将类似蛋白的蛋白质定向组装到定义的超分子结构和体外货物封装中

有效组装超分子结构，以最小的细胞设计和药物输送仍然具有挑战性。在这里，我们演示了基于两栖弹性蛋白蛋白产生超分子结构的高效方案。提出的装配方案可生成具有适应性物理化学特性的多功能超分子结构，如囊泡、纤维和共热物。

基于蛋白质膜的隔间演示相分离行为，并允许封装化学多样化的荧光货物分子。对于 F20E20-mEGFP 和 F20E20-mCherry 的表达，将主要表达区域性从隔夜前培养到 OD600 的 0.3。在 400 毫升无菌 LB 介质中孵育，并在 37 摄氏度和 200 rpm 时补充适当的抗生素。

当表达培养达到0.5至0.8的OD600时，将IPTG加入到1毫摩尔的最终浓度中，并将孵化温度降至20摄氏度。对于两栖ELP与非自然氨基酸的表达，接种含有适当质粒的隔夜大肠杆菌前期培养的主要表达培养，以0.3的OD。在 400 毫升无菌 LB 介质中孵育，并在 37 摄氏度和 200 rpm 时辅以卡那霉素和氯霉素。

要准备100毫摩尔非天然氨基酸，在8毫升超纯水中加入206.2毫克不自然氨基酸。用三摩尔氢氧化钠提高溶液的pHH，并大力混合。当非自然氨基酸溶解时，将pH值降低至约10.5，并在10毫升的体积中加入超纯水。

使用无菌 0.22 微米过滤器过滤溶液，并在两毫升反应管中等同。当表达培养达到 0.5 到 0.8 的 OD600 时，将非自然氨基酸添加到两毫摩尔的最终浓度中。孵育10分钟以上。

然后通过同时添加IPTG和阿拉伯酶诱导靶蛋白和必要tRNA合成酶的表达。将孵化温度降至20摄氏度，并允许表达持续约20小时。孵育后，在4摄氏度和4000次g的离心下收获细胞40分钟。

用解酶和PMSF将细胞颗粒重新在解解缓冲液中。在冰上孵育溶液30分钟。然后冷冻并解冻两次，淹没在液氮中。

声波悬浮液，并在10，000倍g和4摄氏度的离心下清除乳酸，40分钟。然后用亲和色谱法纯化蛋白质。蛋白质洗脱后，将其储存在四摄氏度，直到进一步使用。

在 ELP 溶液的 500 微升中加入一微升荧光染料，在 15 摄氏度下孵育反应约 10 小时，同时在热混合器中摇动，确保保护其免受光线影响。要去除过量的荧光染料，在超纯水中平衡透析膜10分钟。使用单击的 ELP 溶液将膜切成正确的尺寸，放在反应管开口的顶部。

然后用没有芯的盖子合上管子，将膜固定到开口上。用缓冲器填充盖子和膜之间的空间，以防止空气被困。然后将反应管放在所选缓冲液中，将其推到表面下方，然后倒置。

在四摄氏度下进行至少三个小时的透析，使透析在每次缓冲液更换后至少再持续三个小时。对于 THF 膨胀，用稳定的 pH 7.5 对磷酸盐或 Tris 缓冲液进行同源 ELP 溶液。准备冻干剂，冷却至起动温度进行冷冻干燥。

在1.5毫升反应管中，用盖封盖，用小孔密封，避免因冷冻干燥过程中的压力变化而失去固体样品。冲击冻结液氮中的样品。将冷冻蛋白样本从液氮中拿出，并立即将它们放在冻干剂中，开始冷冻干燥。

样品完全干燥后，用干氮通风，并立即关闭反应管盖，避免与空气湿气接触。将纯 THF 添加到冻干样品中，将溶液与冰水一起放在水浴声波器中 15 分钟。将热循环器预热至 30 至 60 摄氏度，用于囊泡形成或纤维形成高达 90 摄氏度，并准备带超纯水或缓冲液的新反应管。

声化后，将ELP/THF溶液和准备好的水或缓冲液放在热循环器中五分钟。然后将 ELP 溶液分层到水或缓冲液上，确保两个相分离和明显的相位是可见的，然后将混合物放回热循环器中。让样品在室温下冷却10分钟，然后对水或缓冲液进行透析，或用荧光显微镜进行透析。

准备 1 到 50 微摩尔 ELP 解决方案，并添加 10 至 20%1-1-1-butanol。立即通过上下移液混合溶液。溶液的浊度在混合过程中应增加，表示囊泡形成。

为了实现狭窄的尺寸分布，用迷你挤出机通过孔径为一微米的膜挤压囊泡。对于染料封装，在 10 毫摩尔 Tris-HCl 中混合约 40 微升 ELP 溶液，在 DMSO 中混合一个 Dextran 德州红股票溶液的微升。加入10微升1-25毫米针，通过装有0.25-25毫米针头的注射器挤出5至10次。

THF膨胀方法由三个连续步骤组成，根据温度产生不同的ELP超分子组件。荧光显微镜图像显示从BDP-R20F20组装的囊泡和从BDP-R40F20组装的纤维结构。1-butanol 挤出方法专门导致 ELP 囊泡的形成。

与 THF 膨胀方法相比，产生的囊泡数量多两个数量级。BDP-R40F20与10-15%的乙醇混合，通过混合物的挤出来准备囊泡。通过THF膨胀协议，从BDP-R40F20组装了不同的超分子结构。

调节缓冲液的 pH 值和装配过程的温度，形成囊体、纤维或囊泡。装配协议中的小错误可能导致聚合的形成。正带染料 ATTO Rho 13 和多糖二氧化二氮红 3000 被封装到囊泡的流明中，这些囊泡通过 1-丁醇挤出法从 F20R20-mEGFP 组装。

共体显微镜图像显示绿色通道中的囊泡、红色通道中的货物以及结果合并通道中的成功封装。还证明了ELP两栖动物在单个PMBC构建基块与组合PMBC种群混合时相分离和融合行为。在PMBC组装前的混合导致组装的PMBC膜内均匀分布的分子，而混合组装的囊泡群体导致红或绿荧光的膜斑块，可见至少20分钟。

尝试本程序时，注意正确的步进顺序以及THF膨胀法与丁醇挤出法的区别。按照此协议，ELP囊泡可用作药物输送穿梭，用作酶反应的平台，如体外转录和翻译，或形成合成最小细胞。