Name: CXCR4在Murine B-1a细胞上的逆转录病毒过度表达和靶向B-1a细胞向骨髓和IgM生产转移的采用转移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学习逆转录病毒过表达和过继转移技术，用于研究小鼠B-1a细胞的体内迁移与定位。该方法可稳定高效地实现基因递送，适用于免疫学及细胞生物学研究。

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本工作由以下项目资助：1R01 HL107490、1R01 HL136098、P01 HL055798 的项目 3、P01 HL136275-01（C.A. McNamara）以及 R01GM100776（T.P. Bender）。A. Upadhye 获美国心脏协会博士前奖学金 16PRE30300002 和 5T32AI007496-20 资助。我们感谢弗吉尼亚大学流式细胞术核心实验室的 Joanne Lannigan、Mike Solga 和 Claude Chew 提供出色的技术支持。

所有动物实验方案均经弗吉尼亚大学动物护理与使用委员会批准。
1. 腹膜B-1细胞的磁分离与富集
<ol>
	<li>使用 CO2 处死一只 12−14 周龄的雄性 CD45.1+ApoE-/- 小鼠。</li>
	<li>使用直手术剪在腹部做一浅表切口，用弯剪剥离皮肤以暴露腹膜壁。使用 10 mL 注射器和 25 G 针头，以 10 mL 37 °C 的 RPMI-1640 培养基冲洗腹腔。抓住小鼠尾巴，充分左右摇晃 15−20 秒，以使细胞脱离。 
	注意：按摩灌洗后的腹膜也可最大程度提高细胞回收率。</li>
	<li>使用 10 mL 注射器和 25 G 针头，从腹腔右下侧靠近肠道、髋部水平稍上方的位置吸取腹腔液体。避免破坏附睾脂肪库和深层器官。避免从小鼠左侧抽取液体，因为网膜脂肪容易被吸入注射器中。</li>
	<li>当收集到约 6−7 mL 液体后，将其转移至置于冰上的 50 mL 锥形管中。接着，用镊子夹住横膈膜上方的腹膜壁，将小鼠垂直提起，使任何残留液体停留在腹腔底部。使用手术剪在肝脏上方的腹膜壁上做一个小切口（注意不要剪到肝脏），并用玻璃移液管和吸球收集剩余的腹腔液体。</li>
	<li>将所有 CD45.1+ApoE-/- 小鼠（n = 15−20）的腹腔冲洗细胞合并至 50 mL 锥形管中，并置于冰上保存。 
	注意：计算所需小鼠数量时参考：B-1a 细胞占总腹腔细胞群的 5−10%，在作者操作下每只小鼠可获得约 2.5−5 × 105 个 B-1a 细胞。如下方所示，转导效率约为 30−40%。</li>
	<li>使用台盼蓝等活细胞染料和血细胞计数板计数活细胞（将样品以 1:5 比例稀释于台盼蓝中，取 10 µL 加入血细胞计数板计数室）。将细胞合并，每管最多含 1 × 108 个细胞。在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，然后吸除上清液。</li>
	<li>将最多 1 × 108 个细胞重悬于 1 mL 阻断液中，阻断液为抗 CD16/CD32 抗体（材料表）以检测缓冲液（1× 磷酸盐缓冲液 [PBS]、0.5% 牛血清白蛋白 [BSA]、2 mM EDTA）按 1:50 比例稀释而成，用于阻断 Fc 受体。根据细胞数量按比例调整体积。在冰上孵育 10 分钟，温度为 4 °C。</li>
	<li>在检测缓冲液中配制用于耗竭的生物素化抗体的 2× 主混合液（表 1）。2× 主混合液的体积需考虑细胞在抗 CD16/CD32 孵育时已有的液体体积。例如，若细胞在 500 µL 稀释的抗 CD16/CD32 溶液中孵育，则加入 500 µL 的 2× 主混合液，其中包含生物素化 Ter119、Gr-1、CD23 和 NK1.1 抗体各 10 µL，以及生物素化 F4/80 抗体 25 µL，以达到 表 1 中给出的终浓度。将 2× 主混合液加入细胞中，在 4 °C 下染色 20 分钟。</li>
	<li>用 5 mL 检测缓冲液洗涤细胞，在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。</li>
	<li>将细胞重悬，并按照生产商推荐的浓度和操作步骤，用检测缓冲液稀释的抗生物素微珠（材料表）进行孵育。</li>
	<li>用 5 mL 检测缓冲液洗涤，于 4 °C 以 400 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，将最多 1 × 108 个细胞重悬于 500 µL 检测缓冲液中。</li>
	<li>用 3 mL 检测缓冲液预处理磁性分选柱（材料表）。将细胞转移至预处理的磁性分选柱上，收集流出液，其中含有富集的 B-1 细胞，收集至置于冰上的 15 mL 锥形管中。用额外的检测缓冲液洗涤磁性分选柱，直至收集的总体积达到 10 mL。 
	注意：应分别通过流式细胞术分析纯化前和纯化后的细胞组分，以评估纯化效率，染色标记包括 CD19+ B 细胞、F480+ 巨噬细胞和 CD5+ T 细胞，如 图 2 所示。</li>
	<li>通过步骤 1.6 的方法计数纯化后的细胞组分（即含有富集 B-1 细胞的流出液），并以 B 细胞培养基（RPMI-1640、10% 热灭活胎牛血清 [FBS]、10 mM HEPES、1× 非必需氨基酸、1 mM 丙酮酸钠、50 µg/mL 庆大霉素、55 µM β-巯基乙醇）将细胞重悬至 1 × 106 个细胞/mL。</li>
</ol>
2. 腹膜B-1细胞刺激
<ol>
	<li>将两种转导条件（Ctl-GFP 和 CXCR4-GFP）的混合细胞进行分装，同时预留并接种至少 10 × 106 个细胞作为非转导对照组。</li>
	<li>每孔加入最多 150 µL（150,000 个细胞）细胞悬液至 96 孔圆底培养板中。</li>
