Name: 质谱分析，用于识别 EYFP 标记 CENP-A （EYFP-CENP-A） 的泛化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 了解利用质谱分析技术鉴定EYFP标记CENP-A蛋白泛素化位点的方法。本研究通过免疫沉淀结合质谱分析，揭示K124R突变体中赖氨酸306位点的泛素化修饰，为理解着丝粒组装机制及细胞活力调控提供重要依据。

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我们感谢南京大学模式动物研究所的Chao-Jun Li提供的质谱分析。感谢Yanmini Dalal、Tatsuo Fukagawa以及南京大学模式动物研究所和Greehey儿童癌症研究所的现任研究人员在讨论、实验指导和试剂方面提供的帮助。感谢Don W. Cleveland、Daniele Fachinetti、Yanmini Dalal、Minh Bui、Gustavo W. Leone、John Thompson、Lawrence S. Kirschner、Amruta Ashtekar、Ben E. Black、Glennis A. Logsdon、Kenji Tago和Dawn S. Chandler慷慨提供试剂。Y.N.的研究得到了江苏省“双一流”建设基金、江苏省自然科学基金（SBK2019021248）以及江苏省16th 六项重大人才高峰基金（TD-SWYY-001）、江苏省“海外专家百人计划”基金（SBK2019010048）和国家自然科学基金（31970665）。本研究部分由美国国家癌症研究所资助项目R21 CA205659支持。

<ol><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li>
<li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li>
<li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li>
<li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment%2C+Maintenance%2C+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li>
<li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+CENP-A%3A+marks+of+distinction%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li>
<li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li>
<li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482(2015).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732(2016).</li>
<li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetratrico+peptide+repeat+interactions%3A+to+TPR+or+not+to+TPR%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li>
<li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li>
<li>Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

本文描述了采用质谱分析方法鉴定EYFP-CENP-A K124R突变体的泛素化修饰，结果表明EYFP标签可能导致CENP-A K124R突变蛋白在另一个赖氨酸位点发生泛素化8。在我们的研究结果中，通过质谱分析成功鉴定了EYFP-CENP-A K124R蛋白中赖氨酸306（K306）的泛素化修饰，该位点对应于CENP-A中的赖氨酸56（K56）。此处描述的质谱分析方法是一种模拟我们先前鉴定CENP-A WT-Flag中赖氨酸124（K124）泛素化位点的方法12。因此，该方法可适用于带有不同标签的人源CENP-A蛋白以及其他着丝粒-动粒蛋白。基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的质谱分析已被广泛用于鉴定多种蛋白质潜在的翻译后修饰（PTMs）。我们整合的多种实验与分析方法（包括体内泛素化实验、克隆生长实验和质谱分析）可推荐给希望研究其目标蛋白泛素化功能作用的研究人员。
然而，本方案并未涵盖在活细胞或整个细胞周期中特定单个细胞内检测泛素化条带和/或鉴定这些蛋白质位点特异性泛素化的方法。近...

