Name: 人类多能干细胞和免疫损伤的成熟小脑有机体可伸缩生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 了解利用一次性生物反应器从人类诱导多能干细胞规模化生成小脑类器官的方法。该化学定义培养系统可实现可控细胞聚集和高效神经分化，为研究小脑发育及疾病提供可靠模型。

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本工作由葡萄牙科学技术基金会（FCT）资助（通过里斯本2020运营计划，项目编号：UIDB/04565/2020，授予T.P.S.的项目PD/BD/105773/2014及授予D.E.S.N.的项目PD/BD/128376/2017），以及由欧洲区域发展基金（FEDER）和FCT共同资助的项目（POR Lisboa 2020—里斯本区域运营计划 葡萄牙2020），包括资助号PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394和CEREBEX小脑类器官生成用于共济失调研究项目LISBOA-01-0145-FEDER-029298。此外，还获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划的支持，资助协议号为739572——再生与精准医学发现中心H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017。

1. 人iPSC在单层培养中的传代与维持
<ol>
	<li>培养板的制备
	<ol>
		<li>在 4 °C 下解冻基底膜基质（见材料表）原液，并分装为每份 60 μL。将分装样品在 -20 °C 冻存。</li>
		<li>为包被 6 孔板的孔，将一份基底膜基质在冰上解冻。解冻后，将 60 µL 基质加入 6 mL DMEM-F12 培养基中，通过上下轻柔吹打使其充分重悬。</li>
		<li>向 6 孔板的每个孔中加入 1 mL 稀释后的基底膜基质溶液，在传代前于室温（RT）孵育至少 1 小时，或在 4 °C 保存最多 1 周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 EDTA 传代 iPSC 克隆
	<ol>
		<li>将 iPSC 细胞在 6 孔板中以单层培养方式维持于 37 °C、95% 湿度、5% CO2 的培养箱中。 
		注意：本实验方案中使用了三种不同的人源 iPSC 细胞系：F002.1A.1321、人源表观遗传 iPSC 细胞系（iPSC6.2）22，以及商业获取的 iPS-DF6-9-9T.B（见材料表）。</li>
		<li>传代前，将已储存的包被板（步骤 1.1）在室温（RT）放置 15 分钟，并准备 mTeSR1 培养基（表 1）。</li>
		<li>使用移液管吸除孔内液体，并立即向每个孔中加入 0.5 mL mTeSR1 培养基。</li>
		<li>吸除含 iPSC 的孔中的旧培养基，每孔使用 1 mL 0.5 mM EDTA 洗涤一次。</li>
		<li>向每个孔中加入 1 mL 0.5 mM EDTA，并在室温下孵育 5 分钟。</li>
		<li>吸除 EDTA 溶液，通过轻轻加入 mTeSR1 培养基并使用 P1000 移液器吹打克隆，将细胞从孔中脱离。将细胞收集至锥形管中。 
		注意：吹打细胞悬液次数不得超过 3 次。</li>
		<li>将细胞悬液按 1:4 稀释后，每孔加入 1 mL，使细胞悬液加入后每孔总体积为 1.5 mL。将细胞放回 5% CO2、37 °C 的培养箱中继续培养。</li>
		<li>每日更换培养基，当细胞融合度达到 75%–80% 时，每 3 天传代一次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在生物反应器中接种人iPSCs
<ol>
	<li>将单层培养的iPSCs在mTeSR1培养基中孵育，培养基中添加10 µM的ROCK抑制剂Y-27632（ROCKi）。向6孔组织培养板的每孔中加入1 mL补充后的培养基，在37 °C、95%湿度、5% CO2条件下孵育1小时。 
	注：ROCKi用于保护解离的iPSCs免于发生凋亡23。</li>
	<li>孵育1小时后，吸除每孔中的废弃培养基，并用1 mL 1× PBS每孔洗涤1次。</li>
	<li>向6孔板的每孔中加入1 mL细胞解离培养基（参见材料表），在37 °C下孵育7分钟，直至细胞在轻柔振荡下易于从孔壁脱落。</li>
	<li>用P1000移液器反复吹打细胞解离培养基，使细胞脱落并解离为单细胞。向每孔中加入2 mL完全细胞培养基以终止酶消化作用，并轻柔吹打细胞悬液，转移至无菌锥形管中。</li>
	<li>以210 × g离心3分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于培养基（即添加10 µM ROCKi的mTeSR1）中，使用台盼蓝染色和血细胞计数板对iPSCs进行计数。</li>
	<li>在生物反应器中接种15 × 106个单细胞（最大体积为100 mL），加入60 mL添加10 µM ROCKi的mTeSR1，最终细胞密度为250,000个细胞/mL。</li>
	<li>将含有iPSCs的容器置于恒温培养箱内的通用底座单元中，培养条件为37 °C、95%湿度、5% CO2。 