	<li>向所有孔中加入 100 nM TLR9 激动剂 ODN1668，以刺激细胞增殖。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 16−18 小时。</li>
</ol>
3. 腹腔B细胞的逆转录病毒感染转导
<ol>
	<li>使用磷酸钙转染法生成 Ctl-GFP（MigR1）和 CXCR4-GFP 慢病毒颗粒，具体步骤参见已发表的实验方案14。 
	注意：此过程需要数天时间，因此请在开始本实验方案前预先制备并测定慢病毒滴度，分装后于 -80 °C 保存。</li>
	<li>将慢病毒储存液置于冰上解冻。解冻后应立即使用，不可再次冻存，因为反复冻融会显著降低病毒滴度。在终浓度为 8 µg/mL 的多聚素（polybrene）和 55 µM 新鲜 β-巯基乙醇存在下，按 20:1 的感染复数（MOI）将 Ctl-GFP 或 CXCR4-GFP 慢病毒上清液加入细胞中。切勿将病毒储存液加入预留的未转导对照组细胞中。</li>
	<li>进行离心感染（spinfection），将培养板在室温下以 800 × g 离心 90 分钟。</li>
	<li>将培养板在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育 3 小时。</li>
	<li>收集细胞并重新接种于新鲜 B 细胞培养基中，于 37 °C、5% CO2 条件下过夜培养。</li>
</ol>
4. 转导腹膜B-1a细胞的分选
<ol>
	<li>收集培养的细胞，并按每种条件分别合并到三个50 mL锥形管中：未转导组、Ctl-GFP转导组和CXCR4-GFP转导组。</li>
	<li>按照步骤1.6计数活细胞，然后在4 °C下以400 × g离心5分钟，吸除上清液。</li>
	<li>用分选缓冲液（PBS + 1% BSA）将细胞重悬至100,000个细胞/µL，并加入1:50的抗CD16/CD32抗体（材料表），以阻断Fc受体。在冰上孵育10分钟，温度保持在4 °C。</li>
	<li>分装细胞用于补偿对照（每种补偿对照约30,000个细胞）：未染色和单染对照取自未转导样本，GFP单染对照取自转导样本。 
	注：如果未转导细胞数量较少，可选择使用市售的补偿微珠作为单染对照。</li>
	<li>在分选缓冲液中配制含有荧光素偶联抗体的2×主混合液（表1）。将2×主混合液分别加入未转导、Ctl-GFP转导和CXCR4-GFP转导的样本中。向各单染对照中加入对应的单一抗体。在4 °C避光孵育20分钟。 
	注：2×主混合液的体积已考虑了细胞在步骤1.8中与抗CD16/CD32抗体孵育时所处的液体体积。可从每种条件的样本中另取部分细胞单独染色CXCR4，以确认CXCR4的过表达。</li>
	<li>用1 mL分选缓冲液洗涤样本，并通过70 µm滤器过滤至聚丙烯管中。</li>
	<li>在4 °C下以400 × g离心5分钟，吸除上清液。用分选缓冲液将样本重悬至50,000个细胞/µL。</li>
	<li>在细胞分选前，准备标记好的荧光激活细胞分选（FACS）收集管，每管含1 mL收集培养基（RPMI-1640、20%热灭活FBS、10 mM HEPES、1×非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠、50 µg/mL庆大霉素、55 µM β-巯基乙醇），用于收集待分选的各细胞群。</li>
	<li>在上机分选前，加入2× DAPI（用分选缓冲液按1:5000稀释配制），用于区分死细胞。</li>
	<li>将GFP+ B-1a细胞从Ctl-GFP和CXCR4-GFP样本中分选至含有收集培养基的FACS管中，分选表型为DAPI- CD19+ GFP+ B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+的细胞。使用未转导样本设定GFP+门控，并分选DAPI- CD19+ GFP- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5+的未转导B-1a细胞。 
	注：也可通过在Ctl-GFP和CXCR4-GFP样本中单独圈选GFP阴性部分的B-1a细胞来分选未转导细胞。使用相同的分选策略，还可分选转导或未转导的B-1b细胞，其表型为DAPI- CD19+ GFP+/- B220mid-lo CD23- IgM+ CD5-。</li>
</ol>
5. 过继性转移
<ol>
	<li>细胞分选后，在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，并小心吸除上清液。</li>
	<li>用预冷的无菌 1× PBS 将细胞重悬至浓度为 1,000 个细胞/µL。</li>
	<li>使用异氟烷麻醉雄性 Rag1-/- ApoE-/- 小鼠，并用超细胰岛素注射器通过静脉后眶或尾静脉注射每只小鼠 100 µL（含 100,000 个细胞）。同时注射若干只小鼠 1× PBS 作为对照。</li>
</ol>
6. 供体细胞和血浆 IgM 的定量分析
<ol>
	<li>在过继性转移后的预定时间点，通过采集受体小鼠的骨髓和脾脏组织并进行流式细胞术分析转移的细胞4。通过CD45.1、CD45.2和CXCR4染色定量供体细胞的定位及CXCR4的过表达，并使用Flowjo等软件分析流式细胞术结果。 
	注意：本步骤所用抗体见表1。请确保不要使用在FITC通道产生荧光的抗体偶联物，因为转导的供体细胞将表达GFP。</li>
	<li>在动物处死后通过心脏穿刺采集全血，加入10 µL 0.5 M EDTA以分离血浆。将全血在7,000 x g条件下离心，分装血浆至若干1.5 mL离心管中。于-80 °C保存，直至通过ELISA4检测分泌因子（如IgM）。</li>
</ol>

