一种用于小鼠角膜和结膜活体成像的定制多光子显微镜平台
2020年5月17日
本文展示了一种用于活体小鼠眼表成像的多光子显微成像平台。利用荧光转基因小鼠，可实现对眼表内的细胞核、细胞膜、神经纤维及毛细血管的可视化观察。来源于胶原结构的非线性二次谐波生成信号，可实现对基质结构的无标记成像。
本方案采用多滤光片显微镜，对双荧光转基因小鼠模型中完整的小鼠眼表结构进行活体成像。定制的多光子显微成像平台与双荧光转基因小鼠相结合，可实现眼表动态过程与结构的实时可视化。为设置多光子显微镜，需在直立显微镜上选择20倍、数值孔径1.00的水浸物镜，并将钛宝石激光器设为激发光源。
将激光输出波长设置为 EGFP 的 880 纳米和 tdTomato 的 940 纳米。使用两个二向色镜以分离 SHG EGFP 和 EGFP tdTomato 信号，并采用 434-17、510-84 和 585-40 纳米的带通滤光片对 SHG EGFP 和 tdTomato 信号进行光谱分离。在安装眼夹时，先确认麻醉后的 8 至 12 周龄小鼠对足底反射无反应，然后将小鼠置于加热的显微镜载物台上，并插入温度监测探头。
将小鼠放入定制的立体定位仪小鼠固定器中，并将耳杆插入外耳道。使用三点固定法固定头部固定器，并在眼表滴加0.4%盐酸奥布卡因与生理盐水溶液。用PE管套环包裹一把5号杜蒙特镊子的尖端。
三分钟后，进行手动眼睑牵拉，以确认眼球突出，并沿眼睑边缘小心放置PE固定管环，以暴露眼表。然后使用固定器的旋钮配合镊子稳定眼球。接着，用折射率为1.338的眼用凝胶覆盖角膜表面。
对于角膜表面的Z序列成像，使用汞灯光源对目标区域进行成像，并打开显微镜软件。选择适当的光电倍增增益和数字增益，以观察眼表的细胞结构，并设置首层和末层层面，以便获取图像堆栈。将图像分辨率设置为512×512像素，Z步进设为1 µm。
然后，点击“开始”以采集Z轴连续图像，在每个区域分别使用880纳米激发光采集SHG EGFP信号的一个实时图像，以及使用940纳米激发光采集EGFP tdTomato信号的一个实时图像。在整个成像过程中，使用步进电机驱动的载物台旋转眼球，以便对整个角膜表面进行成像。当所有图像采集完成后，将Z轴连续图像导入Fiji软件，并选择“中值3D滤波器”插件。
去除背景噪声后，选择 Fiji 中的“非锐化掩膜”滤波器以增强图像清晰度，并点击“自动亮度对比度”以自动优化图像质量。处理完成后，将图像保存为连续的图像序列，并将该图像序列导出至合适的三维重建软件程序中。在所有多光子显微图像中，在通过快照捕获三维结构图像之前，分别以伪绿色、伪红色和伪青色呈现 EGFP、tdTomato 和 SHG 信号。
双光子显微镜可实现对双荧光转基因小鼠角膜上皮中浅层翼状细胞和基底细胞的可视化观察。基底层的单个细胞可被追踪至浅层，同时也能观察到单个六边形的浅层细胞。通过tdTomato信号的胞质表达显示，在翼状细胞内，富含膜蛋白的细胞内囊泡系统（包括高尔基体和内质网）呈弥散分布。
在胶原基质中，这些小鼠的星形coratesites通过膜靶向的EGFP荧光标记出轮廓。嵌入胶原基质中的coratesites比内皮细胞中的分布更为松散。此外，角膜基质中细小的分支状神经也可通过膜靶向的tdTomato信号观察到，而角膜内皮细胞单层则呈现出相对均一的六边形形态，并以蜂窝状模式相互连接。
角膜缘上皮由一到两层上皮细胞组成。双荧光报告基因转基因品系还可实现结膜内毛细血管的成像，有助于重建勾勒出血管内皮的毛细血管三维结构。在不造成损伤的情况下，以适度压力稳定眼球对于获取高质量图像至关重要，因为压力不足或过大均会影响图像质量。
该NVivo图像成像平台可经改造用于观察眼表下结构，并可应用于多种眼科疾病的原位研究。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本文介绍了一种利用双荧光转基因小鼠模型对小鼠眼表进行活体成像的多光子显微成像平台。该系统可实现对眼表内多种细胞结构的实时可视化观察。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 眼科学
- 显微镜技术
背景
- 多光子显微镜是一种强大的成像技术。
- 荧光转基因小鼠可增强细胞组分的可视化效果。
- 理解眼表结构对于多种研究应用至关重要。
- 无标记成像技术可与荧光方法相互补充。
研究目的
- 建立一种用于小鼠眼表活体成像的方法。
- 利用定制的多光子显微镜实现更清晰的可视化。
- 展示双荧光转基因小鼠在成像中的应用能力。
使用的方法
