使用纳米流体技术的单体和散装 C. 电子样品 中的高通量定量 RT-PCR
May 28th, 2020
本文描述了一个高通量协议，用于快速、可靠地确定单个或批量 C.elegans 样本中的基因表达水平。此协议不需要 RNA 隔离，并且直接从样品中生成 cDNA。它可以与高通量多路复用纳米流体实时 qPCR 平台一起使用。
我们的方案提高了直接从单个或小批量样品中获取 RT-qPCR 数据的通量和时间效率，而无需分离 RNA。使用该方案，只需两天的工作台工作即可获得超过 9， 000 个 RT-qPCR 结果，使用标准 96 孔 qPCR，这一过程通常需要大约五周时间。该方案在秀丽隐杆线虫中提供了更快、更稳健且高灵敏度的 RT-qPCR 检测，非常适合监测同基因蠕虫之间基因表达的个体间变异性。
首先将蠕虫从细菌草坪上挑选到新鲜的未播种线虫生长培养基板上，让蠕虫在板周围移动 5 分钟。当蠕虫适应时，在无 RNase 的通风橱中，将 10 微升裂解缓冲液与每个样品 1 至 100 Dnase I 混合，并将 PCR 试纸条的盖子倒置在解剖镜的平台上。接下来，将 10 微升裂解混合物添加到圆顶 PCR 管盖中，并从板中舀出蠕虫，以避免将细菌转移到盖子的每个槽中。
转移完所有蠕虫后，盖上盖子并旋转试管 5 秒钟，然后将试管放入液氮杜瓦瓶中。最后 5 秒后，在 40 摄氏度的水浴中解冻试管，然后再重复冻融程序 9 次。在最后一次冻融循环后，将裂解的样品在热混合器上以 4 摄氏度和每分钟约 1800 转的速度混合 20 至 30 分钟。
在混合孵育结束时，如图所示旋转样品，并向每个试管中加入 1 微升新鲜解冻的终止液。对于大量温样品的逆转录，在无 RNase 的通风橱中，制备酶缓冲液预混液，并将 14 μL 预混液添加到每个样品的 11 μL 中。使用指定的逆转录程序通过热循环仪运行样品，并在无核酸酶的水中以 1：4 的比例稀释所得的 cDNA 产物。
对于靶标特异性预扩增，在 96 孔板的每个样品中向一个孔中加入 3.75 μL 预扩增预混液，并向预混液的每个孔中加入 1.25 μL 的每种 cDNA 溶液。加载完所有样品后，用密封胶带盖住板并短暂涡旋样品，然后通过离心将其旋转下来，然后将板加载到热循环仪上并按照指示运行程序。要从预扩增中去除未掺入的引物，请在热循环结束时离心样品板并小心地取下密封件。
向每个预扩增反应中加入 2 μL 核酸外切酶 I 预混液，然后重新密封、离心并将板装回热循环仪中。在循环结束时，用 18 微升 Tris-EDTA 缓冲液稀释样品。要设置多阵列芯片，请在 384 孔板中的每个样品中将 3.6 微升测定加载预混液和 0.4 微升 50 微摩尔正向反向引物添加到一个孔中。
然后将 2.2 μL 样品预混液和 1.8 μL I 处理过的每种预扩增核酸外切酶加入板的相应孔中。要构建单阵列芯片，将 5.4 微升测定加载预混液和 0.6 微升正向反向引物添加到第二个 384 孔板的每个样品的一个孔中，然后将 3.3 微升样品预混液和 2.7 微升每个预扩增核酸外切酶 I 处理的样品添加到制备的单阵列板的相应孔中。为了在第一次运行中灌注纳米流体芯片，将芯片缓慢地保持在 45 度角，并小心地将 150 微升控制管路流体注入芯片的蓄能器中。
加载完所有液体后，撕下芯片底部的蓝色保护膜，将芯片放入纳米流体 PCR 引物机中，条形码朝外。然后运行 Prime（153x） 脚本。灌注后，将芯片放在黑暗的表面上，当加载每个分析或样品混合物时，如有必要，请取下相应的屏障塞，并根据实验计划将适当体积的分析或样品混合物添加到纳米流体芯片的相应入口中。
加载后，将芯片放入纳米流体热循环仪中，并在数据收集软件中运行适当的协议。如果未使用整个多阵列芯片，请执行后脚本运行以允许下游使用剩余的芯片阵列。为了测试 worm-to-Ct 方案是否是一种有效的 cDNA 提取方法，将该方法与标准硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取方法进行了比较。
在全球范围内，使用苯酚-氯仿和蠕虫到 Ct 方法时，每 100 ng 总 RNA 的 hsp-70 mRNA 表达水平相当。然而，在 hsp-70 表达最高的情况下，worm-to-Ct 方法的表达更高，表明敏感性更高。对于大宗样品的硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取，hsf-1 突变体中的 hsp-70 与对照相比降低了 82.7%，温热至 CT 的 hsp-70 降低了 92.3%，表明两种方法之间的降低相当。
使用从 25 条蠕虫的大量样品或平均 36 个单蠕虫样品中获得的 cDNA，该方法检测到所有测试的伴侣蛋白的表达水平相当，表明从单个蠕虫获得的参数是可靠的。这里显示了短暂热休克后来自单个蠕虫的多个 hsp 转录物的平均表达。据观察，转录本表达的变异性在不同基因之间差异很大。
对于使用单个蠕虫样本测试的每个转录本，技术变异系数低于生物学变异系数，表明在对单个蠕虫进行 qPCR 时，参数估计不需要技术一式三份。执行此方案时，必须准确移液小体积，而不是反向移液到纳米流体芯片中。该协议可用于获得大量 RT-qPCR 数据，然后可以使用 Excel 或 R 脚本根据需要导出和处理这些数据。
概述
本文介绍了一种高通量协议，用于快速、可靠地确定秀丽隐杆蚯蚓样本中基因表达水平，无需RNA分离。该方法允许直接从样本中生成cDNA，便于使用多重纳米流体实时qPCR平台。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 分子生物学
背景
- 传统的RT-qPCR方法需要RNA分离，这是一个耗时的过程。
- 高通量技术可以显著减少基因表达分析所需的时间。
- 秀丽隐杆蚯蚓是遗传学研究中广泛使用的模式生物。
- 监测基因表达变异对于理解生物过程至关重要。
研究目的
- 开发一种更快、更有效的秀丽隐杆蚯蚓基因表达分析协议。
- 比较新方法与标准RNA提取技术。
- 评估从单条蚯蚓获得的基因表达数据的可靠性。
使用的方法
- 不进行RNA分离直接裂解秀丽隐杆蚯蚓样本。
- 使用热循环混合器进行样本制备。
- 使用多重纳米流体实时qPCR进行基因表达分析。
- 将结果与传统的硫氰酸铵-苯酚-氯仿提取方法进行比较。
主要结果
- 在两天内可以获得超过9,000个RT-qPCR结果。
- 新协议显示出对检测基因表达的更高灵敏度。
- 单条蚯蚓的表达水平可与整体样本相比较。
- 单条蚯蚓样本中的技术变异性低于生物变异性。
结论
- 开发的协议提高了基因表达分析的吞吐量和效率。
- 它提供了可靠的数据以监测基因表达变异性。
- 该方法适用于遗传研究中的高通量应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This high-throughput RT-qPCR protocol enables rapid, sensitive gene expression profiling in C. elegans without RNA isolation, addressing a key bottleneck in target validation workflows. By reducing processing time from weeks to days, it supports faster hypothesis testing and mechanistic de-risking in early discovery. The ability to quantify interindividual variability in isogenic populations enhances predictive confidence for phenotypic screening and lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of therapeutic hypotheses by measuring gene expression changes in single organisms, clarifying pathway involvement and target relevance.
