通过预置等电聚焦（IEF）方法，将生物活性小分子、肽与天然来源和蛋白质从微生物中分离出来
2020年6月14日
目标是通过使用液相同电聚焦（IEF）方法，分馏和分离生物活性小分子、复杂植物提取物中的肽和致病微生物中的蛋白质。此外，分离的分子被识别，其生物活性得到确认。
我们的协议描述了植物提取物中活性分子分离和纯化的新发现。科学家可以使用这些方法将小分子和肽从天然产品来源分离给治疗使用者。熟悉仪器部件及其装配方法。
请务必确保要分离的样本由建议的准则编写。此方法涉及仪器的多个装配过程。视觉演示将帮助用户跟踪并成功地将其应用于研究。
组装液相后，IEF单元如说明书所述，将阳离子交换膜与0.1摩尔氢氧化钠和阳离子交换膜与0.1摩尔磷酸平衡。对齐橡胶垫片，使三个大长方形孔保持橡胶疏通。这将有助于在电泳期间通过膜在电极和样品室之间交换离子。
通过对齐离子交换垫片中的三个长方形孔，组装电极的内侧和外侧。然后用各自的电解质填充电极，以防止其膜干燥。接下来，拧紧塑料螺钉支架，以确保无泄漏组件。
用密封胶带盖住样品收集板。接下来，将聚焦室的部件按以下顺序组装在陶瓷冷却手指上:阳极电极、尼龙膜芯、聚焦室和阴极电极。使用 50 毫升注射器，将聚焦室充满预冷却蒸馏水。
对于标准 IEF 电池，加入 60 毫升水。将 IEF 装置连接到四摄氏度的循环冷却水。以 15 瓦和 3000 伏运行装置，直到电压稳定，大约 3 到 5 分钟。
然后，关闭电源。使用分数收集器，从单元格中去除水。用密封胶带重新密封收集板。
加入0.6克金尼玛西尔维斯特植物提取物，到60毫升蒸馏水。在辊管中混合五分钟，溶解植物提取物。要去除不溶性颗粒，请将溶液在10，000倍G下离心5分钟。
将上半液转移到 150 毫升玻璃烧杯中，并加入安磷酸盐，按体积（约 0.6 毫升）创建 1% 溶液。使用 50 毫升注射器和 1.5 英寸 19 量表钝端针，通过样品采集板将该溶液加载到 IEF 电池中。然后从支架上取下电池，然后轻点电极室，以清除并清除任何气泡。
将设备连接到冷却水。随着电源恒定的 15 瓦开始分馏。运行 IEF 单元，直到电压达到恒定值（大约三个小时）。
按下"收获"按钮后，将分数收集器引脚与收集板对齐。将针脚穿过密封胶带，开始收集金尼玛西尔维斯特分数。在30摄氏度下在30摄氏度下生长一个C.albicans和酵母辣椒汤的单个殖民地。在震动下。
将培养素转移到离心管中，以10000次G离心收集酵母细胞，5分钟。取出上经剂后，将酵母细胞悬浮在缓冲液中，并在滚管中旋转悬浮液一小时，温度为5摄氏度。要去除酵母细胞，将悬浮液在10，000次G下离心5分钟。
然后通过0.45微米过滤器过滤蛋白质提取物。将蛋白质提取物转移到透析管中，在4摄氏度下对水进行透析15小时。在估计蛋白质浓度后，收集含有500毫克总蛋白质的蛋白质提取物。
在60毫升水中稀释500毫克蛋白质，体积含1%的磷酸。使用注射器将稀释的蛋白质提取物加载到 IEF 细胞中，并在恒定的 15 瓦下操作装置 4 小时。由于此仪器使用高压电源，因此用户必须采取一切预防措施，避免与带电电极直接接触。
分数收集器包含 20 个塑料管，每根 12 毫米由 75 毫米。它连接到真空泵。通过按下按钮上的收获准备收集分数。
然后将分数收集器上的 20 个收集引脚与 20 个收集板对齐，以便密封对焦单元。将收集销通过密封胶带，同时打开真空泵。每个管子将收集大约三毫升的蛋白质分数。
在减少和煮沸蛋白质分数后，在12.5%SDS页面凝胶上分析它们。用库马西蓝色染料染色凝胶，并在室温下放在摇杆上。两到三个小时后，将凝胶淡化。
然后使用凝胶成像器记录凝胶图像。在RPMI细胞培养基中以1:1000的比例稀释C.albicans的隔夜培养，并辅以50毫摩尔葡萄糖，准备酵母细胞悬浮液。将 90 微升的电池悬浮液添加到 96 井板的每个井中。
接下来，将每个 G.sylvestre 分数的 10 微升添加到单独的井中。作为负对，将10微升水与1%的磷酸盐加到单独的井中。在37摄氏度下孵育96井板12小时后，在显微镜下观察该板。
缺乏纤维生长表明C.albicans酵母到催眠转化的抑制。通过液相 IEF 获得 20 部分 G.sylvestre 提取物。深色分子，健身房酸，迁移到和丰富在单位的阳极端。
在阴极端观察到半透明浅黄色分数。每个 G.sylvestre 折射的等量通过 SDS 页面减少、煮沸和解析。库马西蓝色污渍显示不同的多肽带在约5千陀吨，丰富在分数16至19。
第一分数中的金酸和接下来的几分之一没有检测到，因为它们不是蛋白质。然而，这些分子可以通过TLC分离，并在紫外光下检测。分数10不包含这些小分子的可检测量，这表明大多数有机小分子在一到三分数中被丰富。
所有20G.sylvestre分数被检测为抑制酵母到催眠转化和催眠生长在C.albicans。在分数 1 中观察到最大的抑制，在分数 10 及以上观察到很少或没有抑制。使用液相 IEF 对来自 C.albicans 的细胞表面蛋白进行分馏。
SDS 页面分析了 18 个分数的等分。丰富的蛋白质在几个分数中可见。开始时，小分子不能通过等电聚焦来分离，因为它们被认为是非流动的。
我们的研究表明，它们是流动的，至少每周一次，而且这种方法可以进一步探索其他小分子。
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概述
本协议概述了使用液相等电点聚焦（IEF）从复杂植物提取物中分离和纯化生物活性分子的方法。它为分离小分子和肽以用于治疗应用提供了详细的方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 天然产物
背景
- 植物中的活性分子具有治疗潜力。
- 分离技术对药物开发至关重要。
- 液相等电点聚焦（IEF）是一种有效的分离方法。
- 适当的样品准备对成功结果至关重要。
研究目的
- 分离和分离生物活性小分子和肽。
- 识别分离的分子并确认其生物活性。
- 为该领域的研究人员提供可靠的协议。
所用方法
- 用于分离的液相等电点聚焦（IEF）。
- 根据建议的指南准备样品。
- 组装仪器组件以进行有效操作。
- 视觉演示以帮助应用协议。
主要结果
- 成功分离小分子和肽。
- 确认分离的分子的生物活性。
- 证明了IEF方法的有效性。
- 为研究人员提供了一个全面的协议。
结论
- IEF方法是分离生物活性化合物的有价值工具。
- 本协议可以促进使用天然产物的治疗研究。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上进行药物开发。
常见问题
Executive Industry Relevance
