Name: 多功能神经科学技术的适应性角度立体定向方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: 学习适应性角度立体定向手术方法，用于精准靶向小鼠和大鼠难以触及的脑区。该技术适用于光遗传学、化学遗传学等多种神经科学研究，支持导管植入和病毒微注射等实验操作。

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本工作由美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIDDK）资助，项目编号为F31-DK-113673（C.L.F.）、T32-GM-095421（C.L.F.）、DK-089056（G.J.M.），美国糖尿病协会创新基础科学研究奖（#1-19-IBS-192，授予G.J.M.），以及由NIDDK资助的华盛顿大学营养与肥胖研究中心（DK-035816）、糖尿病研究中心（DK-017047）和糖尿病、肥胖与代谢培训项目T32 DK0007247（T.H.M）。

所有操作程序均依据美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》获得批准，并已获得华盛顿大学机构动物护理与使用委员会及环境健康与安全部门的批准。
1. 倾斜坐标系的计算
<ol>
	<li>使用冠状面脑图谱，标记一个直角三角形，使斜边穿过目标感兴趣区域。在代表性示例中（图1），下丘脑腹内侧核（VMN）的靶向角度为冠状面中线偏转15°。 
	注意：图 1 中所示旋转轴的位置（即边C的长度）是任意的，可根据需要调整以靶向任意脑区。尽管这看似违反直觉，但本方案后续步骤将调整头部在z轴上的位置，使该点与立体定位旋转中心对齐（见第6节）。然而，由于头固定装置的物理限制，建议冠状面旋转角度不要超过15°。</li>
	<li>确定所需角度（a）及边B的估计长度，并利用三角函数计算边A和边C的长度。此步骤对于在旋转过程中正确定位头部至关重要。 
	注意：在 图1 的示例中，使用图谱网格线估算边B的长度，得到其值为7.576 mm。该信息用于计算边A的长度： 
	<img alt="三角函数公式计算；正切角方程；数学教育示意图。" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程1"> 
	在此示例中，2.03 mm表示当头部旋转15°时，光纤套管进入脑组织的左右（R/L）方向距中线的距离。
	<ol>
		<li>可选地，计算边C的长度以估算背腹向（D/V）坐标： 
		<img alt="勾股定理方程求解直角三角形斜边，计算过程展示。" src="/files/ftp_upload/60965/60965equ02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程2"> 
		注意：1）斜边（C）的长度并不代表注射深度，但有助于确定背腹向（D/V）坐标，该坐标可能需要调整以补偿相对于边B在直线进针时增加的路径长度。因此，建议进行预实验注射以优化D/V坐标。2）在此靶向下丘脑腹内侧核（VMN）的示例中，获得两组坐标：一组用于非倾斜微注射（A/P = -1.4，R/L = 0.4，0°时，D/V = -5.7），另一组用于倾斜式光纤植入（A/P = -1.4，R/L = 0.0，15°时，D/V = -5.4）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 倾斜手术立体定位仪的准备
<ol>
	<li>确认立体定位仪和显微操作器已完成校准（详见Kopf操作手册中的完整方案）。</li>
	<li>将中心高度规插入头夹底板的插孔中。</li>
	<li>将对中目镜固定在工具夹持器中，然后通过目镜观察。调节显微操作器的位置，直至目镜中的十字线与高度规上的十字线对齐并聚焦。 
	注意：此步骤中，目镜正被定位至头夹旋转中心的焦平面。一旦完成，后续步骤中不得再移动显微操作器。</li>
	<li>将耳杆插入夹持器中，并进行居中调整，使两侧的指示线均位于0位置（图3A）。</li>
	<li>使用头夹上的内侧-外侧和前-后调节旋钮（图2），在中心高度规十字线的上方，将耳杆在x轴和y轴平面上居中对齐（图3A）。</li>
	<li>为在z轴上对齐耳杆位置，先将耳杆从夹持器中取出，并移除中心高度规。随后重新安装耳杆，并再次将其在0位置居中。</li>
	<li>通过目镜观察，分别使用垂直位移旋钮（图3B）和冠状面倾斜旋钮，降低并旋转耳杆，直至在冠状面旋转过程中，目镜十字线始终保持在耳杆之间的中心位置。</li>
