Name: 人体心室心肌细胞与颤音-切切心肌切片分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学习从振动切片心肌组织中分离心室心肌细胞的方法，适用于人和动物心脏样本。该技术可获取高产量钙耐受细胞，支持电生理、结构及生化分析，助力研究心脏疾病机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢慕尼黑大学Walter-Brendel实验医学中心的Andreas Dendorfer在切片方案方面提供的帮助。感谢埃尔朗根大学医院心脏外科的Ghazali Minabari和Christian Heim、鲁尔大学波鸿分校Erich &amp;#38; Hanna Klessmann研究所的Hendrik Milting，以及埃尔朗根大学医院小儿心脏病科的Muhannad Alkassar提供人类心肌组织样本。感谢埃尔朗根大学医院转化研究中心（TRC）的Simon Völkl及其同事在流式细胞术方面的支持。我们还要感谢埃尔朗根细胞与分子生理学研究所的Lorenz McCargo和Celine Grüninger提供的出色技术支持。
本工作由德国心血管研究中心（DZHK）、埃尔朗根-纽伦堡大学医院的跨学科临床研究中⼼（IZKF）以及埃尔朗根-纽伦堡大学联合会资助。

所有涉及大鼠的实验均经德国巴伐利亚州中弗兰肯动物护理与使用委员会批准。人类心脏组织样本的采集和使用均经埃尔朗根-纽伦堡大学和鲁尔大学波鸿分校的机构审查委员会批准。研究按照《赫尔辛基宣言》指南进行。患者在组织采集前均签署书面知情同意书。
雌性Wistar大鼠（150–200 g）购自商业供应商，通过腹腔注射100 mg/kg硫喷妥钠进行麻醉，随后采用颈椎脱位法处死，并行胸廓切开术切除心脏。人的心脏组织样本取自左心室心尖部核心组织（在植入机械辅助装置期间）、室间隔切除术、法洛四联症矫正手术，或来自移植摘除心脏的左心室游离壁。以下方案描述了从人心室组织中分离细胞的过程。大鼠心肌细胞的分离操作类似，但使用不同的酶（见&#160;材料表）。该方案的示意图流程见&#160;图1。
1. 缓冲液、溶液和酶的制备
<ol>
	<li>按所列清单准备缓冲液和溶液 表1.</li>
	<li>将溶液1、2、3及改良Tyrode's溶液预热至37 °C。切割溶液于4 °C保存，临用前取出。 
	注意：对于1–2片心肌组织，在一个35 mm的组织培养皿中进行分离时，溶液1、溶液2和溶液3的总用量分别约为15 mL、8 mL和5 mL。若需在多个培养皿中同时进行心肌细胞分离，应相应扩大试剂用量。切割溶液可冷冻保存于-20 ˚C，可存放数月。</li>
	<li>称取1 mg蛋白酶XXIV（参见 材料表) 加入预冷的15 mL离心管中，冰上保存备用。此为处理一个样本的用量，可根据需要按比例放大。切勿混合蛋白酶和胶原酶。</li>
	<li>称取 8 mg 胶原酶 CLSI（参见 材料表) 加入预冷的15 mL离心管中，冰上保存备用。此为处理一个样本的用量，可根据需要按比例放大。切勿混合蛋白酶和胶原酶。 
	注意：佩戴口罩或在通风橱内操作，以避免吸入酶粉末。 
	注意：不同批次的酶活性可能存在差异，因此最佳使用浓度可能有所不同，应在每次购入新批次酶时进行优化确定。16.</li>
</ol>
2. 心肌组织的保存与运输
<ol>
	<li>将人类心脏样本储存在冷却的、4 ˚C 的切割液中（表1）并以此条件运输。</li>
	<li>后续组织处理和振动切片均使用相同的溶液。 
	注意：活检和手术获取的心脏样本应立即转移至4 °C的切割液中，可在4 °C下储存或运输，但在本方案应用前最长不超过36小时。</li>
</ol>
3. 组织的处理与切片
注意：组织切片方案遵循 Fischer 等人的方法15。
<ol>
	<li>组织块的修剪 
	警告：人类心脏组织可能具有传染性。务必穿戴防护装备，并遵守所在机构的安全规定。小心处理使用过的刀片，并将其丢弃至安全容器中。
	<ol>