	注：通过将通用底座单元的转速设定为27 rpm，持续搅拌24小时，以促进iPSC形成聚集体。</li>
</ol>
3. 人iPSC来源的类脑器官中聚集体的分化与成熟
<ol>
	<li>将单细胞接种的当天定义为第0天。</li>
	<li>第1天，使用刻度移液管收集1 mL iPSC细胞聚集体样品。在取样前，将装有聚集体的生物反应器置于通用底座上，并在无菌操作台中保持与之前相同的振荡状态。将细胞悬液接种至超低吸附24孔板中。检查是否已形成由iPSC衍生的细胞聚集体。</li>
	<li>使用光学显微镜以40x或100x的总放大倍数获取图像，以测量聚集体直径。</li>
	<li>使用 FIJI 软件测量每张图像中聚集体的面积。
	<ol>
		<li>选择 “分析 | 设置测量参数” 从菜单栏中选择并点击“面积” 和 “好的”.</li>
		<li>选择“文件 | 开放” 从菜单栏中打开已存储的图像文件。选择工具栏中提供的直线选择工具，在图像中的标尺上绘制一条直线。选择“分析 | 设置比例尺” 从菜单栏中。</li>
		<li>在 已知距离添加图像比例尺的尺度范围 µm定义“长度单位”作为 µm. 单击“全球”以保留设置并“好的选择 椭圆选择 在工具栏中。</li>
		<li>对每个聚集体，使用椭圆工具标定其区域。选择“分析 | 测量”。根据测量得到的面积计算其直径，假设聚集体近似为球形 
		<img alt="直径计算公式，几何，方程，数学符号，A=面积。" src="/files/ftp_upload/61143/61143equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
		其中 A 为聚集体的面积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当聚集体的平均直径为 100 µm，用不含ROCKi的新鲜mTeSR1培养基替换80%的用过的培养基。当集落达到200–250 μm 直径，将所有用过的培养基更换为gfCDM（表1），使类器官沉降至生物反应器底部。 
	注意：如果平均聚集体直径超过 350 μm 不要启动分化程序。重复单细胞接种。通常，聚集体需要约1天时间达到平均直径 100 µm.</li>
	<li>将含有聚集体的生物反应器插入放置于培养箱中的通用底座单元内 37 °C，95% 湿度，以及 5% CO₂2.</li>
	<li>将生物反应器的搅拌速度降低至25 rpm。</li>
	<li>第2天，重复步骤3.2、3.3和3.4以评估聚集体直径。添加 30 μL FGF2（终浓度50 ng/mL）以及 60 μL SB431542（终浓度， 10 μM) 加入 60 mL gfCDM 分化培养基（表1）。用添加补充物的gfCDM完全替换生物反应器中的废培养基，重复步骤3.6。 
	注意：SB431542 对于抑制中胚层-内胚层分化并诱导神经分化至关重要24. 使用 FGF2 促进神经上皮组织的尾侧化25.</li>
	<li>第5天，重复步骤3.2、3.3、3.4和3.8。 
	注意：在分化过程中，细胞聚集体的大小应逐渐增加。然而，聚集体直径仅在分化开始时至关重要，因为该参数可能影响分化的效率。</li>
	<li>第7天，重复步骤3.2、3.3和3.4。将FGF2和SB431542稀释至2/3：添加 20 μL FGF2 的 40 μL 向60 mL gfCDM分化培养基中加入SB431542。将生物反应器中的用尽培养基全部更换为添加了补充物的gfCDM。重复步骤3.6，并将生物反应器的搅拌速度提高至30 rpm。</li>
	<li>第14天，重复步骤3.2、3.3和3.4。添加 60 μL 加入 FGF19（终浓度为 100 ng/mL）至 60 mL 的 gfCDM 分化培养基中。将生物反应器中的所有耗尽培养基更换为添加了 FGF19 的 gfCDM。重复步骤 3.6。 
	注意：FGF19 用于促进中后脑结构的极化26.</li>
	<li>第18天，重复步骤3.2、3.3、3.4和3.11。</li>
	<li>第21天，重复步骤3.2、3.3和3.4。将生物反应器中的所有用过的培养基更换为完全神经基础培养基（表1）。重复步骤 3.6。 
	注意：Neurobasal 培养基是一种基础培养基，用于维持类器官中的神经元细胞群体7.</li>
	<li>第28天，重复步骤3.2、3.3和3.4。添加 180 μL 向60 mL完全神经基础培养基中加入SDF1（终浓度300 ng/mL）。用添加SDF1的完全神经基础培养基替换生物反应器中的全部用后培养基。重复步骤3.6。 
	注意：SDF1 用于促进不同细胞层的有序排列27.</li>
	<li>第35天，重复步骤3.2、3.3和3.4。将生物反应器中的所有用过的培养基更换为完全BrainPhys培养基（表1）。重复步骤 3.6。 
	注意：BrainPhys 是一种支持具有突触活性神经元的神经元培养基28.</li>
	<li>每3天更换总体积的1/3，使用完全BrainPhys培养基，直至分化第90天。</li>
</ol>
4. 类器官冷冻切片与免疫组织化学制备
<ol>
	<li>类器官免疫染色样本收集
	<ol>
		<li>从生物反应器中用血清移液管吸取含有类器官的培养基样本1 mL，转移至15 mL锥形管中。 
		注意：为评估分化效果，应在不同时间点收集类器官，包括第7、14、21、35、56、70、80和90天。</li>
		<li>移除上清液，并用1 mL 1× PBS洗涤一次。 