	<li>立体定位仪现已校准完毕，可投入使用。此后不得再对头夹的位置进行任何调整。</li>
</ol>
3. 注射/植入材料的制备
<ol>
	<li>确保所有仪器、手术工具和材料均已灭菌，并放置在立体定位仪旁的无菌手术区域内。</li>
	<li>根据病毒载体的生物安全等级及相关机构的生物安全监管要求进行操作和储存。</li>
	<li>将病毒吸入注射器时，需注意采用正确的操作规范并佩戴个人防护装备。</li>
</ol>
4. 麻醉
<ol>
	<li>手术前记录小鼠的体重。</li>
	<li>使用异氟烷对小鼠进行深度麻醉。</li>
	<li>通过脚趾夹捏测试确认小鼠已达到深度麻醉状态，直至无退缩反应。若动物仍表现出明显反射，应增加麻醉剂浓度和/或延长麻醉时间。</li>
	<li>在每只眼睛上涂抹眼膏，以保持手术期间眼球湿润。</li>
	<li>使用毛发修剪器将小鼠头皮从耳后至眼后区域的毛发剃除。</li>
	<li>给予小鼠经IACUC批准的镇痛剂。</li>
	<li>在整个手术过程中持续监测动物状态，并提供体温支持。</li>
</ol>
5. 手术步骤
<ol>
	<li>将动物头部放入头夹中，使上门齿嵌入咬杆的缝隙内，并确保舌头位于咬杆下方。</li>
	<li>通过将耳杆轻轻插入外耳道来固定头部，确保耳杆对称放置（通常成年小鼠为3至4之间）。此步骤至关重要，以确保头部在旋转过程中保持稳定且居中。</li>
	<li>使用碘伏和酒精棉片交替擦拭剃毛后的切口区域三次，或采用机构批准的其他无菌手术部位准备方法，进行无菌处理。</li>
	<li>在动物体表覆盖手术巾，以维持无菌手术区域，并降低术后感染风险。</li>
	<li>沿头皮正中矢状线做切口，暴露颅骨。轻柔刮除颅骨表面的筋膜，显露颅缝。 
	注意：若颅缝难以辨认，可使用无菌棉签蘸取过氧化氢涂抹于颅骨表面，以增强颅缝的可见度。</li>
	<li>将对中目镜插入支架中，并将十字线中心对准前囟（图4，左图）。将显微操作仪归零。</li>
	<li>将十字线向尾侧移动至后囟，记录前囟-后囟（B-L）距离。 
	注意：若颅缝未沿正中线呈直线分布，建议通过前囟和后囟两点拟合“最佳拟合线”来确定正中线。然而，若严格按照上述步骤操作，则初始放置目镜十字线时应位于两耳杆中间位置，并接近B-L正中颅缝线。</li>
	<li>若B-L距离明显小于或大于4.21 mm，应逐步微调前囟位置，使B-L距离达到4.21 mm ± 0.2 mm。</li>
	<li>将对中目镜更换为对齐指示器。将探针分别置于后囟和前囟，调节头夹上的矢状面倾斜旋钮，使头部在矢状面水平（鼻尖无上下倾斜），然后重新使用对中目镜确定前囟位置。</li>
	<li>使用对齐指示器和冠状面倾斜旋钮，调整冠状面水平。沿头尾轴多个位置进行测量，以校正颅骨表面可能存在的形变。</li>
	<li>记录冠状面倾斜旋钮刻度盘上的位置，该位置即为0°旋转基准位。</li>
</ol>
6. 对倾斜坐标系的旋转中心轴进行对齐
<ol>
	<li>将对中镜固定在工具夹持器中，并将显微操作器移至第1节计算出的坐标位置。注意，倾斜植入时的左右（R/L）坐标对应于A边的长度。
	<ol>
		<li>如图1示例所示，靶向腹内侧核（VMN）的光纤植入倾斜坐标为（前后（A/P）= -1.4，左右（R/L）= [2.03]（冠状面旋转0°时），[0.00]（冠状面旋转15°时），背腹（D/V）= -5.4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>沿对中镜视线方向观察，并标记该坐标位置（以VMN为例，距中线左右2.03 mm；图4，中间图）。此标记代表当头部旋转后，套管将进入大脑的位置。</li>
	<li>将显微操作器重新移至中线位置（R/L = 0.00）。使用冠状面倾斜旋钮将头部旋转至第1节计算出的角度。
	<ol>
		<li>如果对中镜的十字线已与标记对齐，则进入第7节。</li>
		<li>如果对中镜的十字线未与参考标记对齐，则使用垂直位移旋钮（图2）调整头部在Z轴上的位置，直至十字线尽可能与标记对齐。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将头部旋转回0°冠状面位置。如果在步骤6.3中调整了垂直位移，则需使用对中镜重新确定前囟点（bregma）。</li>
	<li>重复步骤6.3和6.4，直至在头部旋转时十字线始终能准确对准参考标记（图4C）。</li>
	<li>此时，第1节中设定的任意旋转点应已与立体定位旋转中心对齐。</li>
</ol>
7. 显微注射
<ol>
	<li>将立体定位钻头安装至固定架中，并操纵显微操作器移至第一个注射坐标。
	<ol>
