Name: 将类似蛋白的蛋白质定向组装到定义的超分子结构和体外货物封装中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学习利用两亲性弹性蛋白样蛋白质组装超分子结构的方法，包括囊泡、纤维和凝聚体等可调控形态，并实现化学多样性荧光货物的有效封装，为药物递送和合成最小细胞设计提供多功能平台。

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作者感谢德国联邦教育与研究部（BMBF）提供的资金支持，以及弗莱堡阿尔伯特-路德维希大学生物系统分析中心（ZBSA）提供的研究设施。我们感谢美国加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所（TSRI）的 P. G. Schultz 提供质粒 pEVOL-pAzF。我们还感谢弗莱堡阿尔伯特-路德维希大学生物系统分析中心（ZBSA）生命成像中心（LIC）的工作人员在共聚焦显微镜资源使用方面提供的帮助，以及在图像采集过程中给予的出色技术支持。

1. 两亲性弹性蛋白样蛋白（ELPs）的设计与克隆
<ol>
	<li>克隆并设计载体，具体方法参见其他文献8,20。质粒可应要求提供。</li>
</ol>
2. 蛋白质表达、纯化与制备
<ol>
	<li>F20E20-mEGFP 和 F20E20-mCherry 的表达
	<ol>
		<li>从过夜预培养物中接种主表达培养物至 OD600 37 °C、200 rpm 条件下，在含有适当抗生素的无菌400 mL LB培养基中于2 L摇瓶中培养。</li>
		<li>在超纯水中配制IPTG储存液（1 M），用于诱导表达培养物。</li>
		<li>当OD600 当OD值达到0.5–0.8时，向表达培养物中加入IPTG至终浓度1 mM，并将培养温度降至20 °C。在200 rpm条件下于20 °C继续诱导表达约20 h。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表达含非天然氨基酸 pAzF 的两亲性 ELP
	<ol>
		<li>从过夜培养物中接种主表达培养液 E. coli 含有两个质粒 pEVOL pAzF 和例如 pET28-NMBL-(TAG)R40F20-his 的预培养物&#160;至 OD600 0.3（氨基酸序列见补充信息）。在2 L锥形瓶中，加入卡那霉素和氯霉素的400 mL无菌LB培养基，37 °C、200 rpm条件下培养。</li>
		<li>配制100 mM pAzF储备液：称取206.2 mg pAzF，溶于8 mL超纯水中，配制成10 mL溶液。为促进pAzF溶解，使用3 M NaOH调节溶液pH值，并剧烈混匀。待pAzF完全溶解后，小心调节pH至10.5，再用超纯水定容至10 mL。经无菌滤器（0.22 µm）过滤后，分装至2 mL反应管中。</li>
		<li>用超纯水配制1 M IPTG储存液和20%阿拉伯糖储存液。</li>
		<li>当OD600 当OD值达到0.5–0.8时，向表达培养物中加入pAzF，终浓度为2 mM。37 °C、200 rpm条件下孵育培养物10分钟，以促进pAzF的吸收。</li>
		<li>通过同时加入IPTG（1 mM）和阿拉伯糖（2%）诱导目标蛋白以及所需tRNA/氨酰-tRNA合成酶的表达，并将培养温度降至20 °C。</li>
		<li>在 20 °C、200 rpm 条件下培养约 20 小时以诱导表达。于 4 °C 下以 4000 x g 离心收集表达菌液。 g，40 分钟</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解与蛋白质纯化
	<ol>
		<li>重悬 E. coli 沉淀用裂解缓冲液重悬（每升培养物使用10 mL；50&#160;mM Tris-HCl pH&#160;8, 500&#160;毫摩尔 NaCl，4&#160;M 尿素，0.25% Triton X-100）中，含溶菌酶（0.1 mg/mL）和 PMSF（0.1 mM）。冰上孵育 30 分钟，随后将样品浸入液氮中，反复冻融两次。</li>
		<li>将悬浮液进行超声处理（30%，15&#160;次，30&#160;s:&#160;10 秒中断）并通过离心澄清裂解液（4 °C，10,000&#160;x g 40&#160;分钟</li>
		<li>使用亲和层析法纯化蛋白质（例如在1&#160;使用连接至组分收集器的FPLC系统，经mL镍柱纯化；参见 材料清单用洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M 尿素, 250–500 mM 咪唑）洗脱蛋白质，并于4 °C保存，待后续处理。</li>
		<li>通过SDS-PAGE分析纯化效率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过SPAAC对ELP进行染料修饰
<ol>
	<li>粗略估计ELP溶液的浓度。 &#160;A280 由于pAzF-R40F20序列的存在，通过吸收法评估浓度并无价值&#160;缺乏在紫外范围内有吸收的氨基酸。因此，可将先前冻干并称重的ELP两亲性分子作为SDS-PAGE条带比较的参照。通过比较已知浓度ELP溶液与待测样品在SDS-PAGE条带中的总灰度值强度，可估算待测样品的大致浓度。</li>
