用于单个DNA分子大规模并行蛋白质合成的飞升级液滴阵列

在手指大小的基底上可产生超过一百万个均匀的液滴。单个DNA分子被随机分配到每个液滴中。每个液滴中的蛋白质产量与该液滴内的分子数量成正比。

我们的技术可用于快速定量检测酶活性，无需复杂的蛋白质表达与纯化步骤。首先，将盖玻片置于染色架上，并将染色架放入8摩尔的氢氧化钠溶液中。在室温下对盖玻片和染色架进行超声处理15分钟。

将染色架从氢氧化钠中取出，用清水冲洗盖玻片10次。用气枪吹干盖玻片。然后将盖玻片置于200摄氏度的加热板上烘烤并干燥5分钟。

配制0.05%的氨基硅烷溶液。将盖玻片浸入该溶液中，在室温下孵育1小时。用纯水冲洗盖玻片五次。

然后使用气枪吹干盖玻片。在80°C的加热板上烘烤5分钟。将盖玻片基底放置于旋涂仪的定制真空吸盘上。

在玻璃基底中心位置滴加 70 至 90 微升的 A 型 CYTOP 聚合物。随后立即进行旋涂。初始聚合物涂层会损害最终微腔阵列的质量。

将聚合物滴加到盖玻片中心，避免引入气泡。用手握住涂覆后的玻璃片角落，将其放置在铝箔上。先在80摄氏度下烘烤30分钟，再在200摄氏度下烘烤1小时。

在基底中心滴加 0.2 至 0.3 毫升光刻胶。立即以 6,000 rpm 的转速旋涂 60 秒。使用浸有乙醇的擦拭布清除基底边缘多余的光刻胶。

将基底在 110 摄氏度下烘烤 5 分钟。为使光刻胶再水合，将基底置于相对湿度为 42% 至 60% 的环境中静置 30 分钟。将基底装入掩模对准仪中，在真空接触模式下曝光 25 秒。随后将基底浸入显影液中 5 分钟，以溶解曝光区域的光刻胶。

使用纯水冲洗基底10次。然后用气枪彻底吹干基底。将基底放入反应离子刻蚀机的反应室中，利用氧等离子体对覆盖有光刻胶的CYTOP进行刻蚀。

蚀刻后，在室温下将基底置于丙酮中超声处理五分钟，以去除残留的光刻胶。然后将基底在异丙醇中超声处理五分钟。按照文中的描述，使用纯水对基底进行冲洗、超声处理，再冲洗一次。

然后用气枪吹干基底。使用台式切割机将双面粘合的聚酰亚胺薄膜胶带切割成预定的微通道形状。将切割好的胶带粘贴到平底培养皿底部，作为PDMS成型的模具母版。

将PDMS混合物倒入带有胶带图案的培养皿中。然后将培养皿放入小型真空腔室，对PDMS混合物脱气一至三小时。随后将培养皿置于60°C的烘箱中过夜，以固化PDMS。

PDMS 固化后，将固化的弹性体从培养皿上剥离，并使用扁平电缆切割器切下 PDMS 微通道块。然后在每个微通道的两端各打一个孔。先前准备好的基底将具有用于微腔阵列的区域。

将PDMS微通道置于基底的这一区域。然后将一支200微升移液枪头插入PDMS微通道的其中一个孔中。首先，在PCR管中配制CFPS反应溶液。

然后，使用一个200微升的非滤芯移液枪头吸取10微升溶液。将枪头插入PDMS微通道的进样孔中，并按压移液器活塞，直至溶液从微通道出口溢出。将FemDA装置转移至预冷的铝块上。

确认微室阵列区域迅速由半透明变为透明。吸取300微升预冷的冲洗油，并立即将其转移至微通道入口孔的移液枪头中。冲洗油进入微通道，将微室外部多余的反应溶液排出。

同时从装置上取下两个已插入的移液枪头。立即将装置从铝块转移至石蜡膜上。将装有封接油的准备好的移液枪头插入PDMS微通道的入口，并注入油液，直至从出口溢出。

飞升级液滴被油相密封在各个微腔室中。打开离焦的明场图像。为了从每一帧中去除平滑的连续背景，请从“处理”菜单中选择“减去背景”。

输入 20 作为滚动球半径。勾选预览框，然后选择确定。当询问是否处理所有图像时，选择是。

接下来，为了降低噪声，选择“处理”→“滤波器”→“中值”。将半径设置为 2.0 像素。勾选“预览”框，然后点击“确定”。

当询问是否处理所有图像时，选择“是”。接着，选择图像、调整、阈值，以将微室图像与背景分离。在插件菜单中，选择 FemDA、FemDA 分析。

输入单个微室的大致最小和最大像素数量。输入微室的预期最小和最大圆度，以及起始和结束帧编号，然后选择“生成 ROI”以检测微室。成功检测到的感兴趣区域（ROI）将显示在弹出菜单“ROITable”中。

在 FemDA 分析窗口中，选择应用 ROI 掩膜。检查图像以确认微腔是否被正确检测。打开荧光图像并将其置于前端。

再次点击应用 ROI 掩膜，将 ROI 添加到荧光图像中。在 FemDA 分析窗口中，选择“单次”以分析图像的终点数据。在“用于计算的最高像素数量”中输入 N，以使用每个 ROI 的顶端像素来计算相应液滴的平均强度。

然后点击“测量强度”以计算所有检测到的液滴的平均强度。ROITable 将根据荧光图像的新数据进行更新，并在新窗口中显示直方图。点击“另存为文本”按钮导出数据。

将荧光溶液封装在FemDA微腔中，通过显微镜测量与液滴尺寸相关的荧光强度。结果表明，液滴具有较窄的尺寸分布。共聚焦显微镜重建的三维图像也显示，液滴尺寸随时间保持一致。

液滴在室温下至少24小时内保持稳定，无蒸发损失，且液滴之间无交叉污染。在FemDA中合成了荧光蛋白mNeonGreen。通过同时获取的离焦明场图像辅助分析堆栈图像数据。

由于每个液滴的荧光强度反映了其蛋白质产量，该直方图强烈表明每个液滴中的DNA分子数量不均。含有不同数量DNA分子的液滴概率与泊松分布完全吻合。此外，在FemDA中还进行了碱性磷酸酶的合成，并每五分钟采集一次图像。

在较早的时间点，反应显示出液滴荧光强度类似的离散分布，直方图结果证实了液滴中DNA分子数量不均一。单个液滴中封装的单个DNA分子可进一步回收、扩增并测序，从而实现最高通量的蛋白质筛选。一种具有小体积和高稳定性的液滴技术，能够基于特定生物标志物实现癌症疾病的快速而精确的分子诊断。