		<li>以靶向腹内侧核（VMN）为例，当头部保持水平时，在前后位（A/P）= -1.4、左右位（R/L）= 0.4 处进行钻孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li> lowering 钻头直至钻尖刚好接触颅骨上方。启动钻头，轻柔下压，直至钻头刚好穿透颅骨（不要损伤硬脑膜）。</li>
	<li>对对侧注射位点重复上述操作。</li>
	<li>使用无菌持针器将27–30G针头（例如无菌0.5 mL胰岛素注射器的针头）弯成90°，并用该弯针轻柔穿刺硬脑膜。</li>
	<li>注意：若出现出血，应用无菌棉签施加压力，并用无菌水清洁，直至出血停止。</li>
	<li>准备注射时，小心将装有液体的Hamilton注射器放入立体定位固定架中。 
	注意：更换工具后，显微操作器上的原有坐标不再适用。应以骨孔中心作为新的注射靶点。</li>
	<li>小心地将针头置于骨孔上方。</li>
	<li>下放针头，使其轻微接触骨孔中心处的硬脑膜。关键步骤：仅在z轴方向将显微操作器归零，以保持立体定位中心对准镜和钻头的原有坐标不变。</li>
	<li>缓慢将针头插入脑组织，密切观察，确保针头未在骨孔边缘发生偏移。继续下放至比目标深度（D/V坐标）再腹侧0.05 mm处，停留1分钟。此额外步骤可形成一个小“囊袋”，以减少拔针时病毒液的回流。</li>
	<li>缓慢将针头上提至目标D/V坐标，开始注射。 
	注意：流速和注射体积需根据靶区及实验设计而定。对于VMN神经元的光遗传学抑制，需要足够的覆盖范围，因此以1 nL/s的速度注射200 nL病毒液。</li>
	<li>微注射完成后，在原位停留10分钟，以减少拔针过程中病毒液外溢。</li>
	<li>以约1 mm/min的速度缓慢将微量移液针从脑组织中撤出。</li>
	<li>当针头完全退出颅骨后，推出少量病毒液，以确认针头未被血液或组织堵塞。使用无菌棉签清除针尖上的病毒液后再继续操作。</li>
	<li>对对侧重复步骤7.6–7.12。</li>
	<li>用骨蜡封闭微注射所形成的骨孔，以促进愈合（图5B）。</li>
</ol>
8. 光纤植入
注意：病毒注射后，根据第1节计算的角度在双侧植入光纤套管。请注意，这些坐标应已在第6节中标记于颅骨上。
<ol>
	<li>对倾斜坐标重复步骤 7.1–7.4。</li>
	<li>将头部恢复至水平 0° 位置。</li>
	<li>接下来，使用手钻在颅骨上再钻四个用于骨螺钉的孔：两个位于前部，两个位于后部（图 5A）。这些孔将作为固定光纤的锚定点（图 5D）。 
	注意：确保这些孔与倾斜坐标的开颅孔之间保持足够距离，以容纳位于颅骨上方的光纤插芯部分。</li>
	<li>尽可能轻柔地使用小型一字螺丝刀拧入骨螺钉，使其牢固地固定在颅骨中，但不穿透脑组织。</li>
	<li>将光纤套管夹入套管夹持器中，并将其安装到立体定位仪的夹持装置上。</li>
	<li>将头部旋转至计算好的角度，注意此时微操仪上的坐标不再适用于新工具。以倾斜开颅孔的中心作为植入目标点。</li>
	<li>降低光纤，直至其轻轻接触颅骨开孔中心处的硬脑膜（图 5C）。将微操仪在 z 轴方向归零，然后缓慢将光纤下降至 D/V 倾斜坐标位置（以 VMN 示例为例为 -5.4）。</li>
	<li>使用氰基丙烯酸酯胶将光纤插芯与同侧的锚定螺钉连接，然后用微量移液器尖端滴加促凝剂（图 5D）。</li>
	<li>待氰基丙烯酸酯胶完全固化后，轻轻松开套管夹持器，并将其抬升至脱离光纤插芯。</li>
	<li>对对侧倾斜坐标重复步骤 8.5–8.9，然后将头部调平。为增强稳定性，可使用氰基丙烯酸酯胶和促凝剂在两个倾斜的光纤套管之间再建立一条连接（图 5D）。</li>
	<li>准备少量且相对薄层的牙科水泥。将其涂抹于颅骨表面，确保完全覆盖锚定螺钉和光纤套管基部。保留足够的插芯表面清洁，以便后续与光纤跳线对接。</li>
	<li>待牙科水泥完全干燥后，将小鼠从立体定位装置中取出。</li>
	<li>将小鼠放入带有保温支持的恢复笼中。待其清醒、能够活动并开始理毛行为后，转移至饲养笼中继续恢复。</li>
</ol>
9. 术后护理
<ol>
	<li>术后每天观察动物3天，记录其行为、姿势、活动情况和理毛行为，并记录食物摄入量和体重。</li>
	<li>若动物出现任何疼痛或健康状况不佳的普遍迹象，应咨询兽医服务。</li>
	<li>在开始行为学研究前，让小鼠至少恢复2周，并确保病毒充分表达。</li>
</ol>
10. 光遗传学
<ol>
	<li>进行光遗传学研究时，请参考 Sidor 等人8 的方法。</li>
	<li>研究结束后，验证病毒表达及光纤植入位置。</li>
</ol>