		<li>将标本放入盛有20 mL冷切割液的100 mm组织培养皿中，并置于4 °C冷却板上。</li>
		<li>使用解剖刀去除多余的纤维化组织和心外膜脂肪。若为透壁标本，还需去除小梁及靠近心内膜的组织层。 
		注：纤维化组织质地较硬，呈白色；脂肪通常较软，呈白色至黄色；小梁和心内膜组织层可通过其疏松的组织结构以及与心外膜层心肌相比不规则的纤维排列来识别。</li>
		<li>为获得最佳振动切片效果，使用解剖刀从较大的组织标本上切取约8 mm × 8 mm × 8 mm的矩形组织块。对于较小的活检样本，可跳过此步骤，直接进行琼脂糖包埋。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将心脏组织包埋于低熔点琼脂糖中
	<ol>
		<li>在玻璃烧杯中将400 mg低熔点琼脂糖溶于10 mL切割液中并煮沸。 
		警告：佩戴手套和护目镜以防止烫伤。仅使用隔热防护装备操作高温玻璃器皿。</li>
		<li>用10 mL注射器吸取热的溶解琼脂糖凝胶。密封注射器，并将其置于37 °C水浴中至少平衡15分钟。</li>
		<li>使用镊子将修剪后的心脏标本或活检组织放入洁净的35 mm组织培养皿中，使心外膜朝下，并用无菌棉签吸除多余液体。</li>
		<li>将已平衡的琼脂糖（步骤3.2.2）通过排空注射器的方式倾倒至组织上。倾倒过程中用镊子固定组织以防移动，并确保组织完全浸没于琼脂糖中。</li>
		<li>立即将培养皿置于冰上，使琼脂糖凝固10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>心肌切片
	<ol>
		<li>将新的&#160;刀片安装至振动切片机的刀片夹上，并在可能的情况下通过调节刀片的Z轴偏转进行校准。 
		注：本方案使用配备红外辅助校准装置的振动切片机，以将刀片调整至水平位置并实现最小Z轴偏转（测量偏转&#60;0.1 µm）。</li>
		<li>使用解剖刀切取适合振动切片机标本夹的琼脂糖-组织块。为确保稳定性，请确保组织仍充分浸没于琼脂糖中（琼脂糖边缘≥8 mm）。</li>
		<li>用少量氰基丙烯酸酯胶水和轻柔压力将琼脂糖块固定在标本夹上。</li>
		<li>将带有组织的标本夹放入振动切片机的切片槽中。向槽内加入切割液，并在整个处理过程中通过在振动切片机外部冷却罐中添加碎冰维持温度在4–6 °C。</li>
		<li>以≤0.1 mm/s的进刀速度、80 Hz的振荡频率、1.5 mm的横向振幅和15°的刀片角度，切出300 µm厚的切片。操作切片时应夹持琼脂糖部分而非组织本身，以避免组织损伤。如需保存，可将切片置于切割液中4 °C下最多保存2小时。 
		注：心肌细胞平行于心外膜排列。因此，必须平行于心外膜切片，以避免心肌细胞过度损伤。建议弃去前1–3片切片，仅使用厚度均匀一致的切片用于后续分离。但对于小组织活检样本，仅需弃去第一片切片即可。</li>
		<li>在标准光学显微镜下以40–100倍放大倍数检查心肌细胞的排列情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 组织消化
<ol>
	<li>将加热板放置在实验室摇床上，并升温至 37 °C。启动实验室摇床，转速设为 65 rpm。</li>
	<li>将蛋白酶（步骤 1.3 中制备）溶解于 2 mL 溶液 1（步骤 1.1 和 1.2）中，并在 37 °C 下孵育，直至使用。切勿将蛋白酶与胶原酶混合。</li>
	<li>将胶原酶（步骤 1.4 中制备）溶解于 2 mL 溶液 1（步骤 1.1 和 1.2）中，并在 37 °C 下孵育，直至使用。切勿将蛋白酶与胶原酶混合。 
	警告：请佩戴护目镜和手套，因为溶解的酶可能造成皮肤和眼睛损伤。</li>
	<li>向含胶原酶的溶液（步骤 4.3 中制备）中加入氯化钙（CaCl2），使其终浓度为 5 µM。</li>
	<li>使用镊子将振动切片机浴槽中的组织切片转移至盛有 5 mL 预冷切割液（步骤 1.1 和 1.2）的洁净 60 mm 组织培养皿中，并置于冰上保存。</li>
