人体心室心肌细胞与颤音-切切心肌切片分离
May 10th, 2020
呈现是将人类和动物心室心肌细胞与振动切切心肌切片分离的协议。耐钙细胞（高达200个细胞/毫克）的高产量可以从少量组织（<50毫克）中获得。该协议适用于暴露于冷缺血的心肌，长达36小时。
该协议适用于来自人类和动物心脏的样本，即使在运输时间数小时之后。每毫克可从振动切组织切片中分离出多达 200 个菌细胞。心细胞的电生理、结构和生化分析有助于发现和更好地理解心脏病的机理。
填充100毫米组织培养皿后，用20毫升的冷切溶液，将组织样本放在培养皿中。将培养皿放在冷却至 4 摄氏度的盘子上。请记住，来自动物，特别是人类的活组织样本具有潜在的传染性。
使用剪刀或手术刀，从样品中去除多余的纤维组织和脂肪。为了优化较大组织样本的振动处理，请使用手术刀从组织中切割八毫米立方体。对于活检的较小样本，这是没有必要的。
人们可以通过史诗脂肪层来识别史诗。去除多余的脂肪后，将组织块放入盘中，将皮块朝下。为了准备组织嵌入，将400毫克的低熔点阿加罗斯煮沸为10毫升的切割溶液。
用热溶解的加糖凝胶填充十毫升注射器。密封注射器，并放在37摄氏度的水浴中至少15分钟，让糖平衡。使用钳子，将修剪试样移动到干净的 35 毫米组织培养盘中，其表骨朝下。
然后，用无菌拭子从试样中去除多余的液体。用钳子握住试样，使试样保持运动。将阿加罗斯的注射器清空，确保将样品完全浸中。
立即将盘子放在冰上，让阿加罗斯凝固10分钟。将未使用的剃须刀刀片安装到振动器的刀片支架上。如果可能，通过调整刀片的 Z 偏转来校准振动器。
使用手术刀切除适合振动器的标本支架的黄玫瑰组织块。为确保稳定性，确保组织仍充分浸入糖中。与加糖边缘，至少8毫米。
在试样支架上涂抹一层薄薄的氰丙烯酸酯。轻轻按压糖组织块，放在支架上。使用切割解决方案构建振动浴池。
然后，在振动器的外部冷却罐中加注碎冰，在整个切割过程中保持四至六摄氏度的温度。将含有红糖组织块的试样支架放入振动池中。使用手稿中描述的振动器设置，生成 300 微升厚的切片。
在平行的气室中创建部分至关重要，因为这是心室壁中心肌细胞纤维的对齐方式。否则，会有太大的伤害。使用标准光学显微镜检查心肌细胞和组织切片的对齐方式。
为了避免损坏组织，请握住糖，而不是组织本身。心肌细胞纤维，应均匀对齐，心肌细胞不应收缩。将加热板放在实验室摇床上，加热至 37 摄氏度。
以 65 RPM 启动实验室摇床。将蛋白酶溶解在溶液一的两毫升中。溶解胶原酶，在两毫升溶液中一。
但是不要混合蛋白酶和胶原酶。将氯化钙加入胶原酶溶液中，最终浓度为5微摩尔。在37摄氏度下孵育两种溶液。
使用钳子将组织切片转移到干净的 60 毫米组织培养盘中。具有五毫米的预冷却切割溶液。将盘子放在冰或冷盘上，用刀片或钳子小心地从组织中去除糖。
要进行组织切片的初始清洗，请将干净的 35 毫米组织培养盘放在热刀片上。并填补它，用两毫米预热溶液之一。将一个或两个组织切片转移到准备好的盘子中。
然后使用一毫米移液器，用于洗涤步骤。洗涤切片后，从盘子中去除溶液一个，加入两毫升的蛋白酶溶液。在热叶片上孵育切片 12 分钟，摇床转速为 65 RPM。
多洗两次组织切片，用两毫升预加热溶液一个。接下来，从菜中去除溶液一，加入两毫升胶原酶溶液。在热叶片上孵育切片至少 30 分钟，以 65 RPM 的速度摇动。
孵育15分钟后，通过用光学显微镜检查盘子，检查有无个单独的个体菌细胞。每五分钟继续检查一次，直到单个菌细胞可见。然后，用两毫升的预热溶液两次洗两次来消化。
并重新填充菜，用两毫升溶液2。小心地用细钳将组织切片的纤维拉开。继续认真工作，避免损害心肌细胞。
移液器几次，一次使用超过你的移液器。然后，通过检查盘子，在光学显微镜下确认棒状心肌细胞已分离。将盘子放回37摄氏度的热盘上，通过摇晃进行搅拌。
通过加入10毫摩尔和100毫摩尔氯化钙库存溶液，慢慢将组织悬浮液的钙浓度从5微摩尔增加至1.5毫摩尔。当钙增加完成时，使用钳子去除任何剩余的未消化组织块。首先，停止暂停的激动。
接下来，使用1000微升移液器，慢慢从悬浮液顶部取出1/3的溶液。避免心肌细胞的吸入。然后向细胞中加入700微升溶液三。
搅拌 10 分钟后，重复这些洗涤步骤。将悬浮液转移到 15 毫升离心管。允许心肌细胞在室温下沉淀，至少10分钟，最多30分钟。
完全拆下上一液。并在经过改良的酪氨酸溶液或所需的实验缓冲液中重新填充颗粒。使用光学显微镜验证细胞质量。
30%至50%的心肌细胞应为棒状，光滑无膜状。和显示，清晰的交叉条纹。为了验证隔离效率，该协议应用于大鼠心肌。
与通过冠状动脉灌注和隔离进行隔离相比，从小组织块分离。使用协议时，通过灌注分离后，观察到棒状细胞比例较低。但总数仍然很高。
相比之下，与组织块分离，产生更少的棒状细胞。流式细胞学，用于定量比较结果。将心肌细胞与组织切片分离，无法达到冠心病灌注获得的产率。
但是，从组织块中，从组织块中提供比菌细胞分离的产量高得多。接下来，该协议被应用于人类心肌。与心肌切片分离，产生海德数和很大一部分棒形人类真菌。
只有一小部分，圆形心肌细胞。与心肌切片分离，导致棒状菌的数量明显增加，而不是与组织块分离。光度定量证实，从心肌切片分离后，心肌细胞的生存能力要高得多。
与所述协议分离的人类细胞可进行结构分析。阿尔法行为素染色，揭示了一个密集的常规Z线模式和平均沙康长度1.92微米，在休息心肌细胞。LTCC 和 RyR 染色，显示透明聚类在细胞膜和 T 管附近共同本地化。
分离的心肌细胞是兴奋的，可用于研究细胞电生理学或激发收缩耦合。行动的潜在形状和持续时间，是在其他人报告的范围，心室心肌细胞，从失败的人类心脏。汗声线扫描记录的钙瞬变，在刺激后显示出明显的上冲。
并且，可接受的信号与噪声比。从下细胞边界的偏转可以看到通过收缩缩短的心肌细胞。由于此协议获得的分离器心肌细胞数量之多，细胞培养是可能的。
这可能允许基因转移，药理学测试和组织工程的人心肌细胞。一个重要的应用，是验证发现，从动物模型在人类细胞。心力衰竭是一种临床综合征，治疗选择非常有限。
改进的心肌细胞分离技术将有助于确定细胞靶点，用于诊断和未来治疗。
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概述
本协议概述了从振动切片机切割的心肌切片中分离人类和动物心室心肌细胞的方法。它能够获得高产量的耐钙细胞，便于研究心脏疾病机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 心肌细胞分离
- 心脏生理学
- 电生理分析
背景
- 心肌细胞分离对于研究心脏功能至关重要。
- 振动切片机切割能够精确地切割组织。
- 耐钙细胞对于准确的实验结果至关重要。
- 可以对暴露于冷缺血的样本进行研究。
研究目的
- 提供一种可靠的心肌细胞分离方法。
- 增进对心脏疾病机制的理解。
- 促进电生理和生化分析。
使用的方法
- 冷切液的制备。
- 使用振动切片机进行组织切片。
- 从心肌切片中分离心肌细胞。
- 分析分离的细胞以用于研究目的。
主要结果
- 每毫克组织可分离多达200个心肌细胞。
- 该协议适用于运输后的样本。
- 分离细胞的高活性支持进一步分析。
- 该方法允许研究缺血条件下的心肌细胞。
结论
- 该协议提供了一种可靠的心肌细胞分离方法。
- 它支持对心脏疾病及其机制的研究。
- 高产量的活细胞增强了实验结果。
常见问题解答