<ol><li>King, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise%2C+fall%2C+and+resurrection+of+the+ventromedial+hypothalamus+in+the+regulation+of+feeding+behavior+and+body+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight.</a> Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+for+Neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89, 683-694 (2016).</li>
<li>Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Intracerebral+Stereotaxic+Injections+for+Optogenetic+Stimulation+of+Long-Range+Inputs+in+Mouse+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. , e59534(2019).</li>
<li>Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing%2C+packaging%2C+and+delivery+of+high+titer+crispr+retro+and+lentiviruses+via+stereotaxic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53783(2016).</li>
<li>McSweeney, C., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+Stereotactic+Injection+Technique+to+Study+Genetic+Effects+on+Animal+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52653(2015).</li>
<li>Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Neuroscience+of+Homeostasis+and+Drives+for+Food%2C+Water%2C+and+Salt%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt.</a> New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).</li>
<li>Sidor, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optogenetic+stimulation+of+the+rodent+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51483(2015).</li>
<li>Faber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Neuronal+Projections+from+the+Hypothalamic+Ventromedial+Nucleus+Mediate+Glycemic+and+Behavioral+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects.</a> Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+foundations+of+optogenetics%3A+Determinants+of+channelrhodopsin+ion+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Scences%22%5BJournal%5D)">Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity.</a> Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).</li>
<li>Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+customizable+procedure+for+angled+stereotaxic+implantation+and+microinjection+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Kopf+Carrier%22%5BJournal%5D)">A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain.</a> Kopf Carrier. 96, (2019).</li>
<li>Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+Adeno-associated+Virus+Injection+and+Cannula+Implantation+in+the+Dorsal+Raphe+Nucleus+of+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice.</a> Bio-Protocol. 7, 2549(2017).</li>
<li>Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+topic+in+optogenetics%3A+new+implications+of+in+vivo+tissue+heating%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating.</a> Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