	<li>使用刀片或镊子小心去除心肌组织上的琼脂糖。 
	注意：避免对心肌切片施加过度张力和剪切应力，以免损伤心肌细胞。</li>
	<li>进行初始洗涤时，将洁净的 35 mm 组织培养皿置于加热板上，并加入 2 mL 预热（37 °C）的溶液 1。用镊子将 1–2 片心肌切片转移至已准备好的培养皿中。使用 1 mL 移液器吸除溶液，并重复洗涤 2 次，以去除切割液残留物。 
	注意：切勿吸除心脏切片。溶液和切片应始终保持在振荡加热板上 35 °C 的恒定温度。必要时可调节加热板温度。</li>
	<li>从培养皿中移除溶液 1，加入 2 mL 蛋白酶溶液（步骤 4.2）。在 65 rpm 转速下于加热板上孵育 12 分钟。</li>
	<li>使用 2 mL 预热的溶液 1（37 °C）洗涤 2 次。</li>
	<li>从培养皿中移除溶液 1，加入 2 mL 胶原酶溶液（步骤 4.3 和 4.4）。在 65 rpm 转速下于加热板上至少孵育 30 分钟。</li>
	<li>在 30、35、40 分钟等时间点，将培养皿置于光学显微镜下观察是否有游离的单个心肌细胞。操作应迅速，以避免溶液显著降温。 
	注意：所需消化时间可能因组织构成和纤维化程度而异。一旦组织明显变软，并在轻柔牵拉时易于解离，即达到最佳消化时间。若有足够组织，可同时对多个切片进行不同消化时间的平行消化处理。</li>
	<li>当组织完成消化且可见单个心肌细胞（步骤 4.11）时，使用 2 mL 预热的溶液 2（37 °C）洗涤 2 次，然后再次加入 2 mL 溶液 2。</li>
</ol>
5. 组织解离
<ol>
	<li>用镊子小心地将消化后的组织切片中的纤维拉开，进行解离。</li>
	<li>使用一次性巴斯德吸管（开口直径 &#62;2 mm）轻轻吹打数次。 
	注意：使用镊子和吹打操作可能引起机械应力，导致心肌细胞损伤。然而，这是细胞分离的关键步骤。应使用精细镊子以尽量减少细胞损伤，并小心地将组织切片解离成更小的片段。</li>
	<li>在光学显微镜下检查是否已释放出杆状心肌细胞。</li>
</ol>
6. 生理钙浓度的重新引入
<ol>
	<li>在加热板上于 35 °C 条件下缓慢将钙浓度从 5 µM 提高至 1.5 mM，同时持续搅拌。使用 10 mM 和 100 mM 的 CaCl2 储存液。推荐步骤：20、40、80、100、150、200、400、800、1,200、1,500 µM。每步之间间隔 5 分钟孵育，使细胞逐步适应升高的钙浓度。</li>
	<li>钙浓度提升结束后，用镊子小心去除未消化的组织块，或通过孔径为 180 µm 的尼龙网筛过滤细胞悬液。</li>
</ol>
7. 去除机械去耦剂
<ol>
	<li>停止振荡，用1,000 µL移液器缓慢从顶部移除约三分之一的溶液（~700 µL）。避免吸出心肌细胞。 
	注意：如果未消化的组织已被去除，心肌细胞将聚集在培养皿中央，便于吸取无细胞的上清液。若未发生此情况，则将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在35 °C静置沉降10分钟，然后吸除700 µL上清液并弃去，重悬细胞，再转移回35 mm组织培养皿，并继续执行步骤7.2。</li>
	<li>向细胞中加入700 µL溶液3，重新置于加热板上振荡，并孵育10分钟。</li>
	<li>重复步骤7.1和7.2。</li>
	<li>将悬液转移至15 mL离心管中，让心肌细胞在室温下静置沉降，时间不少于10分钟且不超过30分钟；或在50 × g 条件下离心1分钟。彻底移除上清液，并将细胞重悬于改良Tyrode溶液或所需的实验缓冲液中。 
	注意：心肌细胞可在改良Tyrode溶液（表1）中于37 °C和5% CO2条件下保存数小时后再使用。</li>
	<li>使用标准光学显微镜在40倍和200倍放大下检查细胞质量。 
	注意：约30–50%的心肌细胞应呈杆状，表面光滑无膜泡，具有清晰的横纹结构。活细胞中仅有5–10%应出现自发性收缩。</li>
</ol>