		注意：不要离心类器官。让类器官依靠重力自然沉降到管底。</li>
		<li>移除上清液，加入1 mL 4%多聚甲醛（PFA），在4 °C下孵育30分钟。弃去用过的PFA，加入1 mL 1× PBS。</li>
		<li>将类器官保存在1 mL 1× PBS中，置于4 °C，直至进行冷冻切片处理。 
		注意：固定后的类器官在1× PBS中保存不得超过1周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官冷冻切片前处理
	<ol>
		<li>移除保存的类器官中的上清液，加入1 mL 15%蔗糖溶液（w/v，用1× PBS稀释），轻轻旋转混匀，在4 °C下过夜孵育。</li>
		<li>配制15%蔗糖/7.5%明胶溶液（表2），并在制备过程中保持在37 °C，以防止明胶凝固。</li>
		<li>移除15%蔗糖溶液，向类器官中加入1 mL 15%蔗糖/7.5%明胶溶液，轻轻旋转快速混匀，37 °C孵育1小时。</li>
		<li>将15%蔗糖/7.5%明胶溶液加入塑料容器中，至其体积的一半。在室温下等待凝固。</li>
		<li>1小时孵育后，用巴氏移液管小心地将含有类器官的蔗糖/明胶液滴置于已凝固的明胶表面。室温下静置约15分钟使其完全凝固，注意避免气泡产生。</li>
		<li>在类器官上方继续加入15%蔗糖/7.5%明胶溶液，直至填满容器。在室温下等待完全凝固。</li>
		<li>凝固后，在4 °C下孵育20分钟。</li>
		<li>将含类器官的明胶切成中心包含类器官的立方体，并用一滴O.C.T.包埋剂将明胶块固定在纸板上。</li>
		<li>在500 mL烧杯中加入250 mL异戊烷，并在适当容器中加入液氮。使用镊子和厚手套，小心地将盛有异戊烷的烧杯置于液氮表面，将异戊烷冷却至-80 °C。</li>
		<li>当温度达到-80 °C时，将明胶块放入盛有异戊烷的烧杯中，保持-80 °C直至完全冻结。根据立方体大小，可能需要1–2分钟。 
		注意：避免温度低于-80 °C或冷冻时间过长，以免导致明胶块开裂。</li>
		<li>冻结后，迅速将明胶块保存在-80 °C，直至进行冷冻切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官冷冻切片
	<ol>
		<li>开启冷冻切片机，将样本（OT）和冷冻室（CT）温度均设定为-25 °C。</li>
		<li>当两个温度稳定后，使用O.C.T.包埋剂将含类器官的明胶块固定在样本台上。</li>
		<li>设定切片厚度为12 µm。</li>
		<li>切取明胶块，并在粘附载玻片上收集3–4片切片（见 材料表）。</li>
		<li>保存于-20 °C，待用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官切片免疫染色
	<ol>
		<li>将含有类器官切片的载玻片放入盛有50 mL预热1× PBS的染色缸中，最多可放置10张载玻片，背对背排列。 
		注意：所有类器官切片必须完全浸没在液体中。</li>
		<li>在37 °C下孵育45分钟，以去除明胶。</li>
		<li>在室温下用50 mL 1× PBS洗涤一次，每次5分钟：将载玻片转移至盛有新鲜1× PBS的染色缸中。</li>
		<li>将载玻片转移至盛有50 mL新配制甘氨酸溶液（表2）的染色缸中，在室温下孵育10分钟。</li>
		<li>将载玻片转移至盛有50 mL 0.1% Triton（表2）的染色缸中，在室温下透化10分钟。</li>
		<li>用1× PBS洗涤两次，每次5分钟。</li>
		<li>准备免疫染色皿，将3 mm滤纸用1× PBS浸湿。用纸巾在切片周围轻轻擦干载玻片，将其置于3 mm滤纸上。用巴氏移液管将约0.5 mL/片的封闭液（表2）均匀覆盖整个载玻片表面，室温孵育30分钟。</li>
		<li>吸除多余封闭液，用纸巾在切片周围轻轻擦干载玻片。将50 µL用封闭液稀释的一抗（表3）加至切片上，盖上盖玻片。将载玻片放入预先准备好的免疫染色皿中，4 °C孵育过夜。</li>
		<li>将载玻片转移至盛有50 mL TBST（表2）的染色缸中，让盖玻片自然脱落，用TBST洗涤三次，每次5分钟。</li>
		<li>将50 µL用封闭液稀释的二抗加至切片上，盖上盖玻片。将载玻片放入预先准备好的免疫染色皿中，室温孵育30分钟，避光。</li>
		<li>再次将载玻片转移至染色缸中，用50 mL TBST洗涤三次，每次5分钟。</li>
		<li>用纸巾在切片周围轻轻擦干载玻片，将载玻片放入预先准备好的免疫染色皿中。用巴氏移液管将0.5 mL DAPI溶液均匀覆盖整个载玻片表面，室温孵育5分钟。</li>
		<li>重复步骤4.4.9。</li>
		<li>用纸巾小心擦干载玻片。沿载玻片逐滴加入50 µL封片剂，然后轻轻将盖玻片覆盖在每张载玻片上，略微弯曲以避免产生气泡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
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作者YH和SJ是PBS Biotech的员工。作者BL是PBS Biotech, Inc.的首席执行官兼联合创始人。这些合作作者参与了本论文所用生物反应器的开发。这并不影响作者遵守期刊在数据和材料共享方面的所有政策。其他所有作者均声明不存在利益冲突。

