毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱联用（CE-ICP-MS）系统构建用于铁氧化还原形态（Fe(II)、Fe(III)）的定量分析
2020年5月4日
该铁氧化还原形态分析方法基于毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱，结合样品堆积技术和单次运行中的快速分析。该方法可快速分析多种组织和生物流体样品中的铁氧化还原形态，并提供较低的定量限。
过量的铁会导致产生游离的、具有氧化还原活性的二价铁离子，可在细胞内引发严重损害，例如通过脂质过氧化导致氧化应激及细胞死亡，后者被称为铁死亡（ferroptosis）。对亚铁和高铁离子进行准确定量，是深入理解这些有害过程的关键。该毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱（CE-ICP-MS）技术兼具快速分析和低检测限的优势，而这两种特性对于铁氧化还原物种的定量均至关重要。
首先选择一个自吸液体积较小的雾化器，并准备好用于安装自制接口的适当部件。使用一个公锥形鲁尔接头将两个三通鲁尔母接头连接起来：将下方三通鲁尔接头左侧端口连接至该公接头，再将该公接头连接至上方三通鲁尔接头的中间接口。接下来，将一段1厘米长的导管套在铂金丝上，并使用一段1厘米长的硅胶管将第一段导管与公鲁尔接头的喷嘴连接起来。
通过旋转螺钉将组件固定至下方三通鲁尔接头的中间连接处。将一段一厘米长的管子推至毛细管出口，并使其位于末端八到九厘米处，然后通过硅胶管将其连接至雄性鲁尔接头的喷嘴。将整个组件穿过上方三通T型接头的横杆，并通过旋转螺钉固定雄性鲁尔接头以及雌性三通鲁尔接头的左端。
然后将25厘米长的硅胶管固定在雄性鲁尔接头的喷嘴上，并将整个组件从下方三通鲁尔接头处固定在横杆底部。将1厘米长的硅胶管紧紧推入雾化器末端上方5毫米处，同时将第二个雄性鲁尔锥形接头插入硅胶管的突出部分。
将带有突出CE毛细管的接口部分移至雾化器的雄性锥形接口处，然后小心地将毛细管穿过雄性锥形接口和雾化器毛细管较宽的部分。如有必要，可通过拧下左侧的雄性鲁尔接头，将带连接管路的鲁尔接头移至所需位置后重新安装，以调节突出毛细管的长度。上方的雌性三通鲁尔接头应紧密地连接到雄性锥形接口上。
完成设置后，继续进行ICP-MS分析。针对三价铁和二价铁的氧化还原物种建立校准曲线。二价铁的检出限为3.1 µg/L，三价铁的检出限为3.2 µg/L，线性范围可达150 µg/L。
SH-SY5Y细胞裂解液的分析显示，由于电导率略高，铁的氧化还原形态迁移速度稍慢。测得三价铁和二价铁的浓度分别为330微克/升和84微克/升，由此得出二价铁与三价铁的比例为0.25。
本方案中最重要的步骤是将突出的毛细管仔细插入安装好的接口，并将其相对于雾化毛细管进行适当定位。本文所介绍的方法可能成为深入研究铁依赖性分子过程的有力工具。需要精心设计的研究来验证二价铁、三价铁的定量分析是否可作为潜在的生物标志物，以识别在神经退行性疾病和癌症背景下易受铁介导致命损伤的组织。
概述
本研究提出了一种利用毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱法（CE-ICP-MS）进行铁氧化还原形态分析的新方法。该技术可实现对多种组织和生物流体中铁氧化还原形态的快速分析及低定量限检测。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 分析化学
背景
- 过量的铁可导致氧化应激和细胞死亡。
- 对亚铁和高铁进行定量测定对于理解这些过程至关重要。
- 铁死亡是一种与铁过载相关的细胞死亡形式。
- 现有方法可能无法提供铁定量所需的灵敏度和速度。
研究目的
- 建立一种快速且灵敏的铁氧化还原态物种定量方法。
- 研究铁定量在神经退行性疾病和癌症中的意义。
- 验证铁定量作为组织损伤生物标志物的潜力。
使用的方法
- 毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱法（CE-ICP-MS）。
- 涉及自制接口组件的样品制备。
- 二价铁与三价铁氧化还原物种的校准曲线。
- SH-SY5Y细胞裂解液中铁浓度测定的分析。