	<li>向500 µL的ELP溶液（约20 µM）中加入1 µL荧光染料BDP-FL-PEG4-DBCO（10 mM储备液，终浓度20 µM）。在15 °C条件下避光振荡孵育反应约10 h。</li>
	<li>为进一步使用，透析反应液以去除过量的BDP。
	<ol>
		<li>将透析膜（例如，截留分子量 12 kDa）在超纯水中平衡 10 分钟。将透析膜裁剪至合适尺寸，覆盖在装有点击反应后 ELP 溶液的反应管开口上方。为固定透析膜，将一个中心已打孔的反应管盖置于开口处，从而封闭反应管。</li>
		<li>将反应管倒置放入选定的缓冲液中。每次透析至少3小时后，更换缓冲液（2–5 L）两次。去除透析膜与缓冲液之间滞留的气泡，以确保透析成功。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. THF 膨胀处理方案
<ol>
	<li>将均一的ELP溶液在pH 7.5、10 mM的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液中透析，以去除His标签纯化过程中残留的盐类和其他化合物。</li>
	<li>准备冻干机并冷却至冻干起始温度。</li>
	<li>将透析后的蛋白溶液分装至1.5 mL离心管中（每管50–500 µL），并在液氮中快速冷冻。为避免冻干过程中不同蛋白溶液发生意外混合，可在离心管盖上打一小孔后盖上，以实现部分密封。</li>
	<li>将冷冻后的蛋白样品从液氮中取出，立即放入冻干机中开始冻干。当样品完全干燥后（约需24–48小时）冻干过程结束。随后用干燥N2对冻干的两亲性ELP进行吹气处理，然后立即盖紧离心管盖，避免接触空气中的水分。</li>
	<li>向冻干样品中加入纯THF（ELP浓度为5–10 µM），并将溶液置于含冰水的水浴超声仪中超声15分钟，使ELP在THF中充分溶胀。</li>
	<li>预热PCR仪至30–60 °C用于囊泡形成，或加热至最高90 °C用于纤维形成，并准备新的反应管，其中加入超纯水或缓冲液（50&#160;mM NaH2PO4/Na2HPO4，50 mM NaCl，pH 5–13）。球形凝聚体主要在20 °C、pH 9–13条件下形成；囊泡在50–60 °C、pH 7–9条件下更易形成；纤维则主要在高于60 °C、pH 5–12条件下诱导形成。</li>
	<li>超声处理后，将ELP/THF溶液以及预先准备好的超纯水或缓冲液一同放入预热的PCR仪中，加热至目标温度并维持5分钟。达到设定温度后，应小心地将预热的ELP/THF溶液分层加至预热的超纯水或缓冲液上方。两相之间应出现清晰的分层界面。</li>
	<li>再次将混合体系放入PCR仪中，于设定温度孵育20分钟，以促进在界面处形成囊泡或纤维。孵育结束后，让样品在室温下冷却10分钟，随后进行荧光显微镜观察或透析分析。</li>
	<li>将含有超分子结构的溶液在超纯水或缓冲液（50 mM NaH2PO4/Na2HPO4，50 mM NaCl，pH 7–10）中进行透析。</li>
</ol>
5. 丁醇萃取方案
<ol>
	<li>在超纯水或缓冲液（50 mM PB pH 7.5，100 mM NaCl，可含最多4 M尿素）中配制1–50 µM的ELP溶液。两亲性ELP F20R20-mEGFP和F20R20-mCherry溶液的浓度可通过摩尔消光系数确定（F20R20-mEGFP A280&#160;= 22015 M-1 cm-1 ，F20R20-mCherry A280 = 34380 M-1 cm-1）（氨基酸序列见补充信息）。</li>
	<li>加入10%–20%（v/v）1-丁醇，并立即通过反复吹打或多次用注射器抽吸的方式充分混匀。可使用常见的100 µL移液器或配有0.25 × 25 mm针头的Hamilton注射器。混合过程中溶液浊度应逐渐升高，表明囊泡正在形成。也可使用5%–15%（v/v）1-辛醇替代1-丁醇进行囊泡挤出。</li>
	<li>为获得较窄的粒径分布，使用微型挤出器在室温下通过孔径为1 µm的膜对囊泡进行挤出。挤出所用膜的孔径决定了囊泡粒径的上限。</li>
	<li>按上述方法（步骤3.3）对囊泡进行透析，以去除残留的1-丁醇。</li>
</ol>
6. 采用正丁醇挤出法进行染料包封
<ol>
	<li>将约 40 µL ELP 溶液（溶于 10 mM Tris-HCl，pH 8）与 1 µL Dextran Texas Red（终浓度为 0.0025 mg/mL）混合。</li>
	<li>向溶液中加入 10 µL 正丁醇（BuOH），并使用装有 0.25 × 25 mm 针头的注射器反复推注 5–10 次。</li>
</ol>
7. 使用荧光显微镜分析超分子结构
<ol>
	<li>将加强环放置在玻璃载玻片上，并将其粘性面牢固地压在玻璃上。</li>
	<li>向加强环内部加入 5 µL 样品，然后盖上盖玻片。</li>
	<li>用指甲油在盖玻片边缘密封样品，以防止分析过程中样品蒸发。</li>
	<li>按照先前所述方法进行荧光显微镜观察8。</li>
</ol>