<ol><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).</li>
<li>Isenberg, G., Klockner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Tolerant+Ventricular+Myocytes+Prepared+by+preincubation+in+a+KB+Medium%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).</li>
<li>Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+handling+in+isolated+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Circulation. 85, 1046-1055 (1992).</li>
<li>Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force%2Fshortening-frequency+relationship+in+multicellular+muscle+strips+and+single+cardiomyocytes+of+human+failing+and+nonfailing+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Failure%22%5BJournal%5D)">Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts.</a> Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).</li>
<li>Peeters, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+human+ventricular+myocytes+from+single+endocardial+and+epicardial+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies.</a> The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).</li>
<li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Functional+Characterization+of+Human+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Fresh+Surgical+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51116(2014).</li>
<li>Seidel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheet-Like+Remodeling+of+the+Transverse+Tubular+System+in+Human+Heart+Failure+Impairs+Excitation-Contraction+Coupling+and+Functional+Recovery+by+Mechanical+Unloading%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading.</a> Circulation. 135, 1632-1645 (2017).</li>
<li>Hartmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiarrhythmic+effects+of+dantrolene+in+human+diseased+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).</li>
<li>Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+preparation+of+isolated+single+adult+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">A new method for preparation of isolated single adult myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).</li>
<li>Trube, G. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrube%2C+G+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Springer. Boston, MA. 69-76 (1983).</li>
<li>Schlüter, K. D., Schreiber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Ventricular+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Cell+Culture+Protocols%22%5BJournal%5D)">Adult Ventricular Cardiomyocytes.</a> Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).</li>
<li>Del Monte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+contractile+function+in+isolated+cardiomyocytes+from+failing+human+hearts+by+gene+transfer+of+SERCA2a%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a.</a> Circulation. 100, 2308-2311 (1999).</li>
<li>Brandenburger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+from+human+adult+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium.</a> Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).</li>
<li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li>
<li>Worthington-Biochemical. Worthington Tissue Dissociation Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html">http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html</a> (2019).</li>
<li>Seidel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+preserve+the+t-tubular+system+in+ventricular+cardiomyocytes+by+upregulation+of+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux.</a> Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47(2019).</li>
<li>Lipsett, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+substructure+reverts+to+an+immature+phenotype+during+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure.</a> Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).</li>
<li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).</li>
<li>Guo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+method+for+isolation+of+human+cardiomyocytes+to+model+cardiac+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases.</a> Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).</li>
<li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices%3A+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).</li>
<li>Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+MTT+assay+in+adult+ventricular+cardiomyocytes+to+assess+viability%3A+Effects+of+adenosine+and+potassium+on+cellular+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).</li>
<li>Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211, 646-647 (1966).</li>
<li>Piper, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium+paradox+revisited+An+artefact+of+great+heuristic+value%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value.</a> Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).</li>
<li>Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hypothermia+on+the+occurrence+of+the+calcium+paradox%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).</li>
<li>Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+human+left+ventricular+myocardium+from+cutting+injury+with+2%2C3-butanedione+monoxime%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime.</a> Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).</li>
<li>Busselen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sodium+on+the+calcium+paradox+in+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).</li>
<li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Human+Atrial+Myocytes+for+Simultaneous+Measurements+of+Ca2%2BTransients+and+Membrane+Currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50235(2013).</li>
<li>Leor, J., Kloner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Experimental+Model+Examining+the+Role+of+Magnesium+in+the+Therapy+of+Acute+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction.</a> The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).</li>
<li>Herzog, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+Magnesium+Therapy+Affects+Experimental+Infarct+Size%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size.</a> Circulation. 92, 2622-2626 (1995).</li>
<li>Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forty-hour+preservation+of+the+rabbit+heart%3A+Optimal+osmolarity%2C+%5BMg2%2B%5D%2C+and+pH+of+a+modified+UW+solution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).</li>
<li>Hall, S. K., Fry, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnesium+affects+excitation%2C+conduction%2C+and+contraction+of+isolated+mammalian+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), Pt 2 622-633 (1992).</li>
<li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Slices+from+Adult+Mammalian+Hearts+as+a+Model+for+Pharmacological+Drug+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+cardiac+tissue+slices%3A+An+organotypic+pseudo+two-dimensional+model+for+cardiac+biophysics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).</li>
<li>Thomas, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Myocardial+Slice+Culture+Model+Reveals+Alpha-1A-Adrenergic+Receptor+Signaling+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%3A+Basic+to+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart.</a> Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).</li>
<li>Perreault, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+basis+of+negative+inotropic+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+in+human+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).</li>
<li>Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+desensitization+of+the+myocardial+contractile+apparatus+forcalcium%3A+A+new+concept+for+improving+tolerance+to+cold+ischemia+in+human+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cardio-thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium.</a> European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).</li>
<li>Horiuti, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+action+of+2%2C+3-butanedione+2-monoxime+on+contraction+of+frog+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).</li>
<li>Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diacetyl+monoxime+on+cardiac+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).</li>
<li>Sellin, L. C., Mcardle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Effects+of+2%2C3+Butanedione+Monoxime%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime.</a> Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).</li>
<li>Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEghbali-Webb%2C+M+%22Novel+Methods+in+Molecular+and+Cellular+Biochemistry+of+Muscle%22">Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle</a>. Pierce, G. N., Claycomb, W. C. , Springer US. 195-198 (1997).</li>
<li>Camelliti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+heart+slices+are+a+multicellular+system+suitable+for+electrophysiological+and+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).</li>
<li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10, 2168(2019).</li>
<li>Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Slices%3A+an+Intermediate+Complexity+Platform+for+Translational+Cardiovascular+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Drugs+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管分离活体心肌细胞的技术已有40多年的历史，并且至今仍是心脏研究中许多实验方法的前提条件，但该技术仍然具有挑战性，结果难以预测。通过冠状动脉灌注酶溶液来分离心肌细胞的方法常用于小型动物心脏，可获得大量存活细胞。然而，该方法需要相对复杂的系统和专业技术。此外，由于人类组织样本通常体积较小或缺乏冠状动脉分支，大多不适合采用此法，因此亟需开发新的方法以分离人类心肌细胞。本文所述方案基于无创性制备薄层心脏组织切片，随后进行酶消化处理。该方法适用于动物心脏及人类心肌组织样本，例如左心室辅助装置植入术中获取的心尖组织芯、室间隔切除术中的心内膜心肌活检样本，或移植摘除的心脏（见补充表1），能够稳定地获得足量的存活且耐受钙离子的心肌细胞，可用于后续实验，如心肌细胞培养17。
与使用剪碎的组织块相比，采用振动切片机切割组织切片获得心肌细胞的得率更高，其主要原因可能是在切片过程中对心肌细胞的损伤程度较低。当无法进行冠状动脉灌注时，必须通过切片或剪碎组织样本来增加消化酶的作用接触面积。将组织切成约8 mm × 8 mm ...