在大多数真核生物中，纺锤体微管必须与每条染色体上的一个特定区域结合，该区域称为着丝粒。动粒是由位于着丝粒处的多种蛋白质组成的复合物。研究着丝粒和动粒蛋白的运动时序以及动粒和着丝粒的结构，对于理解染色体不稳定性（CIN）和癌症进展具有重要意义。关键科学问题在于：染色体上着丝粒的位置及其功能（即着丝粒身份）是如何确定的，以及它们如何参与染色体的准确分离。在大多数物种中，着丝粒身份由一种含有特殊组蛋白样蛋白CENP-A的核小体的存在所决定。因此，人们认为CENP-A是着丝粒身份的非DNA决定因素（表观遗传标记）。阐明CENP-A如何在人类中定义着丝粒身份的机制至关重要。
Holliday连接识别蛋白（HJURP）是一种CENP-A特异性分子伴侣，可将CENP-A沉积至着丝粒核小体中1,2,3。我们先前报道过，CUL4A-RBX1-COPS8 E3连接酶对于CENP-A在赖氨酸124位点（K124）的泛素化以及着丝粒定位是必需的4。此外，我们的研究结果表明，新合成CENP-A向着丝粒的招募依赖于预先存在的泛素化CENP-A5。因此，我们提出了一种模型，认为CENP-A的泛素化状态通过细胞分裂间的二聚化作用得以遗传。
与我们的研究结果以及Yu等人的研究结果相反，最近有文章发表了关于CENP-A及其着丝粒定位的阴性结果6。该文章声称，基于其阴性结果——即K124R突变对CENP-A着丝粒定位和细胞活力均无影响——赖氨酸124（K124）位点的CENP-A修饰对于人类着丝粒的建立、维持及长期功能并非必需6。然而，该研究的结果与结论仍存在充分的讨论空间，我们已在先前的出版物中描述了其前一篇论文中可能存在的问题7。值得注意的是，他们在实验中将CENP-A与分子量远大于内源性CENP-A的蛋白进行了融合：例如，他们将约30 kDa的增强型黄色荧光蛋白（EYFP）与约16 kDa的CENP-A融合，并在RPE-1 CENP-A-/F基因敲除系统中分析了EYFP-CENP-A K124R融合蛋白。根据结构预测，K124位点的泛素化并不预期直接与HJURP结合4；然而，单泛素化的添加预计会影响CENP-A的蛋白构象。大分子融合蛋白的存在可能改变CENP-A的构象，而这种构象变化可能掩盖了因去泛素化所引起的结构改变。我们推测，大分子蛋白的融合可能诱导EYFP-CENP-A K124R突变体在K124以外的赖氨酸位点发生泛素化，而该位点的泛素化会抑制或掩盖K124R单突变体的原始表型。我们此前的研究已报道过，在带有大标签蛋白（EYFP）的CENP-A K124R突变体中，泛素化可发生在其他赖氨酸位点8。研究发现，EYFP标签的引入会诱导EYFP-CENP-A K124R另一赖氨酸位点的泛素化，并使该突变体能够与HJURP结合。因此，这种在其他位点的泛素化抑制或掩盖了K124R单突变体的原始表型，导致EYFP-CENP-A野生型和K124R突变体均表现出着丝粒定位（我们同时使用并比较了pBabe-EYFP-CENP-A野生型、K124R突变体以及pBabe-EYFP对照）。实验结果表明，Flag标签化或无标签的CENP-A K124R突变体具有致死性，但可通过单泛素融合得以挽救，提示CENP-A的泛素化对细胞存活至关重要。
近年来，许多研究开发了不同的检测方法，用于鉴定 CENP-A 蛋白及其他着丝粒-动粒蛋白在体内和体外的翻译后修饰（PTMs）9,10,11。与组蛋白的翻译后修饰类似——后者是调控染色质功能的主要机制之一，着丝粒染色质组分的翻译后修饰也参与调控着丝粒整体结构与功能的关键机制。大多数 CENP-A 的 PTM 位点特异存在于含 CENP-A 的核小体中，尽管其中少数位点在组蛋白 H3 中保守存在，这表明这些残基的修饰有助于实现着丝粒特异的功能。已有研究报道 CENP-A 存在磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化等多种翻译后修饰9，提示 CENP-A 的氨基末端及C端组蛋白折叠结构域可发生多种 PTMs 及其组合修饰。多个研究团队（包括我们自己的团队）已揭示 CENP-A 修饰在多种功能中的重要性，这些功能包括 CENP-A 在着丝粒上的沉积、蛋白稳定性以及 CCAN（组成型着丝粒相关网络）的招募9。然而，目前针对 CENP-A PTMs 的研究仍较为有限，且鲜有研究将其与经典组蛋白（可直接或间接调控其功能）进行比较分析。此外，专注于鉴定这些 CENP-A PTMs 方法学的技术性报告也十分有限。
由于CENP-A的泛素化修饰对于CENP-A在着丝粒上的沉积至关重要12，且该过程通过细胞分裂期间的二聚化作用遗传5，并对于细胞存活不可或缺8，因此，鉴定CENP-A泛素化的方法对未来研究着丝粒的功能活性、定位及结构具有重要意义。因此，本文描述了通过质谱分析鉴定EYFP-CENP-A K124R突变体的泛素化修饰，结果提示EYFP标签可能导致CENP-A K124R突变蛋白在另一个赖氨酸位点发生泛素化修饰8。此外，还提供了其他对照实验与分析方法（免疫荧光分析、克隆形成实验以及体内泛素化实验）的操作方案，以全面讨论质谱分析的主要结果。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器/工具&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 蛋白低吸附管</td><td>Eppendorf</td><td>022431064</td><td>用于质谱分析</td></tr><tr><td>10 cm 细胞培养皿</td><td>BIOFIL/JET，中国</td><td>700224</td><td>10 cm 组织培养皿（Yohei 实验室，PN63）</td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>6 孔培养板</td></tr><tr><td>CentriVap</td><td>LABCONCO</td><td>-</td><td>台式真空浓缩仪，用于质谱分析前肽段的真空干燥</td></tr><tr><td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &amp;mu;m</td><td>Eksigent Technologies</td><td>805-00120</td><td>用于质谱分析的液相色谱（RPLC）柱</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x 油镜</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td><td>100X 油浸物镜</td></tr><tr><td>HCX PL APO 63x 油镜</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td><td>63X 油浸物镜</td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF 转膜膜</td><td>EMD Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>用于 Western 印迹</td></tr><tr><td>Leica DM IRE2 电动荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>-</td><td>电动荧光显微镜</td></tr><tr><td>Leica EL6000 紧凑型光源</td><td>Leica</td><td></td><td>荧光激发用外置光源</td></tr><tr><td>显微盖玻片（22 mm x 22 mm）</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>盖玻片（22 