<ol><li>Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-based+nanocarriers+as+promising+drug+and+gene+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems.</a> Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).</li>
<li>Jang, Y., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Materials+Made+from+Functional+Recombinant+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).</li>
<li>Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+nanoreactors+based+on+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).</li>
<li>Dreher, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+Triggered+Self-Assembly+of+Polypeptides+into+Multivalent+Spherical+Micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).</li>
<li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li>
<li>Matsuurua, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+self-assembled+proteins+and+peptides+for+nano-+and+micro-sized+architectures%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures.</a> RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).</li>
<li>Rocklin, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+folding+using+massively+parallel+design%2C+synthesis%2C+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing.</a> Science. 357 (6347), 168-175 (2017).</li>
<li>Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembly+Toolbox+of+Tailored+Supramolecular+Architectures+Based+on+an+Amphiphilic+Protein+Library%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library.</a> Small. 15 (30), 1900163(2019).</li>
<li>Jang, Y., Hsieh, M. -C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Coacervate-to-Vesicle+Transition+of+Globular+Fusion+Proteins+to+Engineer+Protein+Vesicle+Size+and+Membrane+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity.</a> Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).</li>
<li>Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+micelles+assembled+from+variants+of+recombinant+oleosin%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin.</a> Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).</li>
<li>Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-responsive+polypeptide+vesicles+by+conformation-specific+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly.</a> Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).</li>
<li>Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-Triggered+Self-Assembly+of+Elastin-Like+Block+Co-Recombinamers%3AThe+Controlled+Formation+of+Micelles+and+Vesicles+in+an+Aqueous+Medium%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium.</a> Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).</li>
<li>Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrafibrillar+Mineralization+of+Self-Assembled+Elastin-Like+Recombinamer+Fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).</li>
<li>Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+tunable+protein+suprastructures+from+recombinant+oleosin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).</li>
<li>Park, W. M., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally+Triggered+Self-Assembly+of+Folded+Proteins+into+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).</li>
<li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862(2018).</li>
<li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vesiculo+Synthesis+of+Peptide+Membrane+Precursors+for+Autonomous+Vesicle+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59831(2019).</li>
<li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).</li>
<li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin%3A+a+representative+ideal+protein+elastomer%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li>
<li>Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+a+combinatorial+DNA-toolbox+platform+constituting+defined+protein-based+biohybrid-materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials.</a> Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).</li>
<li>Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prebiotic+Protocell+Model+Based+on+Dynamic+Protein+Membranes+Accommodating+Anabolic+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions.</a> Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).</li>
<li>Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+p-Azido-l-phenylalanine+to+the+Genetic+Code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li>
<li>Sonnino, S., Prinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+domains+and+the+%22lipid+raft%22+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane domains and the "lipid raft" concept.</a> Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).</li>
<li>Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organische+Azide+-+explodierende+Vielfalt+bei+einer+einzigartigen+Substanzklasse%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse.</a> Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Structures+in+Tetrahydrofuran%E2%80%93Water+Mixture+with+a+Trace+Amount+of+Antioxidant+Butylhydroxytoluene+%28BHT%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT).</a> The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).</li>
<li>Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimalist+Protocell+Design%3A+A+Molecular+System+Based+Solely+on+Proteins+that+Form+Dynamic+Vesicular+Membranes+Embedding+Enzymatic+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions.</a> ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).</li>
<li>Raghunathan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+the+stability+and+structure+of+two+different+green+fluorescent+proteins+in+organic+co-solvent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioprocess+Engineering%22%5BJournal%5D)">A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).</li>
<li>Sallach, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+biostability+of+self-assembling+protein+polymers+in+the+absence+of+covalent+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking.</a> Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).</li>
</ol>