一项开创性的技术为深入理解心肌细胞生理学铺平了道路，即从完整心脏中分离出存活的心室心肌细胞1。分离的心肌细胞可用于研究正常细胞的结构与功能，或体内实验所导致的后果；例如，评估在心脏疾病动物模型中细胞电生理学或兴奋-收缩耦联的变化。此外，分离的心肌细胞还可用于细胞培养、药理学干预、基因转导、组织工程以及许多其他应用。因此，高效的心肌细胞分离方法对基础和转化心脏研究具有根本性的重要价值。
通常通过冠状动脉灌注含有粗制胶原酶和/或蛋白酶溶液的方法，从小型哺乳动物（如啮齿类动物）以及大型哺乳动物（如猪或狗）中分离心肌细胞。该方法被称为心肌细胞分离的“金标准”，可获得高达70%的活细胞得率2。该方法也已用于人类心脏，能够获得可接受的心肌细胞得率3,4,5。然而，由于冠状动脉灌注仅在完整心脏或含有冠状动脉分支的大块心肌组织可获取时才可行，而大多数人类心脏标本体积较小且缺乏合适的血管结构，因此不适合采用此方法。因此，人类心肌细胞的分离具有较大挑战性。
人类心肌标本主要由大小不一的组织块（约 0.5 × 0.5 × 0.5 cm 至 2 × 2 × 2 cm）组成，通常通过心内膜心肌活检6、室间隔切除术7、心室辅助装置（VAD）植入术8或心脏移植术中摘除的心脏9获得。心肌细胞分离的常用方法首先使用剪刀或手术刀将组织剪碎。随后将组织浸入无钙或低钙缓冲液中，以破坏细胞间的连接。接着使用粗制酶提取物或纯化的酶（如蛋白酶（例如胰蛋白酶）、胶原酶、透明质酸酶或弹性蛋白酶）进行多次消化，从而降解细胞外基质并释放心肌细胞。最后的关键步骤是需谨慎恢复生理浓度的钙离子，否则可能因钙反常现象导致细胞损伤10,11,12。该分离方法操作简便，但通常效率较低。例如，有研究发现，为获得足够数量可用于后续实验的心肌细胞，几乎需要使用近 1 g 的心肌组织13。产量较低的可能原因之一是组织剪碎过程相对剧烈，这可能会特别损伤位于组织块边缘的心肌细胞&#160;，而这些细胞恰恰最有可能通过酶消化被释放出来。
影响从人体标本中分离细胞效率和质量的另一个因素是组织缺血持续时间。大多数方案均指出，将样本快速转运至实验室是获得良好&#160;结果的前提条件。这使得人类心室心肌细胞的研究仅限于邻近心脏外科设施的实验室开展。这些限制共同导致难以在人类心肌细胞中验证来自动物模型的重要发现。因此，亟需改进细胞分离方案，以实现仅用少量组织即可获得较高兴奋肌细胞得率，并最好能在较长转运时间后仍避免严重损伤。
本文介绍了一种基于酶消化法的分离方案，所用材料为使用振动切片机（vibratome）制备的薄层心肌组织切片14,15。我们证明，与使用剪刀剪碎的组织块相比，从组织切片中进行细胞分离的效率显著更高。该方法不仅能够从小量心肌组织中获得高产量的活人源心肌细胞，还可适用于在低温心脏停搏液中储存或运输长达36小时的组织样本。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3-丁二酮一肟</td><td>Carl Roth</td><td>3494.1</td><td>纯度&gt;99%</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Carl Roth</td><td>163.2</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>肌酸一水合物</td><td>Alfa Aesar</td><td>B250009</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Merck</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>P017.1</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酸</td><td>Fluka Biochemica</td><td>49450</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Carl Roth</td><td>6351.5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; × 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth</td><td>A537.1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-7506</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth</td><td>8551.2</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;染料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>FluoVolt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F10488</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;酶&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>I型胶原酶CLS</td><td>Worthington</td><td>LS004196</td><td>用于人组织，浓度为 4 mg/mL&lt;br/&gt;（活性：280 U/mg）</td></tr><tr><td>II型胶原酶CLS</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>用于大鼠组织，浓度为 1.5 mg/mL&lt;br/&gt;（活性：330 U/mg）</td></tr><tr><td>蛋白酶XIV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8038</td><td>用于大鼠组织，浓度为 0.5 mg/mL&lt;br/&gt;（活性 &amp;ge; 3.5 U/mg）</td></tr><tr><td>蛋白酶XXIV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5147</td><td>用于人组织，浓度为 0.5 mg/mL&lt;br/&gt;（活性：7–14 U/mg）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪（LSR Fortessa）</td><td>BD Bioscience</td><td>649225</td><td></td></tr><tr><td>离心管，15 mL</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>离心管，50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>小型摇床</td><td>Edmund B&amp;uuml;hler</td><td>KS-15 B control</td><td>振荡方向：水平</td></tr><tr><td>一次性塑料巴斯德吸管</td><td>Carl Roth</td><td>EA65.1</td><td>用于细胞吹打时，仅使用尖端内径 &amp;ge;2 mm 的吸管</td></tr><tr><td>镊子</td><td>FST</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>加热块</td><td>VWR</td><td>BARN88880030</td><td></td></tr><tr><td>尼龙网滤器，180 &amp;micro;m</td><td>Merck</td><td>NY8H04700</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿 100，标准型</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿 35，标准型</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿 60，标准型</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机（VT1200S）</td><td>Leica</td><td>1491200S001</td><td>配备 VibroCheck，用于红外辅助校正 z 轴偏转</td></tr></tbody></table>

