬臂尖端凹陷到基础曲面的曲线部分。
若要执行线性拟合，请在方法或缩回曲线上设置光标，然后从上下文菜单中选择更新 INVOLS。反向光学杠杆灵敏度值的结果值将显示在左上角的面板中。重复此过程至少五次后，计算反向光学杠杆灵敏度的平均值，并在面板中输入平均值。
通过选择"移动到预接合"，将 AFM 悬臂在表面上方约 100 微米的高度放置。要获得热噪声谱的令人满意的信噪比，请将平均计数设置为至少 10，并选择尽可能高的频率分辨率。接下来，通过选择捕获热数据记录热噪声谱。
为了将热噪声谱与简单的谐波振荡器功能配合使用，请展开代表第一个谐振峰的曲线部分。然后选择初始化拟合。最后，使用拟合热数据按钮优化拟合。
相应的力常量将显示在面板中。要开始收集数据，请为实验设置参数。将拉力速度设置为 1 微米/秒，将力触发设置为一个 nanonewton。
接近 AFM 悬臂尖端到表面，并选择单力来记录单个曲线，并确定是否需要按手稿中所述调整参数。从主面板中选择 F 映射。要获取具有 100 条曲线的力图，请将力点数和力线数设置为 10。
通过选择 Do F 贴图开始记录力图。以网格般的方式采取力延伸曲线，以避免任何局部表面效果，并平均不同的曲面区域。实验后，重复确定反向光学杠杆灵敏度和弹簧常数，以检查系统的一致性和稳定性。
单聚尼帕姆和PEG聚合物在一端与AFM悬臂尖端共同加在一起，并在另一端的二氧化硅表面物理上。为了测量与温度相关的拉伸行为，确定了一个清晰的单分子拉伸事件，随后在相应力延伸曲线的末尾确定最终最大值。然后，每个温度生成一个主曲线。
对于PEG，随着温度的升高，拉伸力的降低。对于多尼帕，观察到相反的趋势。从水中的SAM表面对聚苯乙烯的脱吸可用于确定脱吸力和长度。
当聚合物附件成功时，力延伸曲线显示出恒定力的高原。每个高原都装有一条西莫形曲线，以确定脱吸力和脱吸长度。观察到的脱吸力与先前获得的值相对应。
当多个聚合物连接到 AFM 悬臂尖端时，在力延伸曲线中观察到高原的级联。附着两种聚合物后，在脱吸长度上发现双模分布，而脱吸力则表现出狭窄的分布。功能化的AFM悬臂尖端可用于量化液体环境中单分子的力反应和外部刺激。
使用清洁设备、溶剂、AFM 悬臂尖端和重复冲洗对于达到高清洁度非常重要，应在所述受控实验之前确认。所提出的协议和程序为更好地了解刺激反应聚合物系统铺平了道路。结果可直接与分子动态模拟进行比较。
概览
本文讨论了一种将探针分子共价附着到原子力显微镜（AFM）悬臂尖端的协议，这对于研究聚合物的物理性质至关重要。该方法可以高度重复性地测量拉伸力、解吸力和聚合物长度。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 聚合物科学
背景
- 单分子力谱学对于测量聚合物的机械性质至关重要。
- 可靠的共价结合到AFM悬臂的协议对于准确测量是必要的。
- 处理有机溶剂时，安全预防措施至关重要。
- 适当的冲洗技术对于避免污染至关重要。
研究目的
- 提供一种将聚合物共价附着到AFM悬臂的详细协议。
- 确保测量聚合物物理性质的重复性。
- 促进对各种聚合物的研究，不论其特性如何。
使用的方法
- 使用等离子体室对AFM悬臂芯片进行表面活化。
- 准备聚合物溶液以进行共价附着。
- 孵育和冲洗协议以确保正确的结合。
- 使用AFM测量力-伸长曲线。
主要结果
- PEG、聚苯乙烯和聚尼帕姆成功共价附着到AFM悬臂。
- 在力测量中展示了重复性。
- 提供了一种准备和使用功能化AFM悬臂的全面方法。
- 强调了实验中冲洗和控制芯片的重要性。
结论
- 该协议使得使用AFM可靠地研究聚合物性质成为可能。
- 正确的准备和处理对于成功的实验至关重要。
- 未来的应用可以扩展到各种聚合物类型和配置。
常见问题
Executive Industry Relevance
Covalent single-molecule attachment enables reproducible force spectroscopy measurements critical for de-risking polymer-based therapeutic candidates. This approach provides quantitative mechanical and adhesive data that supports target validation and lead identification in stimuli-responsive drug delivery systems. By establishing reliable single-molecule benchmarks, the method enhances predictive confidence in preclinical model selection and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of polymer-surface interactions to clarify binding mechanisms and functional target relevance.
- Operational Value: Provides hundreds of force-extension traces from a single molecule, reducing experimental variability and increasing data robustness.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying stretching and desorption forces under controlled stimuli, informing structure-property relationships.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative force-extension readouts (stretching force, desorption force, length) suitable for high-content polymer screening.
- Operational Value: Standardized covalent attachment and rinsing protocols ensure assay reproducibility across polymer types and experimental batches.
- Scalability: Functionalized AFM cantilevers can be stored and reused, enabling platform-wide deployment in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Force spectroscopy data from single molecules can be directly compared to molecular dynamics simulations, bridging scales for predictive modeling.
- Disease-Relevant Systems: Applicable to stimuli-responsive polymers (e.g., PEG, PNiPAM) used in drug delivery, enabling evaluation of temperature- or pH-dependent behavior.
- Preclinical De-risking: Measures desorption events under physiologically relevant conditions, supporting go/no-go decisions for formulation advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early polymer screening to preclinical formulation testing, providing mechanical property data that informs lead optimization and risk-adjusted advancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of polymer adhesion and mechanical stability in liquid environments, reducing mechanistic ambiguity.
- Screening: Delivers standardized, quantitative force measurements that enable reliable comparison of polymer candidates across libraries.
- Analytics: Outputs include force and length parameters derived from sigmoidal fitting of plateaus, enabling statistical comparison of polymer batches.
- Translational Research: Connects single-molecule behavior to bulk polymer performance, supporting continuity from discovery to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Functionalized chips can be prepared in batches, stored at 4°C, and reused across projects, maximizing resource efficiency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in polymer-surface interactions, increasing confidence in target validation assays.
- Operational Value: High reproducibility through controlled covalent attachment and rigorous rinsing minimizes false positives and experimental noise.
- Strategic Value: Enables data-driven go/no-go decisions in polymer selection, reducing late-stage formulation failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of polymer candidates based on quantified mechanical and adhesive profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, plasma surface treatment, and polymer solution handling.
- Needs plasma chamber, temperature-controlled incubator, solvent-resistant glassware, and AFM with liquid-cell capability.
- Demands standardization of rinsing protocols across teams to prevent capillary force artifacts and contamination.
- Must account for polymer-specific binding conditions (e.g., toluene vs. ethanol, incubation time/temperature) as outlined in the protocol.
- Practical limitation: Successful single-molecule interpretation depends on low surface density to avoid multi-molecule cascades in force traces.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Surface Activation, Silanization, and PEGylation
3:03
Covalent Polymer Attachment
4:21
Determining the Inverse Optical Lever Sensitivity (InVOLS)
6:13
Determining the AFM Cantilever Force Constant
7:06
Data Collection
8:10
Results: Single-Molecule Stretching and Desorption
9:44
Conclusion