作者声明无竞争性财务利益。

遵循所述方案时出现故障&#160;特定超分子结构的组装主要导致非特异性聚集体的形成（图2，IV）或均匀分布的ELP-两亲性分子。本方案的关键步骤将在下文讨论：
为了获得较高的两亲性ELP表达量，20°C的相对较低温度最为适宜。为成功进行基于亲和力的两亲性ELP纯化，在裂解缓冲液中使用4 M尿素浓度被证明最有利于溶解两亲性ELP，并提高可溶性洗脱组分中的蛋白产量。如果希望使用较低尿素浓度的裂解缓冲液，则必须针对各个构建体测试其亲和纯化效果。对于某些构建体，2 M尿素同样有效，特别是当His标签连接在亲水结构域时，仍能与树脂结合。&#160;在His标签亲和纯化之后，再通过尺寸排阻色谱进行额外的纯化步骤，也可提高囊泡产量。
若采用THF溶胀法，需用荧光有机染料对两亲性ELP进行标记以便观察。在通过SPAAC反应对两亲性ELP进行BDP标记时（氨基酸序列含非天然氨基酸pAzF，请参见补充信息），所有纯化缓冲液中均不得含有任何还原剂，如TCEP、DTT或β-巯基乙醇。这是为了...

用于生物技术应用的超分子结构组装正变得越来越重要1,2,3,4,5。为了组装具有理想理化性质的功能性结构（如凝聚体、囊泡和纤维），理解并控制组分的理化性质和构象特性至关重要。由于天然分子具有分子级别的精确性，超分子结构的构建单元正越来越多地基于脂质、核酸或蛋白质。与合成聚合物相比，蛋白质类构建单元能够在遗传水平上精确调控所形成的超分子结构6。单个蛋白质构建单元的一级氨基酸（aa）序列本身就编码了从分子水平到宏观水平的自组装潜力，以及最终超分子结构的三维形态和物理特性7。
已有报道的多种超分子结构组装方法通常涉及两亲性蛋白质，例如温度敏感型弹性蛋白样蛋白（ELP）5,8,9、重组油质蛋白（oleosin）10以及人工设计的蛋白两亲分子11。基于温度触发的方法已成功实现胶束4,10,12、纤维13、片层14和囊泡9,15,16的组装。利用有机溶剂的方法已被用于构建动态蛋白基囊泡8,11,14。迄今为止，已报道的囊泡形成方案往往缺乏对微米级组装体的精确调控16,17，或组装产率较低5。此外，部分基于ELP构建的囊泡存在包封能力不足12或长期稳定性差的问题9。针对上述局限性，本文所展示的实验方案能够实现具有明确理化特性、良好包封能力及长期稳定性的微米级和亚微米级超分子结构的自组装。通过设计的两亲性ELP可形成多种超分子结构，其形态范围涵盖球形共凝聚体、高度有序的扭曲纤维束，直至单层囊泡，具体结构取决于所采用的实验方案及相应的环境条件。大型囊泡状蛋白膜基区室（PMBC）表现出脂质体类似的主要表型特征，如膜融合和相分离行为。PMBC能够高效包封化学性质多样的荧光货物分子，并可通过简单的落射荧光显微镜进行监测。本研究中使用的重复ELP结构域是构建蛋白基超分子结构的理想模块18。ELP的五肽重复单元（VPGVG）在第四个位置（缬氨酸，V）除脯氨酸外可耐受多种氨基酸（aa），同时保持其结构与功能特性19。通过在VPGXG重复序列中引入具有不同疏水性、极性和电荷特性的氨基酸残基（X），实现了含有明确亲水与疏水结构域的两亲性ELP的设计20。两亲性ELP的疏水结构域引入了苯丙氨酸（F）或异亮氨酸（I）作为客体残基，而亲水结构域则包含带电荷的谷氨酸（E）或精氨酸（R）作为客体残基。符合条件的两亲性ELP构建体及其对应的氨基酸序列列表详见补充信息及相关参考文献8,21。所有构建模块均被标记上小分子荧光染料或荧光蛋白，以便通过荧光显微镜进行可视化观察。mEGFP及其他荧光蛋白被融合至ELP两亲分子的亲水结构域N端。有机染料则通过无铜应变促进的炔-叠氮环加成反应（SPAAC），连接至共翻译引入的非天然氨基酸（UAA）。共翻译引入的UAA 对-叠氮苯丙氨酸（pAzF）22，使得亲水性ELP结构域的N端修饰成为可能。借此，绿色荧光染料BDP-FL-PEG4-DBCO（BDP）或任何带有张力环辛炔的小分子荧光探针均可用于标记。通过LC-MS/MS可轻松验证UAA pAzF的成功掺入以及染料经SPAAC反应的环加成效果，原因在于相应的胰蛋白酶消化肽段具有高效的离子化能力8。该小分子有机染料的应用扩展了组装方案中溶剂的选择范围，因为荧光蛋白与大多数有机溶剂不相容。本实验室开发的两种最高效的超分子结构组装方案如下所述。四氢呋喃（THF）溶胀法仅适用于经有机染料修饰的两亲性ELP。相比之下，1-丁醇（BuOH）挤出法可兼容多种作为荧光探针的蛋白质（如mEGFP），因为该方法能完全保留这些融合蛋白的荧光特性。此外，小分子包封及囊泡融合行为在采用BuOH挤出法时表现最佳。

<table><tbody><tr><td>1 &amp;micro;m 和 0.2 &amp;micro;m 滤菌滤膜</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,4-二硫苏糖醇</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-丁醇，&gt;99.5% 分析纯</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2log DNA 标准分子量标记</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon 离心管</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>79249 炔烃 Mega Stokes 染料</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙腈，无水，99.8%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐，99%</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BDP-FL-PEG4-DBCO</td><td>Jena Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biofuge 离心机</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带 PES 膜的瓶顶滤器（45 &amp;micro;m，22 &amp;micro;m）</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>亮蓝 G250（考马斯亮蓝）</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BspQI</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS Qi1 相机</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5417r 离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5810r 离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CF-400-Cu 方形铜网铜载栅</td><td>EMS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CompactStar CS 4</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖-德克萨斯红，3000 MW，中性</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数字超声破碎仪</td><td>Branson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Applichem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Applichem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EarI</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>环境振荡培养箱 