- Operational Value: Eliminates RNA isolation steps, increasing throughput and reducing hands-on time for target validation assays.
- Predictive Value: Provides quantitative, reproducible expression data from single worms, supporting biological de-risking and portfolio triage based on target modulation confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, high-density expression data (up to 9,216 reactions) suitable for assay optimization and hit confirmation in phenotypic screens.
- Operational Value: Compatible with nanofluidic platforms, enabling scalable, reproducible quantitative outputs for compound effect assessment.
- Assay Readiness: Produces cDNA directly from lysates, streamlining sample preparation for downstream high-throughput qPCR workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment by quantifying chaperone and stress-response gene expression across single and bulk samples, relevant to disease models.
- Preclinical Modeling: Enables consistent expression tracking in C. elegans, a validated system for neurodegenerative and metabolic disorder research.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates go/no-go decisions by providing sensitive, variability-aware expression readouts that reflect biological heterogeneity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling rapid expression profiling to inform compound selection and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying target engagement and downstream effects in genetic models.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative expression data with high reproducibility, enabling reliable compound evaluation in multiplexed formats.
- Analytics: Generates precise Ct values and expression ratios that allow statistical comparison of conditions and interindividual variability assessment.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through disease-relevant gene panels (e.g., heat shock proteins) with demonstrated sensitivity and specificity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable gene expression platform applicable across multiple targets, strains, and experimental conditions in discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing technical noise and capturing biological variability in isogenic populations.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through automation-compatible nanofluidic integration and reduced sample processing steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by accelerating gene expression analysis timelines, enabling faster iteration in lead optimization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing sensitive, variability-informed expression metrics for target advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology techniques, including lysis, reverse transcription, and preamplification workflows.
- Dependent on access to nanofluidic PCR platforms and compatible thermocycling equipment for high-throughput execution.
- Necessitates standardized sample handling and pipetting precision for small-volume transfers to ensure assay reproducibility.
- Involves cross-team coordination between biology and analytics groups for consistent sample tracking and data interpretation.
- Limited by the need for careful fluid handling to avoid contamination or bubble formation in nanofluidic chip loading steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Worm-to-CT Worm Lysis
2:08
Reverse Transcription (RT) for Bulk Samples
2:38
Target Specific Preamplification
3:19
Exonuclease I Treatment
3:53
Sample Mix Preparation
4:48
Nanofluidic Chip Priming and Loading
6:00
Results: Representative Worm-to-CT Analysis
7:45
Conclusion