神经科学的最新进展加深了人们对脑神经回路活动与功能的理解。这包括应用光遗传学和化学遗传学技术，在活体动物中激活或抑制特定的神经元群体及其投射区域。近年来，这一领域进一步发展出基因编码的钙离子指示剂（例如 GCaMP、RCaMP）以及其他荧光生物传感器（例如多巴胺、去甲肾上腺素传感器），用于在自由活动的动物中记录特定细胞类型的神经元活动。然而，这些技术的有效应用依赖于成功的立体定位手术，以精确靶向目标脑区。尽管已有多种成熟的实验方案可用于靶向多个脑区，但针对中线附近的深部脑区仍面临显著挑战。本文展示了一种通过倾斜立体定位方法靶向特定脑区的详细手术技术。重要的是，该技术可被调整并应用于多种神经科学研究方法（如光遗传学、化学遗传学和光纤光度法）。
采用这种方法，研究显示，急性光遗传学抑制表达神经元型一氧化氮合酶的腹内侧下丘脑神经元（VMNNOS1 神经元）会减弱小鼠胰岛素诱导的低血糖所引发的胰高血糖素反应9。通过略微改进的方法进一步证明，单侧激活 VMNNOS1 神经元可产生两种效应：1）引发显著...

行为、摄食和代谢的神经调控涉及高度复杂、整合且具有冗余性的神经回路之间的协调。神经科学领域的一个核心目标是解析神经元回路结构与功能之间的关系。尽管经典神经科学技术（如损毁、局部药物注射和电刺激）已揭示了特定脑区在调控行为和代谢中的重要作用，但这些技术因缺乏特异性和可逆性而受到限制1。
神经科学领域的最新进展极大地提升了以高时空分辨率、细胞类型特异性方式研究和操控神经环路功能的能力。例如，光遗传学2和化学遗传学3方法能够快速、可逆地调控自由活动动物中基因定义的特定细胞类型的活动。光遗传学技术利用对光敏感的离子通道（称为通道视紫红质）来控制神经元活动。该技术的关键在于将通道视紫红质基因递送至目标细胞，并提供光源以激活视蛋白。常用的基因递送策略包括：1）使用在特定神经元中表达Cre重组酶的转基因小鼠，与2）携带通道视紫红质基因且依赖Cre激活的病毒载体相结合。
尽管光遗传学技术为控制神经元活动提供了一种优雅且高度精确的方法，但该方法的成功依赖于将病毒载体通过立体定位微量注射并准确植入光纤至特定脑区。虽然立体定位操作在现代神经科学实验室中已较为常见（已有多个优秀的实验方案对此进行了详细描述）4,5,6，但要持续且可重复地靶向位于中线的特定脑区（例如对稳态功能调控至关重要的内侧基底下丘脑7）仍面临额外挑战。这些挑战包括避免损伤上矢状窦、第三脑室以及邻近的下丘脑核团。此外，在进行抑制性研究时，双侧植入硬件设备存在显著的空间限制。鉴于上述挑战，本实验方案提出了一种可通过调整角度实现精准靶向特定脑区的可修改立体定位操作方法。