ES-20</td><td>Biosan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭溶液</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滤膜支撑板</td><td>Avanti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃板</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘油，蛋白质组学级</td><td>Amresco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Applichem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H4-叠氮苯丙氨酸-OH</td><td>Bachem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MR HeiTec 加热板</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HisTrap FF 粗提柱</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td>镍柱</td></tr><tr><td>盐酸，发烟，37%，分析纯</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ix 20 照明器</td><td>INTAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS-4000 照明器</td><td>Fujifilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜用浸油</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unimax 1010 摇床培养箱</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator 1000</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG，&gt;99%</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素硫酸盐</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L(+)-阿拉伯糖</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室天平 Extend ed2202s/224s-OCE</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥仪 Alpha 2-4 LSC</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶，20000 U/mg</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM 100 透射电子显微镜</td><td>Philips</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TS 100 倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片（15 x 15 mm）</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Studio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-Extruder 挤出装置</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl，&gt;99.5%，分析纯</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠颗粒</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖，PerfectPro</td><td>5 Prime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleopore 径迹蚀刻膜</td><td>Avanti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH 计 766 calimatic</td><td>Knick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯柱（1 mL）</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerPac basic 电泳仪</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Emplura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白质标准分子量标记 10-250 kDa</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>循环冷却器 F12</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加强环</td><td>Herma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SacI HF</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS 片剂</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠二水合物，NaH2PO4</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 mm 醋酸纤维素无菌注射式滤器</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>德克萨斯红-葡聚糖偶联物</td><td>MolecularProbes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomix comfort 恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>四氢呋喃，&gt;99.5% 分析纯</td><td>Acros</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酪蛋白胨/蛋白胨</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声清洗机</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尿素，分析纯</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空泵 2.5</td><td>Vacuubrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZelluTrans 再生纤维素管状透析膜（12.0 S / 3.5 S / 1.0 V）</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