Preparative liquid-phase isoelectric focusing (IEF) offers a cost-effective alternative to high-performance chromatography for isolating bioactive small molecules and peptides from complex natural product extracts. This method enables fractionation based on isoelectric point, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in drug discovery workflows. By providing reproducible separation of terpenoid saponins and polypeptides, it enhances predictive confidence in lead identification from plant and microbial sources.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating bioactive fractions from Gymnema sylvestre extract.
- Operational Value: Supports biological de-risking through fractionation of terpenoid saponin small molecules and a 5 kDa peptide.
- Strategic Value: Facilitates portfolio triage by enriching active compounds in early fractions (1–3) showing antifungal inhibition.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological fractions for downstream screening, as demonstrated by inhibition of Candida albicans yeast-to-hypha conversion.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible IEF fractionation yielding 20 defined fractions.
- Strategic Value: Enhances screening readiness by isolating ampholyte-soluble small molecules and peptides amenable to further analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant system application using Candida albicans as a model for antifungal target validation.
- Operational Value: Provides translational continuity from discovery through fractionation of cell surface proteins and bioactive molecules.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement by linking fractionated outputs to measurable phenotypic inhibition.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling fractionation of natural extracts prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via separation of bioactive molecules based on pI.
- Screening: Delivers assay-ready fractions with quantitative outputs suitable for compound evaluation in antifungal assays.
- Analytics: Generates SDS-PAGE and TLC-compatible fractions for molecular characterization and bioactivity correlation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through fractionation of microbial proteins and plant-derived inhibitors.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for fractionation of diverse natural product sources beyond Gymnema sylvestre and Candida albicans.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in natural product fractionation.
- Operational Value: Delivers standardization and scalability through defined voltage, wattage, and fractionation parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking fraction enrichment to bioactivity in phenotypic assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of fractions showing inhibition of pathogenic yeast morphogenesis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophoresis, sample preparation, and fraction handling.
- Needs IEF unit with cooling system, fraction collector, and compatible electrodes.
- Demands standardization across teams for consistent ampholyte loading and membrane equilibration.
- Involves adaptation considerations for varying sample types, including plant extracts and microbial protein suspensions.
- Limited to ambulatory molecules; non-ionic or non-amphoteric compounds may not separate effectively.