<ol><li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+Cell+Heterogeneity+and+the+Regulation+of+Natural+and+Antigen-Induced+IgM+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production.</a> Frontiers in Immunology. 7, 324(2016).</li>
<li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1a+cell+diversity%3A+nontemplated+addition+in+B-1a+cell+Ig+is+determined+by+progenitor+population+and+developmental+location%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location.</a> Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).</li>
<li>Prohaska, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Sequencing+of+Peritoneal+and+Splenic+B+Cell+Repertoires+Highlights+Unique+Properties+of+B-1+Cell+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies.</a> Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).</li>
<li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+define+murine+B+cell+lineage+immunoglobulin+heavy+chain+%28IgH%29+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires.</a> Elife. 4, 09083(2015).</li>
<li>Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+cells+in+the+bone+marrow+are+a+significant+source+of+natural+IgM%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM.</a> European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).</li>
<li>Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+secretion+by+B1+cells%3A+Differential+intensity+and+IRF4-dependence+of+spontaneous+IgM+secretion+by+peritoneal+and+splenic+B1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells.</a> European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).</li>
<li>Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS-induced+migration+of+peritoneal+B-1+cells+is+associated+with+upregulation+of+CXCR4+and+increased+migratory+sensitivity+to+CXCL12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12.</a> Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+plasma+cell+alloantigen+1+defines+layered+development+of+B-1a+B-cell+subsets+with+distinct+innate-like+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).</li>
<li>Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+and+differentiation+of+natural+antibody-producing+cells+in+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).</li>
<li>Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+cell+immunoglobulin+directed+against+oxidation-specific+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 415(2012).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+Valuable+tools+or+useless+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
<li>McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+of+murine+B+lymphocyte+blasts+as+a+method+for+examining+gene+regulation+in+primary+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells.</a> Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).</li>
<li>Lin, K. I., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+genes+into+primary+murine+splenic+B+cells+using+retrovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).</li>
<li>Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+Ex+Vivo+Gene+Transfer+to+Primary+Murine+B+Cells+Using+Plasmid+or+Viral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Syndromes+and+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103(2011).</li>
<li>DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PU.1+regulates+expression+of+the+interleukin-7+receptor+in+lymphoid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors.</a> Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).</li>
<li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Decline+in+Natural+IgM+Function%3A+Diversification+and+Selection+of+the+B-1a+Cell+Pool+with+Age%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age.</a> The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).</li>
<li>Laurie, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+and+efficient+expression+in+mouse+and+human+B+cells+by+a+novel+hybrid+immunoglobulin+promoter+in+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).</li>
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<li>Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IL-5+for+mature+B-1+cells+in+homeostatic+proliferation%2C+cell+survival%2C+and+Ig+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production.</a> Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).</li>
<li>Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+5+in+the+link+between+the+innate+and+acquired+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response.</a> Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).</li>
<li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double+life+of+a+B-1+cell%3A+self-reactivity+selects+for+protective+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文提供的方法实现了体内原代B-1a细胞的稳定且相对高效的基因递送、过继性转移以及注射细胞的鉴定与定位。在细胞转移后17周仍可检测到细胞，并且这些细胞维持了CXCR4表达的上调。在本研究中，逆转录病毒介导的递送方法对原代小鼠B-1a细胞实现了30–40%的转导效率，且对细胞活力影响极小（图4e）。该结果与Moghimi及其同事先前的一项研究结果一致，该研究比较了包括逆转录病毒感染、腺病毒感染、核转染和脂质体转染在内的多种原代小鼠B细胞基因转移技术15。然而，我们发现接受CXCR4-GFP转导B-1a细胞的受体个体之间，CXCR4过表达的程度存在较大差异（图6c,d）。因此，我们采用关联性分析表明，CXCR4表达水平的升高与B-1a细胞向骨髓迁移和定位能力的增强相关，并且该现象与血浆IgM水平升高相关联（表3 和 表4）。
<p class="jove_conten...