弹性蛋白样蛋白的定向组装形成特定超分子结构及体外货物包封

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

定制的蛋白质结构单元是组装超分子结构（如最小细胞、药物递送载体和酶支架）的多功能候选材料。由于弹性蛋白样蛋白（Elastin-like proteins, ELP）具有良好的生物相容性以及可在遗传水平上进行调控的特性，因此是生物技术和生物医学应用的理想构建单元。然而，组装具有明确理化性质和良好包封能力的蛋白质基超分子结构仍然具有挑战性。
本文提供了两种高效的引导式自组装方案，可将两亲性弹性蛋白样多肽（ELP）组装成超分子蛋白质结构，例如球形共聚物、纤维和稳定的囊泡。所介绍的组装方案可生成基于ELP的蛋白质膜包封结构（PMBCs），其具有可调节的理化特性。PMBCs表现出相分离行为，并展现出依赖于方法的膜融合特性，能够包载化学性质多样的荧光分子。所获得的PMBCs在药物制剂与递送平台、人工细胞以及区室化反应空间等方面具有广阔的应用前景。

囊泡制备方案的开发 
图1概述了两种不同的囊泡制备方法。左侧的四氢呋喃（THF）溶胀法包含三个连续步骤，根据温度的不同可形成不同类型的ELP超分子组装体。在图1A中，落射荧光显微镜图像显示了由BDP-R20F20组装形成的囊泡以及由BDP-R40F20组装形成的纤维状结构。右侧所示的正丁醇（BuOH）法则仅导致ELP囊泡的形成，其囊泡产量比THF溶胀法高出约两个数量级。示意图展示了BuOH囊泡的制备过程。在图1B的囊泡制备中，将BDP-R40F20与10–15%（v/v）BuOH混合，并通过挤出该混合物来制备囊泡。
引导超分子自组装形成不同结构 
图2展示了通过THF溶胀法由BDP-R40F20组装而成的不同超...

在有机相与水相溶剂的界面处，经设计的两亲性弹性蛋白样蛋白会响应环境参数，自组装形成囊泡、纤维和凝聚体等复杂的超分子结构。所述组装方案可制备具有可调控特性的蛋白膜基区室（PMBCs），实现多种货物分子的包封。