为了满足药物筛选和再生医学应用中对特定细胞类型的大规模细胞数量及明确培养条件的需求，可扩展的培养系统开发正不断推进。近年来，多个研究团队已报道了可扩展地生成神经前体细胞和功能性神经元32,33,34，这为神经退行性疾病新模型的建立带来了显著进展。然而，胚胎发育过程中某些关键事件的重现仍未能实现，且在悬浮培养条件下长期维持所获得的功能性神经元也尚未实现34。本文介绍了一种动态三维培养系统，可在化学成分明确且无饲养层的动态培养条件下，生成具有小脑特征的诱导多能干细胞（iPSC）来源神经类器官，并进一步促进其成熟为功能性小脑神经元。
在开始小脑分化之前，维持人iPSCs的质量至关重要。因此，为避免影响分化效果，从解冻到生物反应器接种期间，iPSCs的传代次数不应超过三次。分化方案中的一个重要步骤是评估细胞聚集体的大小。聚集体大小在诱导向特定细胞谱系分化过程...

人类多能干细胞（PSCs）的出现为再生医学和疾病建模提供了极佳的工具，因为这些细胞可以分化为人体大多数细胞谱系1,2。自发现以来，已有多种方法被用于诱导PSC分化，以模拟包括神经退行性疾病在内的多种疾病3,4,5,6。
最近有研究报告称，由多能干细胞（PSCs）衍生的三维培养物可模拟人类脑部结构，这类结构被称为脑类器官3,7,8。利用健康个体及患者特异性PSCs生成这些结构，为研究人类发育过程及神经发育障碍提供了宝贵的机会。然而，目前用于生成这些高度有序脑结构的方法难以实现大规模生产。为了获得足够大且内部不发生坏死、能够模拟组织形态发生的类器官，现有方案通常依赖于在静态条件下启动神经定向分化，随后将细胞包埋于水凝胶中，并在动态培养系统中继续培养3。然而，此类方法可能限制了类器官生产的可扩展性。尽管已有研究致力于引导PSCs向中枢神经系统特定区域分化，包括皮层、纹状体、中脑和脊髓神经元9,10,11,12，但在动态条件下生成特定脑区仍具挑战性。特别是，在三维结构中生成成熟的 cerebellar 神经元尚未见报道。Muguruma 等人率先建立了可模拟早期小脑发育的培养条件13，并近期报道了一种可使人类胚胎干细胞形成类似妊娠早期小脑的极化结构的方案7。然而，在已报道的研究中，小脑神经元的成熟需要将类器官解离、分选小脑前体细胞，并在单层培养系统中与饲养细胞共培养7,14,15,16。因此，在明确条件下可重复地生成适用于疾病建模的特定小脑类器官，仍面临培养条件和饲养细胞来源变异性的挑战。
本方案介绍了使用一次性垂直轮生物反应器（具体参数见材料表，下文简称生物反应器）实现人多能干细胞（PSCs）三维扩增并高效分化为小脑神经元的最佳培养条件。生物反应器配备大型垂直搅拌桨，结合U形底部结构，可在反应器内实现更均匀的剪切力分布，从而在较低搅拌速度下实现温和、均匀的混合与颗粒悬浮17。利用该系统可获得形态和大小可控的细胞聚集体，这对于实现更均一且高效的分化至关重要。此外，该方法还能以较低的劳动强度生成更多由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的类器官。
类器官的主要特征在于其由干细胞形成的三维多细胞结构，能够实现不同类型细胞的自我组织，进而形成类似于人类形态发生过程中所见的特定结构。18,19,20因此，类器官形态是分化过程中需要评估的重要标准。通过对类器官进行冷冻切片，并利用一组特异性抗体对切片进行免疫染色，可实现分子标志物的空间可视化，从而分析细胞增殖、分化、细胞群体身份及细胞凋亡。根据本方案，通过免疫染色类器官冷冻切片，可在第7天观察到初步高效的神经定向分化th 分化第35天。在分化过程中，可观察到多种具有小脑特征的细胞群体。在此动态系统中培养35天后，小脑神经上皮沿顶-底轴组织化，形成由顶端增殖性前体细胞层和基底部的终末分裂后神经元构成的结构。在随后的成熟阶段（分化第35至90天），可观察到不同类型的小脑神经元，包括浦肯野细胞（Calbindin）+）、颗粒细胞（PAX6+/MAP2+)，高尔基细胞（Neurogranin）+），单极刷状细胞（TBR2+）以及深部小脑核投射神经元（TBR1+此外，在培养90天后生成的小脑类器官中观察到少量但无统计学意义的细胞死亡。
在此系统中，由人iPSC衍生的类器官可分化为不同类型的 cerebellar 神经元，并在无需解离和饲养层共培养的条件下存活长达3个月，为疾病建模提供了人源小脑神经元的来源。