近期研究表明，免疫细胞（尤其是B细胞）的表型和功能具有显著异质性，这种异质性取决于细胞的定位1,2,3,4,5。B-1a细胞就是一类具有异质性功能的细胞群体，其产生保护性IgM抗体的能力各不相同：骨髓中的B-1a细胞能够组成性地分泌IgM，对血浆IgM滴度有重要贡献6，而腹膜腔中的B-1a细胞在稳态条件下IgM分泌水平较低，但可通过天然免疫Toll样受体（TLR）或细胞因子介导的信号通路被激活，从而迅速增殖、迁移并分泌IgM7,8,9,10。B-1a细胞产生的IgM抗体可识别存在于病原体、凋亡细胞和氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）上的氧化特异性表位（OSE），IgM与OSE结合可抑制动脉粥样硬化等疾病中的炎症下游信号传导11。因此，通过促进腹膜腔B-1a细胞向骨髓等部位迁移以增强IgM产生的策略可能具有治疗潜力。然而，此类策略必须具有靶向性和细胞类型特异性，因为脱靶效应可能对免疫功能或健康产生负面影响。
本文介绍了一种在原代小鼠B-1a细胞中靶向且长期过表达CXCR4的方法，并通过过继转移以可视化细胞迁移和功能性IgM抗体的产生（图1）。与转化细胞系的转染相比，原代B细胞的基因操作受限于较低的转染效率。然而，由于转化细胞系可能与原代细胞存在显著差异12,13，使用原代细胞更有可能获得更接近正常生理状态的结果。已有多种技术被用于原代小鼠B细胞的基因转移，包括逆转录病毒转导、腺病毒转导、脂质体转染或基于电穿孔的转染，这些方法在效率、持续性及对细胞活力的影响方面各不相同13,14,15。本方法采用逆转录病毒转导，因其在对细胞活力影响最小的情况下实现了超过&#62;30%的足够基因转移效率。表达CXCR4的逆转录病毒通过此前描述的逆转录病毒载体小鼠干细胞病毒-内部核糖体进入位点-绿色荧光蛋白（MSCV-IRES-GFP；MigR1）16构建，其中插入了小鼠CXCR4基因4。MigR1（对照(Ctl)-GFP）和CXCR4-GFP逆转录病毒颗粒通过磷酸钙转染法产生，具体步骤依据已发表的实验方案4,14进行。
成功转导的B-1a细胞随后被静脉注射至淋巴细胞缺乏的Rag1-/-小鼠体内。供体和受体小鼠均额外缺失载脂蛋白E（ApoE）基因，导致OSE积累增加和动脉粥样硬化，从而为体内B-1细胞活化及IgM产生提供了一个研究模型。此外，供体与受体小鼠在CD45同种型上存在差异：供体B-1细胞来源于CD45.1+ ApoE-/-小鼠，并被转移至Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/-受体小鼠中。这一设计可在过继转移后区分供体CD45.1与受体CD45.2的B细胞，而无需在流式细胞术分析过程中额外染色B细胞标志物。本文结果表明，靶向在B-1a细胞上过表达CXCR4与其向骨髓迁移能力增强相关，而这一迁移能力的提升又与血浆中抗-OSE IgM水平升高相关。我们还提供了一种通过负向筛选富集腹膜B-1细胞的方法，并证实了B-1细胞活化对于高效转导的必要性。该方法可适用于其他逆转录病毒载体，用于研究蛋白过表达对B-1a细胞迁移、表型或功能的影响。此外，理论上利用CD45.1与CD45.2同种型的差异，也可将该方法拓展至其他具有内源性B细胞的免疫健全小鼠模型中进行细胞转移实验。