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical bottleneck in cardiac drug discovery by enabling reliable isolation of viable human ventricular cardiomyocytes from limited tissue samples, supporting translational validation of animal model findings. The method enhances predictive confidence in target validation by providing access to physiologically relevant human cells for mechanistic de-risking. It is particularly valuable for institutions without on-site cardiac surgery, expanding access to human tissue for preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in human cardiomyocytes, clarifying pathway relevance and reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Provides a reproducible source of rod-shaped, calcium-tolerant cardiomyocytes for functional assays.
- Strategic Value: Supports target de-risking by allowing verification of animal model findings in human cells before lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers high-yield, viable cardiomyocytes suitable for electrophysiological, structural, and biochemical analysis.
- Operational Value: Standardizes cell preparation from myocardial slices, improving assay consistency and scalability.
- Strategic Value: Enables reliable compound screening in human cells, increasing predictive confidence for cardiac safety and efficacy.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains cellular excitability and contractility, supporting disease-relevant modeling of cardiac pathophysiology.
- Operational Value: Allows isolation from tissue stored up to 36 hours in cold cardioplegic solution, facilitating multi-site collaboration.
- Strategic Value: Bridges discovery and preclinical stages by providing translatable human cell data for go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through human cell-based assays and enabling lead identification via functional screening in disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing access to viable human ventricular cardiomyocytes.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized isolation of rod-shaped myocytes with high viability and functional integrity.
- Analytics: Enables quantitative assessment via flow cytometry and functional readouts such as calcium transients and action potential duration.
- Translational Research: Connects animal model findings to human physiology through direct comparison in isolated cardiomyocytes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiomyocyte isolation across projects, reducing dependency on variable tissue sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing species-specific translational gaps.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability of cardiomyocyte isolation from limited human tissue samples.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling early de-risking of targets using human cell data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates based on human cardiomyocyte responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, vibratome operation, and enzymatic digestion protocols.
- Depends on access to a vibratome, temperature-controlled incubation systems, and standard cell culture equipment.
- Necessitates standardized protocols across teams to ensure consistency in slice thickness, enzyme exposure, and calcium reintroduction.
- Requires adaptation considerations for varying tissue quality, including fibrotic or ischemic samples.
- Limited by the availability of human myocardial specimens, though mitigated by tolerance to cold ischemia up to 36 hours.