从振动切片机制备的心肌薄片中分离人类心室心肌细胞

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

从动物和人类心脏中分离心室心肌细胞是心脏研究中的一项基本方法。动物心肌细胞通常通过冠状动脉灌注消化酶进行分离。然而，人类心肌细胞的分离具有挑战性，因为人类心肌标本通常无法进行冠状动脉灌注，而其他替代分离方案所获得的活细胞产量较低。此外，人类心肌标本十分稀有，仅在具备现场心脏外科手术条件的机构中才能定期获得。这阻碍了从动物心肌细胞研究结果向人类心肌细胞的转化应用。本文介绍了一种可靠的实验方案，可高效地从人类和动物心肌组织中分离心室心肌细胞。为了在尽量减少细胞损伤的同时增加组织的表面积与体积比，使用振动切片机（vibratome）将心肌标本切成300 µm厚的组织切片。随后用蛋白酶和胶原酶对组织切片进行消化。本研究首先采用大鼠心肌组织建立该方案，并通过流式细胞术细胞计数法量化获得的存活且耐钙的心肌细胞产量。与常用的组织块法相比，本方法获得的杆状心肌细胞产量显著更高（41.5 ± 11.9 vs. 7.89 ± 3.6%，p &#60; 0.05）。该方案进一步应用于衰竭和非衰竭的人类心肌组织，结果显示细胞产量与大鼠心肌组织相当，且再次显著高于组织块法（45.0 ± 15.0 vs. 6.87 ± 5.23 个细胞/mg，p &#60; 0.05）。值得注意的是，采用本方案可从极少量组织（&#60;50 mg）中分离出足够数量的存活人类心肌细胞（9–200 个细胞/mg）。因此，该方法适用于人类和动物心脏的健康及衰竭心肌组织。此外，即使人类心肌标本在低温停搏液中冷藏保存长达36小时，仍可从中分离出具有兴奋性和收缩功能的心肌细胞，这使得该方法对于不具备现场心脏外科手术条件的机构中的实验室尤为实用。

为验证分离效率，本方案应用于大鼠心肌组织，所得存活心肌细胞数量与通过冠状动脉灌流法及小块组织分离法（块状组织分离法）获得的数量进行比较。 图2）。心肌块分离和组织切片分离均来自同一心脏。然而，冠状动脉灌流分离则使用整个心脏。冠状动脉灌流主要获得杆状且具有横纹的心肌细胞。通过心肌切片分离得到的杆状细胞比例较低，但总数仍然较高。相比之下，从组织块分离后仅获得少量杆状细胞（图2A). 采用流式细胞术对结果进行定量比较。由于心肌细胞相对较大且具有横纹结构，其前向散射光和侧向散射光信号通常较强。利用这些特性，通过流式细胞分析仪并结合简单的设门策略，可对杆状心肌细胞进行计数，从而区分杆状与过度收缩或圆形的心肌细胞。补充图1。代表性散点图如图所示 图2B统计分析显示，从组织切片中分离得到的心肌细胞门CM1细胞数量显著高于从组织块中分离的结果（分别为41.5 ± 11.9% 与 7.89 ± 3.6%；n = 3次分离；p < 0.05）。 ...