<table><tbody><tr><td>70 微米滤膜帽</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>抗生物素微珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD16/CD32（Fc 封闭剂）</td><td>Life Technologies</td><td>MFCR00</td><td></td></tr><tr><td>B220 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0452-83</td><td>克隆：RA3-6B2</td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APCef780</td><td>eBioscience</td><td>47-0193-82</td><td>克隆：eBio1D3</td></tr><tr><td>CD23 生物素标记</td><td>eBioscience</td><td>13-0232-81</td><td>克隆：B3B4</td></tr><tr><td>CD23 PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0232-82</td><td>克隆：B3B4</td></tr><tr><td>CD3e 生物素标记</td><td>eBioscience</td><td>13-0033-85</td><td>克隆：eBio500A2</td></tr><tr><td>CD45.1 ApoE-/- 小鼠</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>本实验室繁育</td></tr><tr><td>CD45.1 PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560580</td><td>克隆：A20</td></tr><tr><td>CD45.2 BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562895</td><td>克隆：104</td></tr><tr><td>CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- 小鼠</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>本实验室繁育</td></tr><tr><td>CD5 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0051-83</td><td>克隆：53-7.3</td></tr><tr><td>对照-GFP 逆转录病毒</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>本实验室使用 Dr. T.P. Bender 提供的表达 GFP 的逆转录病毒质粒 MigR1 构建</td></tr><tr><td>CXCR4 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-9991-82</td><td>克隆：2B11</td></tr><tr><td>CXCR4-GFP 逆转录病毒</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>本实验室通过将小鼠 CXCR4 克隆至 MigR1 逆转录病毒质粒中构建</td></tr><tr><td>F4/80 生物素标记</td><td>Life Technologies</td><td>MF48015</td><td>克隆：BM8</td></tr><tr><td>FlowJo 软件 v. 9.9.6</td><td>Treestar Inc.</td><td>需许可证</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 生物素标记</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-82</td><td>克隆：RB6-8C5</td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>IgM PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562565</td><td>克隆：R6-60.2</td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>029405</td><td></td></tr><tr><td>活/死细胞染料 Yellow</td><td>Life Technologies</td><td>L34968</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>NK1.1 生物素标记</td><td>BD Biosciences</td><td>553163</td><td>克隆：PK136</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>ODN 1668</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-1668</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Ter119 生物素标记</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-82</td><td>克隆：Ter119</td></tr></tbody></table>

