激光捕获显微切割胶质瘤亚区域用于肿瘤内异质性、肿瘤微流及侵袭的空间与分子特征分析

本方案采用激光显微切割结合RNA测序技术，分析肿瘤内异质性区域（如间充质细胞富集区域或肿瘤侵袭区域）的差异性mRNA表达。该方法经过优化，可有效保持组织形态学质量和RNA完整性，有助于获取高质量的激光显微切割样本。该技术具有高灵敏度和高度可重复性。

该技术可用于研究多种肿瘤模型中的肿瘤形态学及异质性。对冷冻脑肿瘤组织进行激光显微切割是一种经济、可靠的分离肿瘤组织中特定解剖区域细胞群的方法，可用于分析其分子特征。激光显微切割可用于深入探究肿瘤进展过程中发生的分子事件的机制，并可能揭示新的治疗靶点。

小鼠体内肿瘤负荷的活体生物发光信号达到每秒1×10⁶至1×10⁷个光子。将经安乐死的荷瘤小鼠的循环系统用含氧台氏液冲洗，直至肝脏和肺部血液完全清除。随后继续用含30%蔗糖的台氏液灌注动物15分钟。

为评估灌注效果，需确认在循环结束时颈部、尾部和腿部均已变得僵硬。随后按照标准方案取出脑组织，并将脑组织在新鲜的30%蔗糖溶液中保存过夜。为进行冷冻保存，取一个容器装入低温的异戊烷（2-甲基丁烷），并将该容器置于盛有液氮的更大容器中。

在溶剂冷却的同时，将脑组织放在滤纸上吸干，然后将脑组织放入已标记的冷冻模具中。小心地将约五毫升的低温恒冷箱切片包埋剂（optimal temperature cutting medium）加至冷冻模具中央，并将脑组织按所需方向放入模具中。使用洁净的镊子，迅速将冷冻模具放入预冷的异戊烷（2-甲基丁烷）中，浸泡 30 至 40 秒。

待切割介质凝固后，将 Cryomold 转移至干冰上，并用铝箔包裹 Cryomold 及速冻脑组织，于 -80 摄氏度保存。为获取冷冻脑肿瘤组织切片，首先将冷冻切片机的温度设定在 -20 至 -24 摄氏度之间，并将样品块放入冷冻切片机腔室中平衡 30 至 60 分钟。在样品平衡期间，使用 100% 乙醇清洁腔室和刀片架，并用 RNase 去除溶液喷洒切片刷。

当样本准备就绪后，取出模具，并使用新鲜的切片介质将冷冻组织块固定在冷冻切片机的样品盘上。将组织块放入样品盘固定槽中，并与刀片对齐。使用无RNase的毛刷之一，小心地将脑组织展平并卷直在切削面上，切取厚度为10 µm的切片。

为将脑组织切片贴附到载玻片上，将标记好的无RNase PEN玻璃载玻片的带正电一侧平稳地压在组织切片上，并将载玻片放入腔室内的储存盒中。当所有载玻片收集完毕后，将储存盒置于-80摄氏度环境中。在进行激光显微切割前，为溶解切片包埋介质，需将载玻片依次浸入梯度下降的乙醇溶液中各30秒，随后用结晶紫溶液染色20秒，再浸入0.5%伊红Y溶液中5秒。

在伊红Y孵育结束时，使用滤纸将载玻片吸干，并依次通过浓度递增的乙醇溶液进行脱水。在60秒的乙醇浸洗后，将载玻片放入二甲苯容器中冲洗3分钟。随后，将载玻片置于无RNase的表面上，室温干燥10秒，然后使用以无RNase水配制的封片剂进行封片。

10 到 20 秒后，将载玻片转移至显微镜显微切割平台。进行激光捕获显微切割时，应先开启电源，再开启激光。接着，打开计算机中的显微镜控制器，并启动激光捕获显微切割软件。

在显微镜控制面板中，选择 10 倍放大倍数。在激光控制下，设置组织切割的激光参数，选择激光频率为 120 赫兹，激光电流为 100%。为实现精确的激光显微切割，将速度设为 10，孔径设为 10 微米，然后将功率设为 53。

加载组织收集器，用于在切片后捕获组织，然后点击第二个“卸载”按钮。将空收集器替换为无DNase和Rnase的0.5毫升PCR平头管，每管中含30微升裂解缓冲液。将收集器放回仪器中，然后点击“继续”以进行下一步操作。

将处理好的样本装入显微镜，然后在激光显微切割软件中点击“Unload”。将样本向上推至载物片支架上，并将支架放置于载物台上。点击“Continue”继续操作，在“Cut Shapes”窗口中选择“Draw Cut”。

使用显微镜控制装置找到目标区域，并在感兴趣区域周围绘制轮廓。然后选择目标收集管，点击“开始切割”以进行组织显微切割。当所有感兴趣区域均完成切割后，将收集管从支架转移至干冰中，直至进行后续处理。

为了获得形态学和RNA完整性更佳的组织，评估了多种灌注方法。为了分离感兴趣区域，需要用对RNA无害的染料对组织进行染色。对荷瘤小鼠依次灌注Tyrode溶液和30%蔗糖，随后在30%蔗糖中过夜孵育，可有效保持小鼠组织的形态结构和RNA完整性。

尽管多聚甲醛组织固定可获得高质量的组织形态，但会负面影响RNA的完整性。其他方法如使用台氏液孵育，或台氏液加30%蔗糖溶液孵育，虽不影响RNA质量，但组织形态的分辨率有所降低。若组织未使用封片介质封片，切片会脱水，导致形态恶化；而将组织样本用溶于水的15%封片介质封片，则可维持高质量的组织形态。

激光捕获显微切割显微成像可实现对肿瘤组织的切割选择。该感兴趣区域的选择继而允许对每个组织样本内的特定区域进行分离，以进行RNA完整性分析。保持高质量的肿瘤组织形态和RNA完整性至关重要。

使用Tyrode溶液和30%蔗糖灌注并用30%蔗糖在4℃过夜保存，可显著改善激光显微切割（LMD）所需的组织形态。快速的平滑肌瘤固定、染色及使用GAN溶液封片是保持RNA质量并防止组织产生裂纹的关键步骤。我们建议每块组织区域切取至少2.5倍于10的6次方平方微米的总肿瘤面积，以获得足量的RNA用于RNA质量控制和转录组分析。

LMD 能够分析调控胶质瘤异质性和侵袭性的分子信号通路，这可能揭示在临床前胶质瘤模型中未来转化研究的潜在新靶点。