<table><tbody><tr><td>3MM 滤纸</td><td>WHA3030861</td><td>Merck</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>A6964 - 500mL</td><td>Sigma</td><td>细胞解离液</td></tr><tr><td>抗 BARHL1 抗体</td><td>HPA004809</td><td>Atlas Antibodies</td><td></td></tr><tr><td>抗 Calbindin D-28k 抗体</td><td>CB28</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>抗 MAP2 抗体</td><td>M4403</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>抗 N-钙黏蛋白抗体</td><td>610921</td><td>BD Transduction</td><td></td></tr><tr><td>抗 NESTIN 抗体</td><td>MAB1259-SP</td><td>R&amp;amp;D</td><td></td></tr><tr><td>抗 OLIG2 抗体</td><td>MABN50</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>抗 PAX6 抗体</td><td>PRB-278P</td><td>Covance</td><td></td></tr><tr><td>抗 SOX2 抗体</td><td>MAB2018</td><td>R&amp;amp;D</td><td></td></tr><tr><td>抗 TBR1 抗体</td><td>AB2261</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>抗 TBR2 抗体</td><td>ab183991</td><td>Abcam</td><td></td></tr><tr><td>抗 TUJ1 抗体</td><td>801213</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>无转铁蛋白</td><td>T1147</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>BrainPhys 神经元培养基 N2-A &amp;amp; SM1 试剂盒</td><td>5793 - 500mL</td><td>Stem cell technologies</td><td></td></tr><tr><td>化学成分明确的脂质浓缩液</td><td>11905031</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 24×60 mm</td><td>631-1575</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>结晶纯化牛血清白蛋白</td><td>5470</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>10236276001</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>二丁酰环磷酸腺苷</td><td>SC- 201567B -500mg</td><td>Frilabo</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>32500-035</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>A3840001</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>牛皮来源明胶</td><td>G9391</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>玻璃染色缸</td><td>E94</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I</td><td>10566-016</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>MB014001</td><td>NZYtech</td><td></td></tr><tr><td>Ham&amp;rsquo;s F12</td><td>21765029</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>人表观遗传重编程诱导多能干细胞系</td><td>A18945</td><td>ThermoFisher</td><td>iPSC6.2</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>12440046</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>91077C</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>iPS DF6-9-9T.B</td><td></td><td>WiCell</td><td></td></tr><tr><td>异戊烷</td><td>PHR1661-2ML</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>A-92902</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>354230</td><td>Corning</td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>巯基甘油</td><td>M6154</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>475904</td><td>Millipore</td><td>封片剂</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>85850 -500ml</td><td>Stem cell technologies</td><td></td></tr><tr><td>N2 添加剂</td><td>17502048</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>12348017</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>158127</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>PBS-0.1 一次性使用反应器</td><td>SKU: IA-0.1-D-001</td><td>PBS Biotech</td><td></td></tr><tr><td>PBS-MINI MagDrive 基础单元</td><td>SKU: IA-UNI-B-501</td><td>PBS Biotech</td><td></td></tr><tr><td>重组人 BDNF</td><td>450-02</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>重组人 bFGF/FGF2</td><td>100-18B</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>重组人 FGF19</td><td>100-32</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>重组人 GDNF</td><td>450-10</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>重组人 SDF1</td><td>300-28A</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂 Y-27632</td><td>72302</td><td>Stem cell technologies</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>S4317</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>S7903</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost 显微镜载玻片</td><td>12372098</td><td>ThermoFisher</td><td>防脱显微镜载玻片</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>25608-930</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-HCl</td><td>T3038-1L</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>9002-93-1</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>P1379</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA，pH 8.0</td><td>15575020</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr></tbody></table>