本文介绍了一种从振动切片机切割的心肌薄片中分离人和动物心室心肌细胞的实验方案。仅需少量组织（&#60;50 mg），即可获得高产量的耐钙细胞（最多可达200个细胞/mg）。该方案适用于经历长达36小时冷缺血暴露的心肌组织。

从动物和人心脏中分离心室心肌细胞是心脏研究中的一项基本方法。动物心肌细胞通常……

该方案适用于人和动物心脏的样本，即使经过数小时的运输时间仍可使用。从振动切片机切割的组织切片中，每毫克可分离出多达200个心肌细胞。对心肌细胞进行电生理、结构和生化分析，有助于发现并更深入地理解心脏疾病的机制。用20毫升冷切割液填充100毫米组织培养皿后，将组织样本放入培养皿中。将培养皿置于冷却至4摄氏度的冰盘上。请注意，来自动物尤其是人类的活体组织样本可能具有传染性。使用剪刀或解剖刀去除样本上多余的纤维化组织和心外膜脂肪。对于较大的组织样本，为获得最佳的振动切片机处理效果，需用解剖刀将组织切成8毫米的立方体。对于来自活检的小样本，则无需此步骤。可通过心外膜脂肪层来识别心外膜。去除多余脂肪后，将组织块放入培养皿中，心外膜朝下。为进行组织包埋，将400毫克低熔点琼脂糖在10毫升切片溶液中煮沸。用一个10毫升注射器吸取热溶解的琼脂糖凝胶。密封注射器，并将其置于37摄氏度水浴中至少15分钟，使琼脂糖达到平衡。使用镊子将修整好的样本转移至干净的35毫米组织培养皿中，使心外膜朝下。然后，用无菌棉签去除标本上多余的液体。用镊子固定标本，防止其移动。将琼脂糖溶液从注射器中排出并覆盖在标本上，确保标本完全浸没。立即将培养皿置于冰上，让琼脂糖凝固10分钟。将未使用的刀片安装到振动切片机的刀片架上。如果可能，通过调整刀片的Z轴偏转来校准振动切片机。使用解剖刀切取一块适合振动切片机样品托的琼脂糖组织块。为确保稳定性，应使组织仍充分浸没在琼脂糖中，且琼脂糖边缘至少保留八毫米。在样品托上涂抹一层薄薄的氰基丙烯酸盐胶水，然后轻轻将琼脂糖组织块按压到托上。用切割液构建振动切片机浴槽。然后，将碎冰加入振动切片机的外部冷却罐中，以在整个切片过程中维持 4 至 6 摄氏度的温度。将含有琼脂糖组织块的样品架放入振动切片机的切片浴中。根据文中所述的振动切片机设置，切出 300 µm 厚的切片。必须平行于心外膜制备切片，因为心室壁中心肌细胞纤维的排列方向与此一致。否则会造成过度损伤。使用标准光学显微镜检查心肌细胞和组织切片的排列情况。为避免损伤组织，应握住琼脂糖而非组织本身。心肌细胞纤维应均匀排列，且心肌细胞不应收缩。将加热板置于实验室摇床之上，并加热至37摄氏度。将实验室摇床调至 65 RPM 启动。将蛋白酶溶解于 2 毫升溶液一中，将胶原酶溶解于 2 毫升溶液一中。但不要混合蛋白酶和胶原酶。向胶原酶溶液中加入氯化钙，使其终浓度为5 µM。将两种溶液在37°C下孵育。使用镊子将组织切片转移至洁净的 60 毫米组织培养皿中，加入 5 毫升预冷的切割溶液。将培养皿置于冰上或冷板上，用刀片或镊子小心去除组织周围的琼脂糖。为进行组织切片的初次洗涤，将一个洁净的35毫米组织培养皿置于加热刀片上，并加入2毫米预热的溶液一。将一至两个组织切片转移至已准备好的培养皿中。然后使用1 mm移液器进行洗涤步骤。洗涤切片后，从培养皿中移除溶液一，并加入2 mL蛋白酶溶液。将切片置于加热板上，在65 RPM转速下振荡孵育12分钟。用两毫升预热的溶液一将组织切片再清洗两次。接着，从培养皿中移除溶液一，加入两毫升胶原酶溶液。将切片置于加热板上，以65 RPM的振荡速度孵育至少30分钟。孵育15分钟后，在光学显微镜下观察培养皿，检查是否有游离的单个心肌细胞。每5分钟检查一次，直至观察到单个心肌细胞。随后，用2毫升预热的溶液二洗涤组织片两次，以终止消化。加入两毫升溶液二，重新填满培养皿。使用精细镊子小心地将组织切片的纤维拉开。继续小心操作，避免损伤心肌细胞。用一次性移液器反复吹打数次。然后在光学显微镜下观察培养皿，确认杆状心肌细胞已分离。将培养皿放回37°C的加热板上，并通过振荡进行搅动。通过加入10毫摩尔和100毫摩尔的氯化钙储备液，缓慢将组织悬液中的钙离子浓度从5微摩尔提高至1.5毫摩尔。当钙离子浓度升高完成后，停止悬液的振荡，然后用镊子去除任何残留的未消化组织块。接下来，使用1000微升移液器，从悬浮液上层缓慢移除1/3的溶液，避免吸入心肌细胞。然后向细胞中加入700微升溶液三。振荡10分钟后，重复上述洗涤步骤。将悬液转移至15毫升离心管中，在室温下静置，使心肌细胞沉降，时间不少于10分钟，不超过30分钟。完全去除上清液，并将沉淀重悬于改良的Tyrode溶液或所需的实验缓冲液中。使用光学显微镜检查细胞质量。30%至50%的心肌细胞应呈杆状，表面光滑且无膜泡，具有清晰的横纹。为验证分离效率，本方案已应用于大鼠心肌组织。与通过冠状动脉灌注及从小块组织中分离的方法相比，采用该方案时观察到的杆状细胞比例较低，但细胞总数仍然较高。相比之下，从组织块中分离得到的杆状细胞较少。采用流式细胞术对结果进行定量比较。从组织切片中分离心肌细胞的得率未达到冠状动脉灌注所获得的水平。但与心肌细胞分离相比，从组织块中提取可获得显著更高的产量。接下来，该方案被应用于人的心肌组织。从心肌切片中分离得到了较高的细胞数量和大量杆状的人类心肌细胞。且仅有少量呈圆形的心肌细胞。从心肌薄片中分离得到的杆状心肌细胞数量显著高于从组织块中分离的结果。光度法定量分析证实，从心肌薄片中分离后的心肌细胞存活力明显更高。采用所述方案分离的人类细胞可用于结构分析。α-辅肌动蛋白染色显示，静息状态心肌细胞中具有致密且规则的Z线结构，平均肌节长度为1.92 µm。L型钙通道（LTCC）和兰尼碱受体（RyR）染色显示，两者清晰的簇状信号在细胞膜及T小管附近共定位。分离的心肌细胞具有兴奋性，可用于细胞电生理学或兴奋-收缩耦联的研究。动作电位的形态和持续时间处于其他研究者所报道的来自衰竭人心脏的室性心肌细胞的正常范围内。通过Khan vocal线扫描记录的钙瞬变显示，刺激后出现明显的上升支。并且具有可接受的信噪比。通过下部细胞边界的偏移可以观察到心肌细胞因收缩而发生的缩短。由于本方案获得的分离心肌细胞数量较多，可进行细胞培养。这可能实现人类心肌细胞的基因转移、药理学测试和组织工程。一个重要的应用是在人类细胞中验证来自动物模型的研究结果。心力衰竭是一种临床综合征，治疗选择非常有限。改进的心肌细胞分离技术将有助于确定用于诊断和未来治疗的细胞靶点。