定制的蛋白质构件是组装超分子结构（如最小细胞、药物递送系统等）的多功能候选材料。

用于最小细胞设计和药物递送的超分子结构的高效组装仍然具有挑战性。本文中，我们展示了可高效生成基于两亲性弹性蛋白样蛋白的超分子结构的实验方案。所介绍的组装方法能够产生多种具有可调物理化学性质的超分子结构，例如囊泡、纤维和凝聚体。基于蛋白质膜的区室表现出相分离行为，并能够包封化学性质多样的荧光货物分子。为表达 F20E20-mEGFP 和 F20E20-mCherry，将过夜预培养物接种至主表达培养物中，使 OD600 达到 0.3。在 400 毫升无菌 LB 培养基中，于 37 摄氏度、200 rpm 条件下培养，培养基中需添加适当的抗生素。当表达培养物的OD600达到0.5至0.8时，加入IPTG至终浓度为1毫摩尔，并将培养温度降至20摄氏度。为了表达含有非天然氨基酸的两亲性ELP，从含有适当质粒的过夜大肠杆菌预培养物中接种主表达培养物至OD值为0.3。在400毫升添加了卡那霉素和氯霉素的无菌LB培养基中，于37摄氏度、200转/分钟条件下培养。配制100毫摩尔非天然氨基酸储备液时，将206.2毫克非天然氨基酸加入8毫升超纯水中。用3摩尔氢氧化钠调节溶液pH值，并剧烈搅拌。待非天然氨基酸完全溶解后，将pH调至约10.5，再用超纯水定容至10毫升。使用无菌的0.22微米滤器过滤溶液，并分装至2毫升离心管中。当表达培养物的OD600达到0.5至0.8时，加入非天然氨基酸至终浓度为2毫摩尔。继续孵育10分钟。随后通过同时加入IPTG和阿拉伯糖诱导目标蛋白及所需的tRNA合成酶的表达。将培养温度降至20摄氏度，继续表达约20小时。培养结束后，在4摄氏度、4,000 × g条件下离心40分钟，收集细胞。将细胞沉淀重悬于含有溶菌酶和PMSF的裂解缓冲液中。冰上孵育30分钟。随后通过浸入液氮中进行两次冻融循环。将悬浮液进行超声处理，然后在4 °C、10,000 × g条件下离心40分钟，以澄清裂解液。随后使用亲和层析纯化蛋白质。蛋白质洗脱后，于4 °C保存，以备后续使用。向500微升ELP溶液中加入一微升荧光染料，在15摄氏度下于ThermoMixer中振荡孵育约10小时，并注意避光。为去除过量的荧光染料，将透析膜在超纯水中平衡10分钟。将膜裁剪至合适尺寸，覆盖在含有点击反应后ELP溶液的反应管开口上。然后用无芯盖子封闭管子，将膜固定在开口处。在盖子与膜之间填充缓冲液，以防止气泡滞留。接着将反应管放入选定的缓冲液中，将其推至液面以下，并倒置。在 4 摄氏度下透析至少三小时，每次更换缓冲液后继续透析至少三小时。对于 THF 膨胀，将均匀的 ELP 溶液对 pH 7.5 稳定的磷酸盐缓冲液或 Tris 缓冲液进行透析。准备冻干机，并将其冷却至冻干起始温度。将透析后的蛋白质溶液分装至1.5毫升离心管中，并用带有小孔的管盖密封，以防止冻干过程中因压力变化导致样品损失。用液氮迅速冷冻样品。从液氮中取出冷冻的蛋白质样品后，立即放入冷冻干燥仪中开始冻干。样品完全干燥后，用干燥氮气吹扫，并立即盖紧反应管管盖，避免接触空气中的水分。向冻干样品中加入纯四氢呋喃（THF），将溶液置于含冰水的水浴超声仪中处理15分钟。预热PCR仪至30至60摄氏度用于囊泡形成，或升至最高90摄氏度用于纤维形成，并准备新的反应管，加入超纯水或缓冲液。超声处理后，将ELP/THF溶液和已准备好的水或缓冲液放入PCR仪中孵育5分钟。然后将ELP溶液分层加至水或缓冲液上方，确保两相分离且界面清晰可见，并将混合物重新放回PCR仪中。让样品在室温下冷却10分钟，随后进行针对水或缓冲液的透析，或进行荧光显微镜观察。配制浓度为1至50微摩尔的ELP溶液，并加入10%至20%的1-丁醇。立即通过上下吹打混匀溶液。在混匀过程中，溶液的浊度应逐渐增加，表明囊泡正在形成。为了获得较窄的粒径分布，使用微型挤出器将囊泡通过孔径为1微米的膜进行挤出。对于染料包封，将约40微升ELP溶液（溶于10毫摩尔/升Tris-HCl缓冲液）与1微升Dextran Texas Red储备液（溶于DMSO）混合，加入10微升1-丁醇，并通过装有0.25×25毫米针头的注射器反复挤出5至10次。THF溶胀法包含三个连续步骤，根据温度的不同，会导致ELP形成不同的超分子组装体。共聚焦荧光显微镜图像显示，由BDP-R20F20组装形成的囊泡以及由BDP-R40F20组装形成的纤维状结构。1-丁醇挤出法则仅导致ELP囊泡的形成。与THF溶胀法相比，产生的囊泡数量大约高出两个数量级。将BDP-R40F20与10%至15%的丁醇混合，通过挤出该混合物制备囊泡。通过THF溶胀法，由BDP-R40F20组装形成了不同的超分子结构。通过调节缓冲液的 pH 值和组装过程的温度，可形成凝聚体、纤维或囊泡。组装方案中的微小失误可能导致聚集体的形成。带正电荷的染料 ATTO Rho 13 和多糖德克斯特红 3000 通过 1-丁醇挤出法被封装到由 F20R20-mEGFP 组装而成的囊泡腔内。共聚焦显微镜图像显示，囊泡在绿色通道中，货物分子在红色通道中，成功包封则体现在合并后的通道中。同时展示了ELP两亲性分子在单个PMBC结构单元混合与组装后PMBC群体混合时的相分离和融合行为。在PMBC组装前进行混合，会导致分子在组装后的PMBC膜中均匀分布；而将已组装的囊泡群体混合，则会形成可见的红色或绿色荧光膜区域，这些区域至少可维持20分钟。在进行该实验操作时，需注意正确的步骤顺序，以及THF溶胀法与丁醇挤出法之间的差异。按照本方案制备的ELP囊泡可作为药物递送载体，用于酶促反应平台（如体外转录与翻译），或用于合成最小人工细胞的构建。