由人多能干细胞可扩展地生成成熟小脑类器官及通过免疫染色进行表征

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

小脑在维持平衡和运动协调方面发挥着关键作用，不同小脑神经元的功能缺陷可引发小脑功能障碍。目前关于疾病相关神经元表型的大多数知识均基于死后组织样本，这使得对疾病进展和发展过程的理解变得困难。动物模型和永生化细胞系也已被用作神经退行性疾病的模型，但它们并不能完全模拟人类疾病。人诱导性多能干细胞（iPSCs）在疾病建模方面具有巨大潜力，并为再生医学策略提供了宝贵的细胞来源。近年来，利用患者来源的iPSCs生成脑类器官的技术改善了神经退行性疾病建模的前景。然而，目前仍缺乏能够在三维培养系统中高效生成大量类器官和高产量成熟神经元的实验方案。本文介绍的方案是一种在化学成分明确的条件下，利用可放大的一次性生物反应器，可重复且可规模化地生成具有小脑特征的人iPSC来源类器官的新方法。所生成的类器官在mRNA和蛋白质水平均表达特定的标志物。通过对特定蛋白群组的分析，可识别出不同的小脑细胞群体，其定位对于评估类器官结构至关重要。通过类器官冷冻切片及后续对切片进行免疫染色，用于评估特定小脑细胞群体的存在及其空间组织结构。

通过使用0.1 L生物反应器促进细胞聚集来启动该实验方案（图1A）。以单细胞接种方式将iPSCs接种，接种密度为250,000个细胞/mL，培养体积为60 mL，搅拌速度为27 rpm。此时间点定义为第0天。24小时后，细胞高效地形成了球状聚集体（第1天，图1B），聚集体形态在第5天之前保持良好，并随着时间推移逐渐增大，表现出聚集体形态和大小的高度均一性（图1B）。显微镜下的定量分析也显示，第1天时聚集体大小呈正态分布（图1C）。聚集体大小是一个重要的物理参数，能够促使细胞向不同谱系分化29,30。因此，基于既往研究中报道的可有效诱导神经31,32和小脑分化<sup c...