<table><tbody><tr><td>光纤套管</td><td>Doric Lenses</td><td>MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT</td><td>可定制</td></tr><tr><td>Kopf Model 1900 立体定位对准系统</td><td>Kopf</td><td>Model 1900</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1900-51 中心高度规</td><td>Kopf</td><td>Model 1900-51</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1905 对准指示器</td><td>Kopf</td><td>Model 1905</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1911 立体定位钻孔仪</td><td>Kopf</td><td>Model 1911</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1915 定位显微镜</td><td>Kopf</td><td>Model 1915</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1922 60度无创耳杆</td><td>Kopf</td><td>Model 1922</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1923-B 小鼠气体麻醉头固定器</td><td>Kopf</td><td>Model 1923-B</td><td></td></tr><tr><td>Kopf Model 1940 微型操纵器</td><td>Kopf</td><td>Model 1940</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 微注射系统</td><td>World Precision Instruments</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>小鼠颅骨螺钉</td><td>Plastics One</td><td>00-96 X 1/16</td><td></td></tr><tr><td>立体定位套管夹持器，1.25 mm 套管</td><td>Thor Labs</td><td>XCL</td><td></td></tr><tr><td>手术钻</td><td>Cell Point Scientific</td><td>Ideal Micro Drill</td><td></td></tr></tbody></table>

可调节角度的立体定向方法用于多种神经科学技术

Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

立体定位手术是现代神经科学实验室中不可或缺的工具。然而，精确且准确地靶向难以到达的脑区仍然存在挑战，尤其是在靶向中线附近的脑结构时。这些挑战包括避免损伤上矢状窦和第三脑室，以及持续性地靶向特定且独立的脑核团。此外，一些更先进的神经科学技术（例如光遗传学、光纤光度法和双光子成像）依赖于将大量硬件设备植入脑内，而空间限制常常成为实施中的障碍。本文介绍了一种可调整的立体定位手术方案，采用倾斜冠状面入路方式靶向啮齿类动物脑结构。该方案可适用于：1）小鼠或大鼠模型；2）多种神经科学技术；3）多个不同脑区。作为代表性示例，文中包含了为光遗传学抑制实验而靶向小鼠下丘脑腹内侧核（VMN）时立体定位坐标的计算方法。该实验流程首先在Cre依赖型小鼠模型中双侧微量注射编码光敏感氯离子通道（SwiChR++）的腺相关病毒（AAV），随后进行倾斜式双侧光纤套管植入。研究结果表明，激活VMN中特定神经元亚群对于胰岛素诱导低血糖后完整的葡萄糖反调节反应是必需的。

本方案描述了一种用于开展光遗传学研究的手术操作，旨在探究下丘脑腹内侧核（VMN）神经元在血糖调控中的作用9。首先采用标准（非倾斜）立体定位方法，向双侧VMN微量注射抑制性通道视紫红质病毒。尽管倾斜入路同样适用，但本研究选择标准（非倾斜）入路，因其足以精准靶向目标脑区，且操作简便、可靠且可重复。然而，由于VMN靠近中线，空间受限，无法采用非倾斜方式植入双侧光纤，因此必须建立一种手术策略，以精确地以一定角度植入光纤（图6）。
采用这种手术策略，我们将一种表达改良型通道视紫红质阴离子通道并融合荧光报告蛋白的 Cre 依赖性腺相关病毒（AAV），即“SwiChR++”病毒10，双侧微量注射至 Nos1-cre 小鼠的腹内侧下丘脑核（VMN）。随后，在每侧注射位点背外侧、距中线 15° 角的位置植入光纤。结果如预期，病毒表达局限于 VMN，而在其他脑区未检测到表达。
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本文介绍了一种立体定位手术方法，该方法采用倾斜的冠状面入路，可靶向传统方法难以触及的脑区（受限于空间限制）。该方案适用于小鼠和大鼠模型，可广泛应用于多种神经科学研究，包括套管植入和病毒载体的微量注射。