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将类似蛋白的蛋白质定向组装到定义的超分子结构和体外货物封装中

本文描述了通过自组装这一自发过程形成高度有序的肽基结构的方法。该方法利用 commercially available peptides...

短肽自组装形成有序生物分子结构

介绍了一种从单一或多种细胞外基质蛋白中获取纳米纤维及复杂纳米结构的方法。该方法利用蛋白质-表面相互作用，制备具有可调组成和结构的自支撑蛋白材料，可用于多种组织工程和生物技术应用。...

利用表面引发组装技术构建的细胞外基质蛋白纳米纤维与纳米结构

类弹性蛋白多肽是一类对刺激响应的生物聚合物，其应用范围从重组蛋白纯化到药物递送。本方案描述了利用类弹性蛋白多肽及其肽段或蛋白融合物在大肠杆菌（Escherichia...

非色谱法纯化重组弹性蛋白样多肽及其与肽和蛋白质的融合产物，源自大肠杆菌（Escherichia coli）

重组技术使材料设计者能够创建具有定制功能的新型人工蛋白质，用于组织工程应用。例如，可设计人工细胞外基质蛋白，使其包含来源于天然细胞外基质的结构域和生物功能域。本文介绍了含有弹性蛋白样重复序列的人工细胞外基质蛋白的构建与纯化方法。...

人工细胞外基质（aECM）蛋白的设计与构建 大肠杆菌 用于皮肤组织工程

早期核内体的功能依赖于F-actin的聚合。本文介绍一种基于显微镜的 体外...

体外 早期早期内体上F-肌动蛋白的聚合

重组蛋白工程水凝胶因其可完全调控聚合物主链，从而调控细胞微环境，故在三维细胞培养中具有显著优势。本文描述了重组弹性蛋白样蛋白的纯化过程及其在三维水凝胶细胞包封中的应用。...

用于细胞三维包封与免疫染色的弹性蛋白样蛋白水凝胶的制备

本文介绍了能够生长的基于多肽的小单层囊泡的制备方案。为促进 在体外...

在囊泡内合成肽类膜前体以实现囊泡自主生长

本文介绍了一种利用酶促反应将蛋白质单体连接成具有可控序列的蛋白质聚合物，并将其固定在表面用于单分子力谱研究的实验方案。...

OaAEP1介导的聚合蛋白酶法合成及其在单分子力谱学中的固定

本文介绍了一种快速制备包封细胞骨架蛋白的巨型单层囊泡的简单方法。该方法适用于在受限环境中从头重建细胞骨架结构以及研究细胞骨架与膜之间的相互作用。...

快速将重建的细胞骨架封装到巨大单层囊泡内

在本文中，我们展示了将F-肌动蛋白细胞骨架包封进巨大单层脂质囊泡（也称为脂质体）的实验技术，以及在脂质体膜内小叶形成模拟细胞皮层的F-肌动蛋白层的方法。...

体外 在巨大单层囊泡内重建肌动蛋白细胞骨架

本方案描述了一种快速、可重复的基于有机溶剂的提取与沉淀方法，用于从大肠杆菌（Escherichia...

高效利用基于有机溶剂的提取与沉淀法从大肠杆菌（E. coli）中纯化弹性蛋白样多肽（ELPs）

学习利用两亲性弹性蛋白样蛋白质组装超分子结构的方法，包括囊泡、纤维和凝聚体等可调控形态，并实现化学多样性荧光货物的有效封装，为药物递送和合成最小细胞设计提供多功能平台。

弹性蛋白样蛋白的定向组装形成特定超分子结构及体外货物包封

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