本方案描述了一种动态培养系统，用于在化学成分明确且无饲养层的条件下，利用一次性生物反应器生成尺寸可控的人多能干细胞聚集体，并进一步诱导其向小脑类器官分化。

小脑在维持平衡和运动协调方面起着关键作用，不同小脑神经元的功能缺陷可能导致……

我们首次提出一种可重复且可放大的新方法，利用一次性生物反应器，在化学成分明确的条件下，从源自小脑类器官的诱导多能干细胞（iPS细胞）进行培养。为获得用于接种生物反应器的细胞，向六孔板中每孔人iPSC培养物加入一毫升细胞解离液。将培养板置于37摄氏度孵育七分钟，直至轻轻振荡即可使细胞从孔壁上轻松脱落。使用 P1000 微量移液器，将细胞解离液上下吹打，直至细胞分散成单细胞。随后向每孔加入 2 毫升完全细胞培养基，以终止酶消化反应。然后用移液器轻柔地将细胞转移至无菌的锥形管中。将离心管在210 × g 条件下离心3分钟。弃去上清液，并用培养基重新悬浮细胞沉淀。使用血细胞计数板和台盼蓝染料对细胞进行计数。观察含有iPSC的生物反应器容器，细胞密度为每毫升250,000个细胞。将生物反应器容器放入置于37摄氏度、95%湿度和5%二氧化碳培养箱中的通用底座单元内。为促进iPSC聚集，将基础控制单元的振荡速率设置为27 RPM。第一天，以接种生物反应器的当天为第零天，将生物反应器和基础单元置于无菌操作台中，使用血清学移液管吸取一毫升细胞悬液样本。将细胞悬液接种于超低吸附的24孔板中。使用显微镜确认已形成由iPSC衍生的细胞聚集体。如果如此，在40倍或100倍镜下拍摄类器官聚集体的图像。继续培养iPSCs和生物反应器中的聚集体，直至其平均直径达到100 µm，然后更换80%的培养基，使用不含ROCK抑制剂的新鲜MT01培养基。当聚集体直径达到200至250 µm时，让所有类器官沉降至生物反应器底部，随后将全部用过的培养基更换为gfCDM分化培养基。将底座单元和生物反应器放回培养箱，并将振荡速度降低至25 RPM。去除保存的类器官上清液后，向沉淀中加入1毫升15%蔗糖溶液，轻轻旋转混匀。将类器官在4摄氏度下孵育过夜后，移除蔗糖溶液，再加入1毫升含15%蔗糖和7.5%明胶的溶液，并轻轻旋转迅速混匀。在类器官于37摄氏度孵育的同时，取一个塑料容器，加入等体积的15%蔗糖与7.5%明胶混合溶液，静置使其凝固。类器官孵育一小时后，使用巴斯德移液管将类器官-蔗糖-明胶混合液滴加到已凝固的蔗糖和明胶表面。等待15分钟使液滴完全凝固后，用更多的15%蔗糖、7.5%明胶填充塑料容器的剩余部分，在室温下使其完全凝固，随后在4摄氏度条件下孵育20分钟。将含有类器官的明胶切成中心包含类器官的立方体，用一滴OCT包埋剂将该立方体固定在一块纸板上，然后在500毫升杯子中加入250毫升异戊烷，并在适当容器中装入液氮。使用镊子和厚手套，小心地将异戊烷杯放置在液氮表面。异戊烷和液氮均为危险试剂，使用这两种试剂时必须佩戴个人防护装备，包括厚手套和良好的通风设备。当异戊烷冷却至零下80摄氏度时，将明胶块放入异戊烷中直至完全冻结。充分冻结的明胶块在用镊子轻轻敲击时会发出金属般的声音，表明其已准备好储存。用50毫升1×PBS清洗载有类器官切片的显微镜载玻片，持续5分钟，然后将载玻片转移至含有新鲜1×PBS的考普林瓶中。将载玻片转移至含有50毫升新鲜配制的甘氨酸的考普林瓶中，在室温下孵育10分钟，然后将载玻片转移至含有50毫升0.1%Triton的考普林瓶中，在室温下透化处理10分钟。用1X PBS洗涤载玻片两次，每次5分钟。准备免疫染色皿，放入浸透1X PBS的3毫米滤纸。用纸巾擦干切片周围的载玻片，并将其放置在3毫米的滤纸上。用巴斯德移液管向每张载玻片加入0.5毫升封闭液。室温孵育30分钟后，去除多余的封闭液，并用纸巾沿切片周围将载玻片擦干。在每张载玻片上加入50微升稀释的一抗，并覆盖盖玻片。将载玻片放入预先准备好的免疫染色盒中，在4摄氏度下孵育。过夜孵育后，将载玻片转移至含有50毫升TBST的柯林斯瓶中，使盖玻片自然脱落，随后用TBST洗涤载玻片三次，每次五分钟。在每张载玻片上加入50微升稀释的二抗，并盖上盖玻片。将载玻片放入预先准备好的免疫染色盒中，在室温下避光孵育30分钟。随后再次将载玻片转移至Coplin染色缸中，用50毫升TBST缓冲液洗涤三次，每次5分钟。使用巴斯德移液管，在每张载玻片的整个表面加入0.5毫升dappy溶液，并在室温下孵育5分钟。在生物反应器中培养24小时后，诱导多能干细胞（iPSC）高效形成了球状聚集体。细胞形态在第5天之前保持良好，并伴随尺寸的逐渐增大。表现出高度的均一性。显微镜下的定量分析还显示，到第1天时，聚集体尺寸呈正态分布，且两种细胞系均在第2天达到最佳聚集体尺寸。在达到所需聚集体直径后，诱导神经定向分化，随后促进不同小脑前体细胞的生成。在分化过程中，类器官表现出更明显的上皮化特征，类似于具有管腔结构的神经管样结构。此外，在初始小脑定向分化的前14天内，类器官的直径分布较为均一。免疫荧光分析结果表明，由iPSC衍生的类器官在分化第7天时已实现有效的神经定向。免疫染色还表明，小脑类器官具有高效的小脑定向分化能力以及成熟能力。此外，在生物反应器中培养80天后，对类器官进行活死细胞染色显示细胞活力高，且未见坏死区域。该技术是研究小脑变性相关病理通路以及评估新药治疗效果的重要工具。