主要结果
- 二价铁和三价铁的检测限分别为 3.1 µg/L 和 3.2 µg/L。
- 线性响应可达 150 µg/L。
- 测得的三价铁浓度为 330 µg/L，二价铁浓度为 84 µg/L。
- 二价铁与三价铁的比值为 0.25。
结论
- 该方法在研究铁依赖性分子过程方面具有广阔前景。
- 精确的实验设置对于获得准确测量结果至关重要。
- 尚需进一步研究以探索铁定量在疾病背景中的作用。
常见问题
行业高管相关性
准确量化铁氧化还原物种（Fe(II)/Fe(III)）对于理解神经退行性疾病和肿瘤发生过程中铁介导的细胞损伤至关重要。毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱法（CE-ICP-MS）能够在复杂的生物基质中快速、灵敏地检测这些物种，有助于在早期阶段排除涉及氧化应激和铁死亡通路的治疗假说中的机制风险。该技术通过为发现阶段项目中的候选分子组合筛选提供定量的、特异于氧化还原状态的生物标志物，从而增强靶点验证的可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可在疾病模型中将铁氧化还原稳态作为治疗假设进行探究。
- 操作价值：提供针对氧化还原的定量读数，以阐明铁诱导细胞死亡的机制通路。
- 预测价值：通过将 Fe(II)/Fe(III) 比值与氧化应激及铁死亡结果相关联，支持基于生物标志物的靶点验证。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪性：检测限低（3.1–3.2 µg/L），线性响应可达150 µg/L，可在稀释后的裂解液和生物流体中实现可靠定量。
- 可重复性：迁移时间精密度<3%，测量精密度为2.2–3.5%，确保化合物筛选结果的一致性。
- 可扩展性：电导率-pH堆叠技术可在不损害分离效果的前提下允许更高的进样体积，提高检测验证的通量。
转化与临床前研究
- 转化连续性：可在SH-SY5Y裂解液和脑脊液（CSF）中检测铁氧化还原物种，将发现结果与疾病相关系统相联系。
- 风险校正决策：回收率准确性（97–105%）及标准加入法验证支持可靠的生物标志物定量，用于决策是否推进（go/no-go标准）。
- 机制性风险降低：通过在临床前模型中直接读取Fe(II)和Fe(III)物种水平，有助于评估铁调控策略。
流程与工作流整合
CE-ICP-MS 方法通过提供氧化还原特异性的定量数据，整合到早期发现工作流程中，为靶点验证和先导化合物识别阶段提供信息，尤其适用于涉及铁依赖性氧化应激的通路。
- 发现生物学：通过物种分辨的定量分析，支持在神经退行性疾病和癌症模型中进行铁代谢失调的假设验证。
- 筛选：凭借低定量限（LOQ）和高精密度，实现检测方法的标准化，有助于可靠评估化合物对铁氧化还原状态的影响。
- 分析：生成基于峰面积的定量结果和迁移时间指标，支持不同条件间的比较及趋势分析。
- 转化研究：通过细胞裂解液和生物流体中可测量的铁物种，与临床前验证相衔接，支持生物标志物的匹配与验证。
- 企业级复用：采用ICP-MS实现平台无关的检测，可扩展至铁以外的多种元素目标，提升长期应用价值。
运营与企业影响
- 科学价值：通过区分 Fe(II) 和 Fe(III) 在氧化应激和铁死亡中的作用，减少机制上的不确定性。
- 操作价值：通过增强堆叠分离和动态反应池模式干扰消除，确保结果的可重复性。
- 战略价值：提供与病理铁状态相关的定量氧化还原生物标志物，从而改善决策判断。
- 组合影响：根据化合物在疾病相关模型中对铁形态分布的影响，实现基于风险调整的化合物优先排序。
实施注意事项
- 需要具备毛细管电泳系统搭建以及ICP-MS优化的专业知识，特别是使用NH3反应气的DRC模式。
- 依赖于毛细管电泳毛细管与雾化器之间稳定接口组件，以维持信号完整性并防止发生氧化还原偏移。
- 需在不同实验团队间统一背景电解质（20 mM HCl）和电压（+25 kV）等参数，以确保结果的可重复性。
- 对于电导率可变的样品（如脑脊液），需采用标准加入法确认峰的归属，方法需相应调整。
- 实际局限性：该方法对样品基质效应较为敏感，因此在复杂生物流体中进行准确定量时，需进行稀释或标准化处理。
