从振动切片机制备的心肌薄片中分离人类心室心肌细胞

该方案适用于人和动物心脏的样本，即使经过数小时的运输时间仍可使用。从振动切片机切割的组织切片中，每毫克可分离出多达200个心肌细胞。对心肌细胞进行电生理、结构和生化分析，有助于发现并更深入地理解心脏疾病的机制。

用20毫升冷切割液填充100毫米组织培养皿后，将组织样本放入培养皿中。将培养皿置于冷却至4摄氏度的冰盘上。请注意，来自动物尤其是人类的活体组织样本可能具有传染性。

使用剪刀或解剖刀去除样本上多余的纤维化组织和心外膜脂肪。对于较大的组织样本，为获得最佳的振动切片机处理效果，需用解剖刀将组织切成8毫米的立方体。对于来自活检的小样本，则无需此步骤。

可通过心外膜脂肪层来识别心外膜。去除多余脂肪后，将组织块放入培养皿中，心外膜朝下。为进行组织包埋，将400毫克低熔点琼脂糖在10毫升切片溶液中煮沸。

用一个10毫升注射器吸取热溶解的琼脂糖凝胶。密封注射器，并将其置于37摄氏度水浴中至少15分钟，使琼脂糖达到平衡。使用镊子将修整好的样本转移至干净的35毫米组织培养皿中，使心外膜朝下。

然后，用无菌棉签去除标本上多余的液体。用镊子固定标本，防止其移动。将琼脂糖溶液从注射器中排出并覆盖在标本上，确保标本完全浸没。

立即将培养皿置于冰上，让琼脂糖凝固10分钟。将未使用的刀片安装到振动切片机的刀片架上。如果可能，通过调整刀片的Z轴偏转来校准振动切片机。

使用解剖刀切取一块适合振动切片机样品托的琼脂糖组织块。为确保稳定性，应使组织仍充分浸没在琼脂糖中，且琼脂糖边缘至少保留八毫米。

在样品托上涂抹一层薄薄的氰基丙烯酸盐胶水，然后轻轻将琼脂糖组织块按压到托上。用切割液构建振动切片机浴槽。

然后，将碎冰加入振动切片机的外部冷却罐中，以在整个切片过程中维持 4 至 6 摄氏度的温度。将含有琼脂糖组织块的样品架放入振动切片机的切片浴中。根据文中所述的振动切片机设置，切出 300 µm 厚的切片。

必须平行于心外膜制备切片，因为心室壁中心肌细胞纤维的排列方向与此一致。否则会造成过度损伤。使用标准光学显微镜检查心肌细胞和组织切片的排列情况。

为避免损伤组织，应握住琼脂糖而非组织本身。心肌细胞纤维应均匀排列，且心肌细胞不应收缩。将加热板置于实验室摇床之上，并加热至37摄氏度。

将实验室摇床调至 65 RPM 启动。将蛋白酶溶解于 2 毫升溶液一中，将胶原酶溶解于 2 毫升溶液一中。

但不要混合蛋白酶和胶原酶。向胶原酶溶液中加入氯化钙，使其终浓度为5 µM。将两种溶液在37°C下孵育。

使用镊子将组织切片转移至洁净的 60 毫米组织培养皿中，加入 5 毫升预冷的切割溶液。将培养皿置于冰上或冷板上，用刀片或镊子小心去除组织周围的琼脂糖。

为进行组织切片的初次洗涤，将一个洁净的35毫米组织培养皿置于加热刀片上，并加入2毫米预热的溶液一。将一至两个组织切片转移至已准备好的培养皿中。

然后使用1 mm移液器进行洗涤步骤。洗涤切片后，从培养皿中移除溶液一，并加入2 mL蛋白酶溶液。将切片置于加热板上，在65 RPM转速下振荡孵育12分钟。

用两毫升预热的溶液一将组织切片再清洗两次。接着，从培养皿中移除溶液一，加入两毫升胶原酶溶液。将切片置于加热板上，以65 RPM的振荡速度孵育至少30分钟。

孵育15分钟后，在光学显微镜下观察培养皿，检查是否有游离的单个心肌细胞。每5分钟检查一次，直至观察到单个心肌细胞。随后，用2毫升预热的溶液二洗涤组织片两次，以终止消化。

加入两毫升溶液二，重新填满培养皿。使用精细镊子小心地将组织切片的纤维拉开。继续小心操作，避免损伤心肌细胞。

用一次性移液器反复吹打数次。然后在光学显微镜下观察培养皿，确认杆状心肌细胞已分离。将培养皿放回37°C的加热板上，并通过振荡进行搅动。

通过加入10毫摩尔和100毫摩尔的氯化钙储备液，缓慢将组织悬液中的钙离子浓度从5微摩尔提高至1.5毫摩尔。当钙离子浓度升高完成后，停止悬液的振荡，然后用镊子去除任何残留的未消化组织块。

接下来，使用1000微升移液器，从悬浮液上层缓慢移除1/3的溶液，避免吸入心肌细胞。然后向细胞中加入700微升溶液三。

振荡10分钟后，重复上述洗涤步骤。将悬液转移至15毫升离心管中，在室温下静置，使心肌细胞沉降，时间不少于10分钟，不超过30分钟。

完全去除上清液，并将沉淀重悬于改良的Tyrode溶液或所需的实验缓冲液中。使用光学显微镜检查细胞质量。

30%至50%的心肌细胞应呈杆状，表面光滑且无膜泡，具有清晰的横纹。为验证分离效率，本方案已应用于大鼠心肌组织。

与通过冠状动脉灌注及从小块组织中分离的方法相比，采用该方案时观察到的杆状细胞比例较低，但细胞总数仍然较高。

相比之下，从组织块中分离得到的杆状细胞较少。采用流式细胞术对结果进行定量比较。从组织切片中分离心肌细胞的得率未达到冠状动脉灌注所获得的水平。

但与心肌细胞分离相比，从组织块中提取可获得显著更高的产量。接下来，该方案被应用于人的心肌组织。从心肌切片中分离得到了较高的细胞数量和大量杆状的人类心肌细胞。

且仅有少量呈圆形的心肌细胞。从心肌薄片中分离得到的杆状心肌细胞数量显著高于从组织块中分离的结果。光度法定量分析证实，从心肌薄片中分离后的心肌细胞存活力明显更高。

采用所述方案分离的人类细胞可用于结构分析。α-辅肌动蛋白染色显示，静息状态心肌细胞中具有致密且规则的Z线结构，平均肌节长度为1.92 µm。L型钙通道（LTCC）和兰尼碱受体（RyR）染色显示，两者清晰的簇状信号在细胞膜及T小管附近共定位。

分离的心肌细胞具有兴奋性，可用于细胞电生理学或兴奋-收缩耦联的研究。动作电位的形态和持续时间处于其他研究者所报道的来自衰竭人心脏的室性心肌细胞的正常范围内。通过Khan vocal线扫描记录的钙瞬变显示，刺激后出现明显的上升支。

并且具有可接受的信噪比。通过下部细胞边界的偏移可以观察到心肌细胞因收缩而发生的缩短。由于本方案获得的分离心肌细胞数量较多，可进行细胞培养。

这可能实现人类心肌细胞的基因转移、药理学测试和组织工程。一个重要的应用是在人类细胞中验证来自动物模型的研究结果。心力衰竭是一种临床综合征，治疗选择非常有限。

改进的心肌细胞分离技术将有助于确定用于诊断和未来治疗的细胞靶点。