斑马鱼幼虫感染 阿斯珀吉卢斯 孢子分析宿主-病原体相互作用

该协议展示了斑马鱼幼虫曲霉菌感染模型，我们可以使用它来研究对这种真菌的先天免疫反应。斑马鱼幼虫模型的主要优点是，我们可以在多日感染期间可视化活体宿主动物内部的免疫细胞病原体相互作用和感染进展。该模型的结果可能适用于发现新的治疗靶点来治疗免疫功能低下患者的侵袭性曲霉病。

将孢子显微注射到斑马鱼幼虫中是一项困难的技术，需要大量练习才能获得一致和可重复的结果。要进行显微注射，请使用随压力注射器、真空压力装置、脚踏开关、微量移液器支架、微量作器以及磁性支架和板提供的设置。全部连接到压缩空气源。

打开压缩空气阀。然后打开显微注射器。将压力设置为约 25 psi，增强设置为 60 毫秒，真空压力单位设置为 1 psi。

使用微量加载器移液器吸头，在微量注射针头中加入 3 至 5 微升 PBS 或含有酚红的孢子悬浮液。然后将针头安装到显微作器上。烟曲霉 （Aspergillus fumigatus） 是一种人类的机会性病原体。

加载的针头有刺穿皮肤的风险。针头应非常紧密地连接到显微注射器上，研究人员应始终戴上手套并密切注意针头周围的手部运动，以避免穿刺。放置显微作器，使针头的末端在立体显微镜下以最低放大倍率可见。

缩放至 4 倍放大倍率，保持指针在视野中。然后用锋利的镊子夹住针头的末端。踩下注射踏板以观察液滴的大小。

并继续夹住针头，直到流出大约 3 纳升的孢子悬液。准备好后，将显微作器和针头移开，以避免在将幼虫排列在注射板上时意外撞击针头。从注射板上倒出 E3 三卡因。

并将大约 24 只麻醉的 2 天龄幼虫转移到板中，用尽可能少的 E3 。然后，根据幼虫的朝向排列幼虫，将所有面向右侧的幼虫排成一排，将所有面向左侧的幼虫排成下面的一排。将显微镜设置为最低放大倍率，将显微作器放回原处，使针头以 30-60 度角靠近幼虫。

放大最高放大倍率。并使用微调旋钮进一步调整针的位置。将孢子悬浮液注射到幼虫旁边的液体中，以验证 30-70 个孢子从针头中出来。

然后移动板，使针头位于第一只幼虫的正上方并靠近第一只幼虫。从面向针头的幼虫开始。将针头穿过耳囊周围的组织，然后将其刺入后脑室，根据需要移动板以获得幼虫的正确方向。

目视确认针头末端位于后脑室的中心。然后踩下脚踏板注射孢子并轻轻缩回针头。在两行中注射所有幼虫后，再次将针头移开。

并缩放到较低的放大倍数。酚红染料在每个幼虫的后脑中仍然可见。处理注射不成功的幼虫，然后用新鲜的 E3 将它们从板中清洗，将剩余的幼虫转移到培养皿中。用 E3 冲洗幼虫两次，并确保它们从麻醉中恢复。

注射后，立即将 8 只幼虫转移到单独的 1.7 毫升试管中并对其进行安乐死。准备 1 mL 含氨苄青霉素和卡那霉素的 PBS。从装有幼虫的试管中去除尽可能多的液体。

然后加入 90 微升含抗生素的 PBS。在 TissueLyser 中以每分钟 1800 次振荡的速度匀浆幼虫，持续 6 分钟。然后，将它们以 17， 000 倍 G 的速度旋转 30 秒。

将匀浆悬浮液从每根试管移液到标记的 GMM 板的中间，并使用一次性 L 形涂布器将其铺开。注意避免蔓延到轮辋。将板在 37 摄氏度下倒置孵育 2 到 3 天。

然后，计算形成的菌落数量。将剩余的注射幼虫分成两个 3.5 毫米的培养皿。一个用于药物治疗，一个用于对照。

去除尽可能多的液体，然后用载体控制将 E3 添加到一个盘子中。而 E3 则对另一个感兴趣。使用移液器将每个幼虫转移到 96 孔板中的孔中。

并监测它们的存活率 7 天。在成像当天，准备一个 3.5 毫米的培养皿，含 100 微摩尔的 PTU，一个含 E3 三卡因的培养皿。将 E3 三卡因添加到 Z 楔形 E 装置的腔室中，并使用 P100 微量移液器去除腔室和约束通道中的气泡。

然后去除腔室外所有多余的 E3 三卡因。吸取一只幼虫，然后用 E3 PTU 将其转移到培养皿中。然后将其转移到 E3 三卡因中，用尽可能少的液体。

30 秒后，将麻醉的幼虫转移到伤人和夹伤装置的装载室中。从伤情室中取出 E3 三卡因，并将其释放到加载室中，以便将幼虫的尾部移动到限制通道中。确保幼虫位于其外侧、背侧或背外侧，以便可以使用倒置物镜对后脑进行成像。

用共聚焦显微镜对幼虫成像后，将 E3 三卡因释放到伤痛室中，将幼虫从约束通道推入加载室。捡起幼虫并将其转移回装有 E3 三卡因的培养皿中。然后用 E3 PTU 将其转移到培养皿中，并加入尽可能少的液体。

在 PTU 中冲洗并将其转移回 48 孔板中。将曲霉孢子显微注射到斑马鱼幼虫的后脑中，监测感染结果。在野生型幼虫中观察到的死亡非常少，80% 至 100% 的幼虫在整个实验中存活下来。

在免疫抑制的幼虫中观察到存活率显着降低。当对来自受感染野生型幼虫的菌落形成单位进行定量时，观察到孢子的持久性和随时间的缓慢清除。将感染后 1 天、 2 天、 3 天、 5 天和 7 天存活的孢子数标准化为注射的孢子数，以比较复制品之间的持久性和清除率。

当巨噬细胞被标记时，通常在感染后 2 到 3 天开始观察到大约 50% 的幼虫中的小噬细胞聚集。中性粒细胞募集延迟，主要发生在真菌发芽之后。虽然真菌负荷在整个实验中在大多数幼虫中持续存在。

有些人在感染后 5 天观察到清除。在幼虫的另一个亚群中，观察到真菌传播到后脑以外的区域。耳囊周围区域是发现这种播散的一个位置。

60% 的幼虫中，通常在 5 天内看到真菌发芽。所有幼虫的吞噬细胞簇面积、巨噬细胞募集和中性粒细胞募集随时间而变化。有些在整个实验过程中呈上升趋势，而另一些则随着时间的推移而消退。

该程序可以与斑马鱼的遗传作（例如 CRISPR）相结合，以确定对曲霉菌的成功先天免疫反应中对特定宿主途径的要求。该协议允许在活的、完整的宿主中实时可视化曲霉先天免疫细胞的相互作用。