- 使用特定物镜和激光设置组装多光子显微镜。
- 利用二向色镜和带通滤光片进行信号分离。
- 在加热的显微镜载物台上对麻醉小鼠进行活体成像。
- 实时可视化观察眼表结构。
主要结果
- 成功对细胞核、细胞膜和神经纤维进行成像。
- 利用二次谐波实现对间质结构的无标记成像。
- 展示了多光子平台的有效性。
- 验证了其实时可视化能力。
结论
- 多光子显微成像平台适用于眼部成像。
- 双荧光转基因小鼠可增强眼部结构的可视化效果。
- 该方法可推动眼科学及相关领域的研究进展。
常见问题
行业重要性概述
该多光子显微成像平台可实现对小鼠眼表结构的活体、无标记成像，为眼科药物研发提供角膜和结膜生物学的关键洞察。通过在体可视化细胞动态、基质结构及血管网络，该方法有助于在眼科疾病临床前模型中对治疗靶点进行机制性风险评估。该平台具备在整个眼表范围内进行精确定位成像的能力，从而提升靶点验证和检测方法开发流程中的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在活体眼组织中可视化细胞核、细胞膜、神经纤维和毛细血管，实现对治疗假设的探究。
- 操作价值：通过二次谐波成像实时观察基质结构，并结合双荧光报告系统监测细胞动态，支持功能靶点的验证。
- 预测价值：在与疾病相关的眼部模型中，提供结构和细胞变化的定量、可重复的读数，从而增强项目筛选能力。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过实现对上皮、间质、内皮和血管区室的高分辨率成像，为下游工作流程制备经过验证的生物系统。
- 操作价值：通过精确的Z轴层析采集、二次谐波（SHG）与荧光信号的光谱分离以及眼球位置的稳定固定，提升检测的标准化程度与可重复性。
- 战略价值：通过在角膜和结膜全表面进行成像并最大限度减少光毒性，体现出高通量筛选的准备就绪性以及平台的可重复利用性。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过重建结膜中三维毛细血管结构并可视化角膜缘上皮层，探讨疾病的相关性。
- 操作价值：通过支持在眼表不同区域进行精确定位的活体成像，描述从发现到临床前验证的连续性。
- 预测价值：通过提供无标记的基质成像和细胞图谱，增进对眼病病理机制的理解，从而支持基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
该方法可融入从早期靶点验证到临床前成像的眼科研究发现全过程，支持假设验证及作用机制的风险评估。
- 发现生物学：通过实现对眼表细胞和结构动态的活体成像，说明该方法如何支持假设验证、通路解析以及生物学风险降低。
- 筛选：通过Z轴序列成像、光谱信号分离和稳定的成像条件，描述该方法在检测就绪性、可重复性及定量输出方面的表现。
- 分析：突出可用于比较不同实验条件的测量指标、读出信号或统计输出，包括利用二次谐波生成（SHG）成像胶原结构，以及利用tdTomato/EGFP标记进行膜和细胞核定位分析。
- 转化研究：通过在与疾病相关的模型中实现毛细血管的三维重建和上皮层映射，将该方法与临床前研究的连续性或生物标志物的一致性关联起来。
- 企业级复用：将该方法定位为一种可重复使用的科研能力，而非一次性技术，可适配于多种眼科疾病模型和成像终点。
运营与企业影响
- 科学价值：预测置信度、靶点验证，以及降低眼表生物学机制的模糊性。
- 操作价值：通过定制化眼球固定装置、立体定位成像平台和可控的成像参数，实现标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过早期可视化靶点结合与组织反应，实现更优的决策判断、资本利用效率，并降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：基于角膜和结膜区域的定量、无标记及荧光读数，实现风险校正后的优先排序与推进决策。
实施注意事项
- 需要具备多光子显微镜、眼部解剖学以及转基因模型操作方面的专业知识。
- 所需的仪器与分析基础设施包括钛宝石激光器、二向色镜、带通滤光片、电动载物台以及三维重建软件。
- 跨团队需统一成像方案、信号检测参数和图像处理流程（例如用于降噪和对比度增强的 Fiji 插件）。
- 在不同模型系统间应用时需考虑适应性调整，包括眼睑固定方式、眼表耦合凝胶以及针对不同荧光报告分子的激发波长优化。
- 源文献支持的实际限制：需以适度压力稳定眼球且避免损伤，压力不足或过大均会影响成像质量。