mm x 22 mm）</td></tr><tr><td>Model V16-2 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置</td><td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td><td>31071010</td><td>凝胶电泳装置 I，用于较大尺寸 SDS-PAGE 凝胶</td></tr><tr><td>nanoLC.2D</td><td>Eksigent Technologies</td><td>-</td><td>用于质谱分析的液相色谱系统</td></tr><tr><td>NuPAGE 4%-12% Bis-Tris 蛋白凝胶</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP0335BOX</td><td>市售的 4%-12% Bis-Tris 蛋白凝胶，用于质谱分析</td></tr><tr><td>Olympus FLUOVIEW FV3000 共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Olympus</td><td>-</td><td>共聚焦激光扫描显微镜（https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519）</td></tr><tr><td>ORCA-R2 数字 CCD 相机</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600-10B</td><td>CCD 相机</td></tr><tr><td>PAP Pen</td><td>Binding Site</td><td>AD100.1</td><td>用于免疫荧光染色中的防水屏障</td></tr><tr><td>TISSUE CULTURE DISHES 10CM</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td>10 cm 组织培养皿</td></tr><tr><td>垂直电泳装置（大尺寸）</td><td>Junyi，中国</td><td>JY-SCZ6+</td><td>凝胶电泳装置 II，用于较大尺寸 SDS-PAGE 凝胶（Yohei 实验室，PE23）</td></tr><tr><td>VWR 显微载玻片，磨砂</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>显微载玻片</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗 CENP-A 抗体</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>小鼠单克隆抗体</td></tr><tr><td>抗 CENP-B 抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>小鼠单克隆抗体</td></tr><tr><td>抗 GAPDH 抗体</td><td>ABCAM</td><td>ab37168</td><td>兔多克隆抗体</td></tr><tr><td>抗 GAPDH 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>PA1987</td><td>兔多克隆抗体</td></tr><tr><td>抗 GFP 抗体</td><td>ANTI #76（实验室自制抗体）</td><td></td><td>兔多克隆抗体</td></tr><tr><td>抗 HA (3F10)</td><td>Roche</td><td>11815016001</td><td>大鼠单克隆抗体</td></tr><tr><td>抗 HJURP 抗体</td><td>Proteintech Group</td><td>15283&amp;ndash;1-AP</td><td>兔多克隆抗体</td></tr><tr><td>抗泛素抗体</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-317A-1</td><td>兔多克隆抗体</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 蛋白检测试剂</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>商用蛋白检测试剂 I，用于蛋白浓度测定（兼容 0.1% SDS）</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>超声破碎仪</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics 超声破碎仪微探头，阶梯型，实心螺纹，9.5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33995-325</td><td>超声破碎用破碎头</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics 超声破碎仪微探头，锥形，6.5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33996-185</td><td>超声破碎用微探头</td></tr><tr><td>缓冲液 A1</td><td>-</td><td>-</td><td>20 mM Tris-HCl，pH 7.4；50 mM NaCl；0.5% Nonidet P-40；0.5% 脱氧胆酸钠；0.5% SDS；1 mM EDTA；完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物</td></tr><tr><td>完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>11-873-580-001</td><td>缓冲液 A1 用完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂试剂</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R-250</td><td>BBI Life Sciences</td><td>CAS 6104-59-2</td><td>用于质谱分析的考马斯亮蓝溶液</td></tr><tr><td>结晶紫溶液（2.3% 结晶紫，0.1% 草酸铵，20% 乙醇）</td><td>SigmaI-Aldrich</td><td>HT90132-1L</td><td>用于克隆染色</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>用于细胞核染色</td></tr><tr><td>DMEM: F12 培养基</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>DMEM: F12 培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清，认证，热灭活，美国来源</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS（胎牛血清）</td></tr><tr><td>高糖 