在小鼠b-1a细胞中通过逆转录病毒过表达cxcr4并进行过继转移，以实现b-1a细胞向骨髓的靶向迁移及igm的产生

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

由于细胞功能受到细胞微环境中特定生态位因素的影响，研究细胞定位和迁移的方法可为进一步理解细胞功能提供重要信息。B-1a细胞是小鼠中一类独特的B细胞亚群，能够产生针对健康和疾病状态下出现的氧化特异性表位的保护性天然IgM抗体。B-1a细胞的IgM产生能力因其所在位置不同而存在差异，因此从治疗角度而言，将B-1a细胞靶向定位于支持高水平抗体产生的生态位具有重要意义。本文介绍了一种通过逆转录病毒介导的C-X-C基序趋化因子受体4（CXCR4）过表达，将B-1a细胞迁移靶向骨髓的方法。在原代小鼠B细胞中进行基因诱导具有挑战性，通常转染效率较低，约为10–20%，具体取决于所用技术。本文证明，通过逆转录病毒感染原代小鼠B-1a细胞，可实现30–40%的转导效率。该方法利用过继性细胞转移，将转导后的B-1a细胞移植到B细胞缺陷型受体小鼠体内，从而可视化供体B-1a细胞的迁移与定位。本方案可针对其他逆转录病毒载体进行调整，并可用于过继转移后的多种功能检测，包括供体细胞或宿主细胞表型与功能分析，或B-1a细胞转移后分泌的可溶性因子分析。利用CD45.1和CD45.2同种异型区分供体与受体小鼠，并结合逆转录病毒质粒中携带的GFP报告基因，还可使供体细胞在其他具有内源性B细胞群体的免疫健全小鼠模型中被检测到。

方案概述如下所示 图1. 图2 在磁珠耗竭其他腹腔细胞类型后，腹腔B-1a细胞富集。耗竭后组分中的活单细胞中，CD19+ B细胞的比例高于F4/80+ 巨噬细胞缺乏 CD5你好 CD19- T细胞，并含有更高频率的CD19+ CD5中 B-1a 细胞与耗竭前组分相比。 图3 展示了B细胞活化对于逆转录病毒介导的B细胞转导成功所必需，并显示使用Ctl-GFP逆转录病毒时，随着病毒MOI的增加，成功转导的GFP+ B细胞亚群频率呈剂量依赖性升高。 表 2 与24孔或6孔板相比，使用96孔圆底板可提高转导效率。 图4 显示成功的CXCR4过表达（&gt;40%）的B-1细胞，并在体外增强B-1细胞向CXCL12的迁移能力，而对B细胞活力无显著影响。 <strong ...