立体定向手术是现代神经科学实验室中的重要工具。然而，精确且准确地靶向难以到达的脑区……

本方案具有重要意义，因为它是一种可灵活调整的立体定位手术方法，适用于小鼠和大鼠，并可应用于多种新兴的神经科学技术。这种可调立体定位手术的主要优势在于其能够精准靶向脑内结构复杂且难以到达的区域。实验操作将由实验室中一位年轻而富有才华的博士后研究员Chelsea Faber进行演示。在确认支架和显微操作仪已完成校准后，将中心高度规插入头夹底板的插孔中。将对中显微镜固定在工具架上，并通过其目镜观察。调节显微操作仪的位置，直至十字线与高度规上的十字线对齐并清晰聚焦，然后将耳杆插入夹持器中，使两侧的指示线均位于零刻度位置。使用头固定装置上的内侧-外侧和前侧-后侧旋钮，将耳杆在中心高度规十字线的上方调整至 X 和 Y 平面的中线位置。为在 Z 轴上对齐耳杆位置，需先从固定装置上取下耳杆，并移除中心高度规；然后重新安装耳杆，并将耳杆重新调至零位中心位置。然后，再次沿显微镜视野观察，分别使用垂直移动和冠状面倾斜旋钮，降低并旋转耳杆，直至在冠状面旋转过程中，显微镜十字线始终位于耳杆之间中心位置。为对齐倾斜坐标的旋转中心轴，将对中显微镜固定于工具架中，并将显微操作仪移至计算所得的坐标位置。注意，倾斜植入时的左右坐标对应于A边的长度。沿显微镜视野观察，标记此坐标，以表示头部旋转后套管将进入大脑的位置。将显微操作仪重新定位至中线位置，并使用冠状面倾斜旋钮将头部旋转至计算出的角度。如果显微镜十字线未与参考标记对齐，请使用垂直位移旋钮调整头部在 Z 轴上的位置，直至十字线尽可能与标记对齐。此时，任意旋转点应与立体定位仪的旋转中心对齐。在进行后续的钻孔和微量注射步骤之前，将头部旋转回冠状面零度位置。完成微量注射后，将头部恢复至水平零度位置，并使用手钻在前部钻两个孔，在后部钻两个孔，这些孔应距离之前倾斜坐标的钻孔足够远，以便容纳光纤套管中位于颅骨上方的部分。所有钻孔完成后，使用小型一字螺丝刀尽可能轻柔地插入颅骨螺钉，确保螺钉牢固地固定在颅骨上，但不穿透脑组织。将光纤套管夹入套管固定器中，并将套管固定器放入工具架内。旋转头部至计算好的角度，并注意此时显微操作仪的坐标不再适用于新工具。以倾斜钻孔的中心作为植入靶点。将光纤缓慢下放至恰好接触颅骨钻孔中心处的硬脑膜，然后将显微操作仪在Z轴方向归零。继续缓慢将光纤下放至背腹向的斜角坐标位置，随后使用氰基丙烯酸酯凝胶将光纤插芯与同侧固定螺钉连接。用微量移液器吸头滴加促凝剂。待凝胶完全硬化后，轻轻松开并抬起套管固定器，直至其完全脱离卡环。将第二根光纤植入对侧倾斜坐标的预定位置，然后调平头部。为确保额外稳固，可使用氰基丙烯酸酯凝胶及促凝剂在两根倾斜的光纤套管之间形成附加连接，并在颅骨表面涂抹少量较薄的牙科水泥，注意彻底覆盖锚定螺钉及光纤套管的基部。为了研究下丘脑腹内侧核神经元在血糖调控中的作用，在本代表性分析中，采用标准的非倾斜立体定位方法，向腹内侧核双侧微量注射抑制性通道视紫红质病毒。由于腹内侧核靠近中线，空间限制使得无法以非倾斜方式植入双侧光纤，因此必须开发一种手术策略，以精确地以一定角度植入光纤。需要牢记的最重要事项是保持耐心并缓慢操作，因为在坐标定位上保持一致性和准确性对成功至关重要。该方法可进行调整并应用于任何需要向啮齿类动物脑内进行微量注射或植入的神经科学研究技术，包括化学遗传学、光遗传学以及光纤光度法等方法。

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科研

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神经科学

多功能神经科学技术的适应性角度立体定向方法

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在功能磁共振成像期间施用的神经导航聚焦经颅直流电刺激

学习适应性角度立体定向手术方法，用于精准靶向小鼠和大鼠难以触及的脑区。该技术适用于光遗传学、化学遗传学等多种神经科学研究，支持导管植入和病毒微注射等实验操作。

可调节角度的立体定向方法用于多种神经科学技术

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