DMEM（Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基）</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>高糖 DMEM</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>化学转染试剂 I</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000，P3000 溶液</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>化学转染试剂 II</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td>固定剂</td></tr><tr><td>脱脂奶粉（可替代 Carnation 脱脂奶粉）</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871（重订号 190915；批号 90629）</td><td>脱脂乳粉</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>低血清培养基</td></tr><tr><td>对苯二胺</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>用于封片剂</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素，液体</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>青霉素-链霉素</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>聚-L-赖氨酸，0.1% w/v，溶于水</td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺 [PEI]；1.0 mg/ml</td><td>Polysciences</td><td>23966&amp;ndash;2</td><td>化学转染试剂 III</td></tr><tr><td>Protein A Sepharose CL-4B 珠</td><td>GE Healthcare/Amersham</td><td>17-0963-03</td><td>用于使用 pQCXIP-EYFP-CENP-A 进行体内泛素化检测的 Protein A Sepharose CL-4B 珠</td></tr><tr><td>Restore Western Blot 剥脱缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI21059</td><td>Western Blot 剥脱缓冲液 I</td></tr><tr><td>测序级胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>用于质谱分析</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto 最大灵敏度底物</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>超敏增强型化学发光（ECL）底物</td></tr><tr><td>UltraPure 去离子水</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>无菌组织培养级水</td></tr><tr><td>Western Blot 剥脱缓冲液 II（50 mM Tris-HCl，pH 6.85；2% SDS；50 mM DTT；100 mM 2-巯基乙醇）</td><td>-</td><td>-</td><td>Western Blot 剥脱缓冲液 II</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;二抗&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>荧光素偶联二抗（亲和纯化二抗）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>荧光素偶联二抗（亲和纯化二抗）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquisition FV31S-SW 软件</td><td>Olympus</td><td>-</td><td>软件 C1（https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519）</td></tr><tr><td>Analysis FV31S-DT 软件</td><td>Olympus</td><td>-</td><td>软件 C2（https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519）</td></tr><tr><td>cellSens Dimension 软件 Ver. 1.18</td><td>Olympus</td><td>-</td><td>软件 C3（https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/）</td></tr><tr><td>Image Studio 分析软件 Ver 4.0</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>-</td><td>软件 D</td></tr><tr><td>Molecular Imager Versadoc MP4000 系统</td><td>Bio-Rad</td><td>-</td><td>化学发光成像仪，用于免疫印迹检测</td></tr><tr><td>Odyssey CLx 红外成像系统</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>-</td><td>红外成像系统，用于免疫印迹检测</td></tr><tr><td>OpenCFU 软件</td><td>-</td><td>-</td><td>用于菌落计数（http://opencfu.sourceforge.net/）</td></tr><tr><td>Openlab 版本 5.5.2 科学成像软件</td><td>Improvision/PerkinElmer</td><td>-</td><td>软件 A</td></tr><tr><td>ProteinPilot 软件版本 4.5</td><td>AB SCIEX</td><td>-</td><td>用于质谱分析的软件 F</td></tr><tr><td>Quantity One 1-D 分析软件</td><td>Bio-Rad</td><td>-</td><td>软件 E</td></tr><tr><td>TripleTOF 5600+ 系统</td><td>AB SCIEX</td><td>-</td><td>质谱仪</td></tr><tr><td>Volocity 版本 6.3 3D 图像分析软件（Volocity Acquisition）</td><td>PerkinElmer</td><td>-</td><td>软件 B1</td></tr><tr><td>Volocity 版本 6.3 3D 图像分析软件（Volocity Quantification）</td><td>PerkinElmer</td><td>-</td><td>软件 B2</td></tr></tbody></table>

