通过制备型等电聚焦（IEF）方法分离天然来源的生物活性小分子、多肽及微生物蛋白

本方案描述了从植物提取物中分离和纯化活性分子的新发现。科研人员可利用这些方法从天然产物来源中分离小分子和多肽，用于治疗用途。请熟悉仪器的组件及其组装方法。

必须确保待分离样品是按照建议的指南进行制备的。该方法涉及仪器的多个组装步骤，而可视化演示将有助于用户理解并成功将其应用于研究中。

按照说明书所述组装液相等电聚焦装置后，用 0.1 摩尔氢氧化钠平衡阴离子交换膜，用 0.1 摩尔磷酸平衡阳离子交换膜。调整橡胶垫圈的位置，使三个较大的椭圆形孔不被橡胶堵塞。这有助于在电泳过程中通过膜实现电极室与样品室之间的离子交换。

通过将离子交换垫圈上的三个椭圆形孔对齐，组装电极的内层和外层部分。然后向电极中加入各自的电解液，以防止其膜干燥。接着，拧紧塑料螺钉固定件，确保组装后无泄漏。

用封口膜覆盖样品收集板。接下来，按照以下顺序将聚焦室的各部件组装到陶瓷冷却指上：阳极电极、尼龙膜芯、聚焦室和阴极电极。使用50毫升注射器，将预冷的蒸馏水注入聚焦室中。

对于标准的等电聚焦电泳槽，加入 60 毫升水。将等电聚焦装置连接至 4 °C 的循环冷却水。以 15 瓦和 3000 伏电压运行装置，直至电压稳定，大约需要 3 至 5 分钟。

然后，关闭电源。使用组分收集器将细胞中的水去除。用封口胶带重新密封收集板。

将 0.6 克匙羹藤（Gymnema sylvestre）植物提取物加入 60 毫升蒸馏水中。通过滚轴混匀器混合 5 分钟，使植物提取物溶解。为去除不溶性颗粒，将该溶液在 10,000 ×g 条件下离心 5 分钟。

将上清液转移至一个150毫升的玻璃烧杯中，加入两性电解质，配制成体积分数为1%的溶液，约0.6毫升。使用带有1.5英寸19号钝端针头的50毫升注射器，通过样品收集板将此溶液加入等电聚焦电泳（IEF）细胞中。然后从支架上取下电泳池，轻敲电极室以松动并去除任何气泡。

将仪器连接至冷却水。将电源功率保持在15瓦，开始进行分级分离。运行等电聚焦（IEF）仪，直至电压达到稳定值，大约需要三小时。

按下收集按钮后，将馏分收集器的针头与收集板对齐。将针头穿过密封胶带，开始收集匙羹藤（Gymnema sylvestre）的馏分。在30°C条件下，于沙氏葡萄糖液体培养基中振荡培养白色念珠菌（C. albicans）单菌落及酵母，过夜培养。

将培养物转移至离心管中，在10,000 × g条件下离心5分钟，收集酵母细胞。去除上清液后，将酵母细胞重悬于缓冲液中，于4摄氏度在滚轴混合仪上旋转孵育1小时。为去除酵母细胞，将悬液在10,000 × g条件下离心5分钟。

然后将蛋白质提取物通过0.45微米滤膜过滤。将蛋白质提取物转移至透析袋中，在4摄氏度下对水透析15小时。在测定蛋白质浓度后，收集含有500毫克总蛋白的蛋白质提取物体积。

将500毫克蛋白质溶于60毫升含1%（体积比）两性电解质的水中。使用注射器将稀释后的蛋白质提取物加入等电聚焦电泳（IEF）细胞中，并以恒定15瓦功率运行4小时。由于该仪器使用高压电源，操作者必须采取所有预防措施，避免与带电电极直接接触。

收集器包含20个塑料管，每个尺寸为12毫米×75毫米。它与真空泵相连。通过按下“开始收集”按钮，准备收集各组分。

然后将馏分收集器上的20个收集针与20孔收集板对齐，使其对准密封的聚焦细胞。将收集针穿过密封膜，同时打开真空泵。每个试管将收集约三毫升的蛋白质组分。

将蛋白质组分进行还原和煮沸处理后，在12.5% SDS-PAGE凝胶上进行分析。用考马斯亮蓝染料染色凝胶，并在室温下置于摇床上。染色后两至三小时进行脱色处理。

然后使用凝胶成像仪记录凝胶图像。通过将白色念珠菌（C.albicans）的过夜培养物以1:1000的比例稀释于添加了50毫摩尔葡萄糖的RPMI细胞培养基中，制备酵母细胞悬液。将90微升细胞悬液加入96孔板的每个孔中。

接下来，将每种G. sylvestre组分各10 µL分别加入不同的孔中。作为阴性对照，将含1%两性电解质的10 µL水加入不同的孔中。将96孔板在37°C孵育12小时后，在显微镜下观察孔板。

缺乏丝状生长表明抑制了白色念珠菌的酵母到菌丝的转化。通过液相等电聚焦从森林匙羹藤提取物中获得了二十个组分。深色分子（即匙羹藤酸）迁移至装置的阳极末端并在此富集。

在阴极末端观察到半透明的淡黄色组分。取每份G. sylvestre折射组分等分试样，经还原、煮沸后进行SDS-PAGE分离。考马斯亮蓝染色显示，在第16至19组分中富集了一条约五千道尔顿的多肽条带。

由于第一组分及随后的几个组分中的 gymnemic 酸并非蛋白质性质，因此未能被检测到。然而，这些分子可通过薄层色谱（TLC）进行分离，并在紫外光下检测。第10组分中未检测到可测含量的这些小分子，表明大多数有机小分子富集于第一至第三组分中。

对全部20个G.sylvestre组分进行了抑制C.albicans酵母相向菌丝相转化及菌丝生长的活性检测。其中，第一组分的抑制作用最强，而第10组分及以上则几乎没有或未观察到抑制作用。利用液相等电聚焦电泳（IEF）对C.albicans的细胞表面蛋白进行了分离分组。

取18个组分的等分试样，通过SDS-PAGE进行分析。在多个组分中可见富集的蛋白质。起初，小分子无法通过等电聚焦分离，因为它们被认为不具有迁移性。

我们的研究表明，它们具有活动能力，至少每周一次，该方法可进一步用于其他小分子的探索。