用于基于原子力显微镜的力谱单分子共价连接

单分子力谱技术使我们能够测量描述聚合物力学和黏附特性的物理参数。在使用基于原子力显微镜（AFM）的力谱技术研究单个分子时，必须具备一种可靠且高效的方案，将这些分子共价连接至AFM悬臂探针尖端。该方案可适用于多种不同的聚合物，无论其轮廓长度或疏水性如何。

所有步骤均应在通风橱中进行，以避免吸入有机蒸气。此外，必须佩戴耐溶剂玻璃器皿、实验服和护目装备。首先使用新近清洁的镊子将原子力显微镜（AFM）悬臂芯片放入等离子体腔室中。

通过选择“开始”然后“是”来启动等离子腔室表面活化程序。确认等离子处理过程正常工作。高氧气含量的等离子过程会呈现淡蓝色。

在表面活化程序运行的同时，将硅烷-PEG-马来酰亚胺溶于甲苯中，配制成浓度为 1.25 毫克/毫升的溶液。取 3 毫升该溶液置于平底培养皿中。等等离子体处理完成后，选择“确认”然后进行放气，以对等离子体腔体进行通风。

立即进行下一步操作，以防止污染物吸附。将芯片放入培养皿中，在60摄氏度下孵育3小时。从烘箱中取出培养皿，静置冷却至少10分钟。

接下来，清洗芯片。对于 PEG 或聚苯乙烯结合，用甲苯清洗芯片三次。对于聚N-异丙基丙烯酰胺（polynipam）结合，芯片应先用甲苯清洗一次，再用乙醇清洗两次。

为降低毛细力对原子力显微镜（AFM）悬臂梁的影响，冲洗时应将芯片略微倾斜。AFM悬臂梁芯片必须充分冲洗，以去除可能影响实验结果的过量物理聚合物。冲洗过程中应小心操作，避免对AFM悬臂梁造成任何损伤。

最后，准备至少两个芯片作为对照，这些芯片将不进行共价聚合物连接。对于与PEG和聚苯乙烯芯片对照的实验，用乙醇冲洗两次，再用水冲洗一次；对于与聚NIPAM芯片对照的实验，用水冲洗两次。

为了实现聚乙二醇（PEG）或聚苯乙烯的共价结合，需在甲苯中配制三毫升浓度为每毫升1.25毫克的聚合物溶液。将该溶液与芯片一同加入培养皿中，并在60摄氏度下孵育一小时。在与PEG或聚苯乙烯孵育后，让芯片冷却10分钟。

用甲苯冲洗芯片两次，乙醇冲洗两次，水冲洗一次。为实现聚NIPAM的共价结合，配制3毫升浓度为1.25毫克/毫升的乙醇聚合物溶液。将该溶液与芯片加入培养皿中，在室温下孵育3小时。

用聚NIPAM孵育后，用乙醇冲洗芯片两次，再用水冲洗两次。若需在实验前储存芯片，应将每片芯片单独置于盛有1毫升水的培养皿中，并将培养皿保存在4摄氏度条件下。

首先，将功能化的原子力显微镜悬臂梁芯片插入芯片支架中。将制备好的表面粘附到适用于液体环境中测量的样品支架上。使用移液器将芯片浸入水中。

将样品表面安装到原子力显微镜（AFM）中。将样品表面浸入水中。将芯片支架连接至原子力显微镜（AFM）。

然后将芯片靠近样品表面。使用环境控制面板设置目标温度，并将模式和反馈单选按钮切换至开启状态。随后让系统平衡约15分钟。

采集力-伸展曲线时，将原子力显微镜（AFM）悬臂针尖接近表面并选择单次力模式。所得曲线显示悬臂偏转随压电扫描器移动距离的变化，其中接近表面的过程以红色表示，回撤过程以蓝色表示。展开曲线中代表AFM悬臂针尖压入基底表面的部分。

进行线性拟合时，在接近或回撤曲线上的任意位置设置光标，然后从上下文菜单中选择“更新 INVOLS”。逆光杠杆灵敏度值将显示在左上方的面板中。重复此步骤至少五次后，计算逆光杠杆灵敏度的平均值，并将该平均值输入面板中。

通过选择“移动至预接触位置”，将原子力显微镜（AFM）悬臂置于样品表面约100微米的高度。为获得理想的热噪声谱信噪比，将平均次数设置为至少10次，并选择尽可能高的频率分辨率。接下来，通过选择“采集热噪声数据”来记录热噪声谱。

为了用简谐振子函数拟合热噪声谱，需扩展代表第一共振峰的曲线部分。然后选择初始化拟合。最后，使用“拟合热数据”按钮优化拟合结果。

相应的力常数将显示在面板中。开始采集数据前，需设置实验参数：将拉伸速度设为每秒一微米，触发力设为一纳牛顿。

将原子力显微镜（AFM）悬臂探针接近样品表面，选择单次力测量以记录一条力曲线，并根据文中所述判断是否需要调整参数。在主面板中选择力图谱（F map）。为获得包含100条曲线的力图谱，将力测量点数和力测量线数均设置为10。

通过选择“执行力图”（do F map）开始记录力图。以网格状方式采集力-延伸曲线，以避免局部表面效应，并对不同表面区域进行平均。实验结束后，重复测定光杠杆灵敏度的倒数和弹簧常数，以检验系统的稳定性和一致性。

单个聚NIPAM和PEG聚合物的一端共价连接到原子力显微镜（AFM）悬臂针尖，另一端在二氧化硅表面发生物理吸附。为了测量温度依赖性的拉伸行为，识别出力-伸展曲线末端出现清晰的单分子拉伸事件及最终的最大值。随后，针对每个温度生成了一条单一的主曲线。

对于PEG，随着温度升高，观察到拉伸力下降；而对于polynipam，则观察到相反的趋势。聚苯乙烯在水中的自组装单分子层（SAM）表面的脱附可用于测定脱附力和脱附长度。

当聚合物成功连接时，力-延伸曲线显示出恒定力的平台区。每个平台区均用S型曲线进行拟合，以确定解吸力和解吸长度。所观察到的解吸力与先前获得的数值相符。

当多个聚合物连接在原子力显微镜（AFM）悬臂针尖上时，力-延伸曲线中观察到一系列平台级联现象。当连接两个聚合物时，脱附长度呈现双峰分布，而脱附力则表现出窄分布。功能化的AFM悬臂针尖可用于在液体环境中并施加外部刺激条件下定量测定单个分子的力学响应。

使用洁净的设备、溶剂、原子力显微镜（AFM）探针尖端以及反复冲洗对于达到高水平的清洁度至关重要，应在进行所述的受控实验之前确认清洁度。所展示的实验方案和操作步骤为深入理解响应性刺激聚合物体系奠定了基础。实验结果可直接与分子动力学模拟进行比较。