通过质谱分析鉴定eyfp标记的cenp-a（eyfp-cenp-a）的泛素化修饰

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

研究动粒和着丝粒的结构与动态对于理解染色体不稳定性（CIN）和癌症进展具有重要意义。着丝粒的染色体位置及其功能（即着丝粒身份）是如何被决定的，以及如何参与染色体的准确分离，是一个基本科学问题。CENP-A 被认为是着丝粒身份的非DNA指示因子（表观遗传标记），CENP-A 的泛素化对于其在着丝粒上的沉积至关重要，该过程通过细胞分裂间的二聚化作用得以遗传，并且对细胞存活不可或缺。
本文描述了通过质谱分析鉴定EYFP-CENP-A K124R突变体的泛素化修饰，结果表明由于CENP-A K124R突变蛋白上连接了EYFP标签，可能诱导了其他赖氨酸位点的泛素化。质谱分析成功鉴定了EYFP-CENP-A K124R中赖氨酸306（K306）的泛素化修饰，该位点对应于CENP-A中的赖氨酸56（K56）。本文还讨论了使用GFP/EYFP或高分子量蛋白标签作为研究蛋白质功能工具时存在的局限性。同时探讨了当前技术在检测泛素化条带、鉴定特定位点的泛素化修饰以及在活细胞或单个细胞整个细胞周期中可视化泛素化过程方面所面临的技术限制。
本文所介绍的质谱分析方法可应用于带有不同标签的人类CENP-A蛋白以及其他着丝粒-动粒蛋白。对于希望鉴定泛素化功能作用的研究人员，建议采用由多种检测/分析方法组合而成的这一系列方法。

EYFP-CENP-A K124突变体表现出泛素化、与HJURP相互作用，且在着丝粒定位和细胞存活方面均无缺陷。 此处引用Fachinetti等人（2017年）报道的系统6 重新构建：在携带一个被破坏和一个“floxed”等位基因的二倍体人类（RPE-1）细胞中 CENP-A 等位基因CENP-A-/F），EYFP-CENP-A 由 pBabe-EYFP 逆转录病毒载体表达。在此系统中，内源性 CENP-A 的表达来自 CENP-A-/F 等位基因可被Cre重组酶破坏6EYFP-CENP-A野生型或K124R突变体基因构建体图1A)，可在逆转录病毒整合后稳定表达，以挽救内源性CENP-A的缺失。内源性CENP-A的残余表达来自 CENP-A-/F 等位基因随后被Cre重组酶破坏。在诱导Cre重组酶7天后，未检测到内...

CENP-A 的泛素化是 CENP-A 在着丝粒上沉积的重要前提，通过细胞分裂过程中的二聚化作用遗传，并对细胞存活至关重要。本文介绍通过质谱分析鉴定EYFP标记的CENP-A蛋白（EYFP-CENP-A）泛素化的方法。