本文介绍了一种用于逆转录病毒过表达及小鼠B-1a细胞过继转移的方法，以研究B-1a细胞在体内的迁移与定位。该方案可进一步扩展用于多种下游功能检测，包括定量分析供体B-1a细胞的定位，或在过继转移后检测供体细胞衍生的分泌因子。

在小鼠B-1a细胞中通过逆转录病毒过表达CXCR4并进行过继转移，以实现B-1a细胞向骨髓的靶向迁移及IgM的产生

由于细胞功能受到细胞微环境中特定生态位因素的影响，解析细胞定位与迁移的方法可提供……

该方案可用于评估靶向基因递送对B-1a细胞定位和功能的影响，是体内研究基因治疗潜力的概念验证方法。该方法可实现对原代B-1a细胞稳定且相对高效的基因递送，并能够在过继性转移后鉴定供体细胞的表型和功能。该方法可用于体内研究多种供体与宿主细胞过程，包括细胞存活、增殖和功能，并可推广应用于其他过继性转移系统。腹腔液采集可能较为困难。务必充分解离细胞以最大化回收率，并避免刺破肠道，以免污染腹腔细胞群体。采集腹腔B-1细胞时，使用直头手术剪在12至14周龄、雄性、CD45.1+载脂蛋白E基因敲除小鼠的腹部做一浅表切口，再用弯头剪小心剥离皮肤以暴露腹膜壁。使用带有25号针头的10毫升注射器，用10毫升37摄氏度的RPMI-1640培养基冲洗腹腔。然后抓住鼠尾根部，将小鼠充分左右摇晃15至20秒。摇晃后，用注射器从腹腔右下侧、髋部水平稍上方、靠近肠道的区域吸取液体，注意避免破坏附睾脂肪垫及深层器官。收集6至7毫升灌洗液后，将其加入预冷的50毫升锥形管中，并置于冰上。用镊子夹住膈肌上方的腹膜壁，使动物垂直抬起，以确保任何残留液体仍停留在腹腔底部。使用手术剪在肝脏上方的腹膜壁上剪开一个小切口，注意不要损伤肝脏本身。使用玻璃移液管和吸球收集残留的腹腔液体。待所有液体收集完毕后，将所有小鼠的腹腔灌洗细胞分装，并在冰上将每管细胞浓度调整至最多1 × 10⁸ 个细胞/管，分装至50 mL离心管中。通过离心沉淀细胞。将每个沉淀重悬于1毫升封闭缓冲液中，其中抗CD16/CD32抗体按1:50比例稀释，4°C孵育10分钟。孵育结束后，向每管加入等体积的生物素标记抗体主混合液，4°C孵育20分钟，随后每管用5毫升封闭缓冲液洗涤一次。根据细胞浓度及生产商建议，使用适当体积的抗生物素微珠和相应的孵育时间重悬沉淀，之后每管再用5毫升封闭缓冲液洗涤一次。将每个沉淀重悬于500微升分析缓冲液中，并用每柱3毫升分析缓冲液预处理相应数量的磁性分离柱。将细胞转移至已预处理的分离柱上，收集流出液，其中含有富集的B-1细胞，置于冰上的15毫升锥形管中。随后用额外的分析缓冲液洗涤每个磁性分离柱，直至总体收集体积达到10毫升，并将纯化后的细胞组分重悬于B细胞培养基中，浓度为每毫升1×10⁶个细胞。为刺激腹膜B-1细胞，需预留至少1 × 10⁷个细胞作为非转导对照组，并将剩余细胞均分为两等份用于转导。将细胞稀释至每150 µL培养基中含有1.5 × 10⁵个细胞的浓度，取150 µL细胞悬液加入96孔圆底培养板的各孔中，以进行转导处理。随后向每孔加入100 nmol的TLR9激动剂，并将培养板置于细胞培养箱中孵育16至18小时。对于腹膜B细胞的逆转录病毒转导，将磷酸钙转染产生的逆转录病毒颗粒储存液在冰上解冻后，立即加入至对照组和趋化因子受体逆转录病毒上清液中，每孔加入适量体积，使感染复数为20:1，同时加入终浓度为每

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