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人类多能干细胞和免疫损伤的成熟小脑有机体可伸缩生成

本视频演示了一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方法。将人iPSCs诱导形成拟胚体（EBs）。在诱导培养基中，将EBs培养于聚合物支架上，促进其分化为神经干细胞、前体细胞以及未成熟神经元。最后，将EBs包埋于基质中，并转移至维持培养基中以形成脑类器官。...

生成诱导多能干细胞来源的脑类器官

本视频展示了一种利用一次性三维生物反应器从诱导多能干细胞（iPSCs）生成成熟小脑类器官的技术。该生物反应器可促进iPSC聚集体的形成，随后通过一系列富含生长因子和趋化因子的培养基处理，诱导iPSC聚集体分化为成熟的小脑类器官。之后，收集类器官并进行冷冻保存，以供后续分析。...

使用一次性生物反应器从诱导多能干细胞生成成熟小脑类器官

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本视频展示了小脑类器官切片的免疫荧光染色，用于鉴定在不同类型小脑神经元中表达的特定靶抗原，这些抗原可作为类器官成熟度的指标。...

小脑类器官切片的荧光免疫染色

模拟人类大脑发育一直受到神经上皮组织前所未有的复杂性的阻碍。本文介绍一种高效生成脑类器官的方法，用于解析人类大脑发育早期事件，并建立小头畸形模型。 体外 如上所述。...

生成人诱导多能干细胞来源的脑类器官以模拟早期神经发育障碍

类脑器官代表了一种新的体外模型系统，可用于研究人类早期大脑发育。in...

由人诱导多能干细胞生成标准化且可重复的前脑类脑器官

我们提供了生成和表征基于人诱导性多能干细胞（hIPSC）的2D和3D新皮质发育模型的详细方案，以及用于定性和定量分析初级纤毛（PC）发生与功能的互补方法。...

基于人诱导性多能干细胞的二维和三维模型解析初级纤毛在新皮质发育中的作用

本研究提供了一种详细的技术方法，用于建立一种简单且稳健的皮质类器官培养体系，该体系基于标准的无饲养层人多能干细胞（hPSC）培养系统。该方案快速、高效且可重复，可用于生成模拟脑衰老特征的类器官。 体外.

稳健且高度可重复的皮质脑类器官生成方法用于模拟脑神经元衰老 体外

本方案介绍了从诱导性多能干细胞生成小脑细胞二维单层培养物的方法，用于研究小脑发育的早期阶段。...

模拟人类小脑发育 体外 在二维结构中

本方案提供了由人诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的脑类器官可重复生成、维持及老化过程的逐步操作流程。该方法能够长期培养和成熟脑类器官，从而有助于模拟与脑老化及年龄相关疾病发生机制有关的生物学过程。...

用于衰老研究的iPSC衍生脑类器官长期培养的稳健组织制备技术

了解利用一次性生物反应器从人类诱导多能干细胞规模化生成小脑类器官的方法。该化学定义培养系统可实现可控细胞聚集和高效神经分化，为研究小脑发育及疾病提供可靠模型。

由人多能干细胞可扩展地生成成熟小脑类器官及通过免疫染色进行表征

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