通过质谱分析鉴定EYFP标记的CENP-A（EYFP-CENP-A）的泛素化修饰

研究动粒和着丝粒的结构与动态对于理解染色体不稳定性（CIN）和癌症至关重要

该方法可用于鉴定EYFP标记的CENP-A蛋白的泛素化修饰。它也可应用于人源CENP-A蛋白及其他蛋白，通过不同的实验进行检测。该方法的主要优势在于能够用于鉴定具有重要生物学意义的EYFP-CENP-A K124R泛素化位点。该方法可拓展用于研究多种功能蛋白的翻译后修饰。首先准备与抗GFP抗体结合的蛋白A磁珠。每次免疫沉淀反应使用25微升蛋白A磁珠，用缓冲液A1至少洗涤三次，以去除其中的乙醇。然后用缓冲液 A1 配制 50% 的珠子溶液。向珠子中加入 2 微升抗 GFP 抗体，再加入缓冲液 A1 至珠子净体积的 20 倍。在 4 °C 下旋转孵育 4 至 18 小时。旋转的最适时间必须根据免疫沉淀的效率通过实验确定。旋转后，在100 × g条件下离心 beads 1分钟，去除未结合的上清液。加入缓冲液A1，将beads配制成50%的溶液，并为每个免疫沉淀反应使用25 µL该溶液。进行免疫沉淀时，通过超声处理和冻融在缓冲液A1中裂解细胞。测定蛋白质浓度，并对不同免疫沉淀样品中的蛋白质含量进行归一化。然后从每根试管中取出5%样品用于SDS-PAGE电泳。将剩余的裂解液与25微升结合了抗GFP抗体的蛋白A磁珠混合，在4摄氏度下进行末端旋转孵育4至18小时。在缓冲液A中裂解细胞并按前述方法进行免疫沉淀后，保留10%的总免疫沉淀产物，用于确认EYFP标记的CENP-A的泛素化，并精确定位泛素化的EYFP CENP-A。其余90%用于质谱分析。将质谱样品在市售的4-12% Bis-Tris蛋白凝胶中进行电泳。然后进行考马斯亮蓝染色，并切取50-70千道尔顿的凝胶区域用于质谱分析。将每块凝胶切成小片，放入0.5毫升低蛋白结合离心管中。用含有25毫摩尔浓度碳酸氢铵的100微升50%乙腈溶液洗涤凝胶碎块，涡旋振荡10至15分钟，然后离心并弃去上清液。最后一次洗涤后，使用台式真空浓缩仪将凝胶颗粒干燥30分钟。加入10微升浓度为每微升10纳克的测序级胰蛋白酶，使凝胶颗粒在5分钟内重新水合。然后加入25毫摩尔的碳酸氢铵溶液，用量以刚好浸没凝胶颗粒为宜，在37摄氏度下过夜消化。第二天，将消化后的上清液转移至洁净的0.65毫升硅化管中，加入50%乙腈和5%甲酸溶液。涡旋振荡样品10分钟，然后离心，将上清液转移至萃取管中。将样品再次浓缩至两微升。然后加入八微升含3%乙腈和2%甲酸的溶液。涡旋振荡15分钟，再在16,000 ×g 离心30分钟。使用液相色谱系统联用质谱仪，通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行质谱数据采集。将八微升样品注入反相液相色谱柱，按照文稿中的指示，在60分钟内使用2-80%的溶剂B梯度分离肽段。采用数据依赖性采集模式收集质谱数据。打开桌面上用于分析质谱数据的商业软件。要开始新的搜索，请点击顶部菜单中的 LC 按钮，然后点击添加按钮以上传原始的质谱原始数据文件。在Paragon方法中选择人类蛋白质ID作为数据库搜索方法，并使用UniProt智人数据库搜索原始质谱原始数据文件。选择胰蛋白酶作为消化酶，并根据论文中的说明设置其余参数。输入结果文件名，然后单击菜单右侧的“另存为”按钮。然后选择一个用于存储搜索结果的文件夹，并点击保存按钮。点击处理按钮以开始搜索。搜索结束后，带有输入搜索名称的数据将自动保存到所选文件夹中。要获取任意特定肽段的 MS/MS 谱图，请在软件 F 中打开搜索结果。然后在顶部菜单的蛋白质列表中点击目标蛋白质，并在中间菜单中点击目标肽段。该肽段的 MS/MS 谱图将显示在菜单底部。如需导出并保存 MS/MS 谱图，请复制谱图并粘贴至合适的文件格式中。通过逆转录病毒整合后，可稳定表达EYFP CENP-A野生型或K124R突变体的基因构建体，该构建体能够挽救内源性CENP-A的缺失。在诱导Cre重组酶表达七天后，未检测到内源性CENP-A的表达。EYFP CENP-A野生型和K124R蛋白的表达水平均与初始内源性CENP-A蛋白水平相似。EYFP标记的CENP-A野生型和K124R突变体在内源性CENP-A剩余表达被阻断七天后均显示出着丝粒定位。与FLAG标签或无标签的CENP-A野生型及K124R突变体不同，EYFP标记的CENP-A野生型和K124R突变体均表现出泛素化以及与HJURP的相互作用。细胞活力通过在内源性CENP-A等位基因剩余表达被阻断14天后进行克隆形成实验来评估。EYFP CENP-A 野生型和 K124R 突变体在敲除剩余的内源性 CENP-A 等位基因后第14天，显示出相似数量的挽救克隆。免疫沉淀质谱分析显示，在 CENP-A 缺失的 F 细胞中，EYFP CENP-A K124R 在赖氨酸306位点发生泛素化。综合这些结果表明，大分子蛋白的融合诱导了 CENP-A 中除 K124R 以外的其他赖氨酸位点发生泛素化，从而抑制了原有的 K124R 单突变体表型。进行该实验方案时，应使用市售的4%–12% Bis-Tris蛋白凝胶来运行质谱样品。向凝胶条带中加入足量的胰蛋白酶，并使其重新水化，直至所有酶被完全吸收。实际上，需要采用低分子量标记或检测技术，以可视化泛素化修饰，并在细胞及整个生物体水平上研究蛋白质泛素化信号的时间和空间动态特征。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

