基于特征学习的腿部分割与追踪技术（FLLIT）实现自由移动昆虫腿部的全自动追踪

FLLIT 是一种用于计算被追踪动物身体和腿部构成的算法。该算法有助于表征正常行走行为及疾病相关行走行为背后的神经环路机制。FLLIT 的独特之处在于，它无需任何用户标注的数据集进行训练，因此完全自动化。

同时自动分析轨迹数据，生成一系列步态测量指标、用于可视化的步态图谱以及轨迹视频。演示该实验步骤的是我实验室的博士后同事 Animesh Banerjee。在开始实验之前，请确认记录装置配备有高速相机，并在上方设有用于放置行为观测室的平台。

将红外 LED 灯放置在观察台顶部，并在相机与样品之间放置漫射器。开始记录前约 40 分钟，将果蝇转移至预冷的空离心管中，置于冰上麻醉 5 至 7 分钟。在果蝇麻醉期间，使用水和擦拭纸清洁观察 arena 及样品室的玻璃片，并将其中一块玻璃片用胶带固定在样品室下方。

使用干净的毛刷将一只麻醉后的果蝇转移至观察室中，并用第二张载玻片和胶带固定观察室。随后，让置于观察室中的果蝇在室温下适应15至20分钟。为进行FLLIT分析生成视频，首先打开电源，并在连接的计算机系统上启动查看器应用程序。

将录制帧率更改为每秒 1,000 帧，并将快门速度设置为 1 毫秒。将装有果蝇的培养室放置于录制区域，然后点击 LIVE 按钮。确认当果蝇在培养室底部直立行走时，相机已对准其腿部末端，然后点击录制。

录制过程中，需确保果蝇沿相对直线行走，不接触 arena 边缘，每条腿至少完成三个步态周期，行走过程中无停顿，且行走距离至少相当于一个半体长。分析结束后，单击“Record Done”以停止录制，并将文件保存为 mraw 或 tiff 格式至相应文件夹。安装 FLLIT 时，首先将程序下载到任意操作系统中。

解压 zip 文件并下载示例数据集。要在 Ubuntu 系统中安装 FLLIT，请进入 FLLIT/Compiled 目录，右键单击并选择“在终端中打开”。下载一个示例数据集，并在 FLLIT-master/Compiled 目录下创建一个名为 data 的文件夹，用于存放数据集文件夹。

将 MATLAB 运行时库安装到 HOME/MCR 目录中。当 MATLAB 运行时库安装完成后，执行命令以确保可执行权限已记录到 FLLIT。然后输入命令以运行 FLLIT。

为进行视频分割，将文件转换为单独的 TIFF 文件，并将转换后的文件保存在 FLLIT 数据文件夹中。当所有文件传输完毕后，运行 FLLIT。在弹出窗口中，选择 0 仅执行腿部分割，或选择 1 在腿部分割的同时包含腿部追踪。

选择包含待追踪视频的逐帧 TIFF 图像的文件夹以及目标文件，然后点击“添加”。接着点击“完成”以启动所选视频的分割与追踪。为检查追踪的准确性并进行误差校正，请点击“选择数据文件夹”，然后选择待追踪的文件夹。

单击“查看跟踪”并检查第一帧中所有腿部的标注。如果某条腿部标注错误需要修正，请单击“暂停查看并调整预测”。在“待调整腿部”面板中，选择需要修正的腿部，然后在图像窗口中双击该腿部的正确位置。

然后点击保存并退出。要处理已分割和已追踪的数据，请点击数据处理。首先，计算所捕获视频的实际视场，以便能够测量门控参数。

在弹出窗口中，输入视频录制的每秒帧数，并输入以毫米为单位计算得出的视野范围。要访问跟踪结果，请打开结果文件夹和跟踪文件夹。如需生成已跟踪果蝇的视频，请选择“生成视频”。

在完成腿部分割、追踪和数据处理后，FLLIT 会自动生成身体及每条腿爪位置的原始数据、20 项步态参数，以及相应的图表和追踪视频。脊髓小脑性共济失调3型（SCA3）的特征表现为共济失调步态，包括身体偏移、落足位置不稳定以及短促突进的步幅。为了表征突变型 SCA3 果蝇的步态，并探究其是否表现出与人类患者相似的步态特征，可对 FLLIT 生成的相关步态参数进行分析。

SCA3-Q84 果蝇表现出更多的转身、步态紊乱（表现为足迹规则性低）以及腿部活动区域重叠增加、腿部活动区域的长度和面积增大、步幅缩短。FLLIT 还可生成视频，显示果蝇在以竞技场为中心和以身体为中心的视角下的追踪轨迹、身体运动轨迹、行进方向，以及每条腿的垂直和侧向位移。与 SCA3-Q27 果蝇相比，SCA3-Q84 果蝇表现出大小不一、相互不规则交叉的腿部活动区域，提示其步态呈突进性、共济失调特征。

身体和腿部爪子位置的原始数据可进一步用于分析特定的感兴趣运动。例如，我们课题组利用FLLIT发现，帕金森病果蝇模型所表现出的僵直表型是由多巴胺能神经元功能障碍引起的。