质谱分析，用于识别 EYFP 标记 CENP-A （EYFP-CENP-A） 的泛化

本文描述了一种涉及FRET（福斯特共振能量转移）信号定量分析的新方法，用于研究酶动力学。通过该方法获得了SENP1（SUMO/Sentrin特异性蛋白酶1）催化结构域对pre-SUMO1（小泛素样修饰蛋白1）水解反应的KM和kcat值。这种基于定量FRET的蛋白酶动力学研究的一般原理可应用于其他蛋白酶的研究。...

定量FRET（Förster共振能量转移）分析用于SENP1蛋白酶动力学测定

本文描述了在芽殖酵母Saccharomyces...

一种可检测出芽酵母着丝粒蛋白 Ndc10 和 Ndc80 发生 SUMO 化与泛素化修饰的蛋白质纯化技术

本文报道了在人类细胞中检测内源性和外源性着丝粒-动粒蛋白的实验方案，并通过间接免疫荧光染色方法（采用固定剂如多聚甲醛、丙酮或甲醇进行固定）对这些蛋白在着丝粒-动粒上的水平进行定量分析。...

内源性和外源性着丝粒-动粒蛋白的免疫荧光分析

针对目标蛋白的多种内源性翻译后修饰进行研究可能极具挑战性。本文所述技术采用优化的裂解缓冲液和滤膜系统，并结合特异性靶向特定翻译后修饰的亲和基质，利用单一、简化的系统即可检测目标蛋白的乙酰化、泛素化、SUMO化2/3以及酪氨酸磷酸化修饰。...

利用全面的免疫沉淀富集系统鉴定靶蛋白的内源性翻译后修饰谱

细胞周期蛋白依赖性激酶1（Cdk1）在细胞周期的G2期被激活，并调控多种细胞通路。本文介绍了一种 体外...

通过特异性鉴定细胞周期蛋白依赖性激酶1的磷酸化位点 体外 激酶活性检测

我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。...

通过肽段富集与质谱法检测蛋白质泛素化位点

本方案旨在建立泛素（Ub）和泛素样蛋白（Ubls）的特异性蛋白质组，以鉴定与特定条件（如处理方式或表型）相关的这类翻译后修饰（PTMs）的变化。...

泛素及泛素样蛋白依赖性翻译后修饰的分析及显著变化的鉴定

该方法描述了泛素链拓扑结构全局变化的评估。该评估通过基于质谱的靶向蛋白质组学方法来实现。...

泛素链的平行反应监测分析

我们提供了一种在哺乳动物细胞中针对特定底物和E3泛素连接酶的泛素化检测的详细实验方案。采用HEK293T细胞系进行蛋白过表达，通过免疫沉淀法从细胞裂解液中纯化多泛素化修饰的底物蛋白，并利用SDS-PAGE进行分离。通过免疫印迹技术检测该翻译后修饰。...

哺乳动物细胞裂解物中E3泛素连接酶介导底物泛素化修饰的评估

本文介绍了一种利用化学探针和质谱技术从原代细胞和组织中捕获并鉴定疾病特异性蛋白质-蛋白质相互作用的实验方案。通过专用的基于网络的分析平台对获得的相互作用数据集进行分析，以揭示与疾病相关的动态网络功能障碍及通路改变。...

绘制疾病中功能失调的蛋白质-蛋白质相互作用图谱

了解利用质谱分析技术鉴定EYFP标记CENP-A蛋白泛素化位点的方法。本研究通过免疫沉淀结合质谱分析，揭示K124R突变体中赖氨酸306位点的泛素化修饰，为理解着丝粒组装机制及细胞活力调控提供重要依据。

通过质谱分析鉴定EYFP标记的CENP-A（EYFP-CENP-A）的泛素化修饰

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