isolation-human-ventricular-cardiomyocytes-from-vibratome-cut

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

人体心室心肌细胞与颤音-切切心肌切片分离

我们描述了一种可用于结合细胞内Ca2+浓度测量与电生理膜片钳研究的人类心房肌细胞的分离方法。...

人房颤肌细胞的分离以同时测量Ca2+瞬变和膜电流

目前关于心脏疾病细胞基础的研究主要依赖于动物模型。本文描述并验证了一种从人类心室心肌的小型手术样本中获取单个活心肌细胞的创新方法。所获得的人类心室心肌细胞可用于电生理学研究和药物测试。...

从新鲜手术样本中分离与功能表征人类心室心肌细胞

已开发并描述了多种从大鼠心脏中分离不同心肌细胞类型的方案。本文介绍了一种优化的方案，可从单次制备中分离出高质量的主要心肌细胞类型（心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞），从而降低实验成本。...

从成年大鼠心脏中同时分离高质量心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞

在此，我们描述了成年小鼠心室切片的制备方法及其在尖电极动作电位记录中的应用。这些多细胞制备物提供了结构完整的 体内 类似组织的结构，使其成为电生理学和药理学研究的有价值模型 体外.

用于电生理研究的小鼠短轴心室心脏切片

本方案采用组织块消化法从成年小鼠心脏中分离单个心房心肌细胞。该方法可用于分离右心房或左心房心肌细胞，进而用于膜片钳实验中对心房心肌细胞电生理特性的表征研究。...

从成年小鼠中分离心房心肌细胞

本文描述了一种从单个成年小鼠心脏的心房和心室同时分离心肌细胞和非心肌细胞的方法。该方案可稳定获得高活力的心肌细胞和非心肌细胞，并详细说明了适用于细胞表型鉴定和体外分析的优化细胞特异性培养条件。...

成年小鼠心脏中同时分离与培养心房心肌细胞、心室心肌细胞及非心肌细胞

一种用于从小鼠中分离心肌细胞的顺行灌流方法

小鼠模型可用于研究心律失常发生的关键机制。为此，需要高质量的心肌细胞以进行膜片钳测量。本文介绍了一种通过逆行酶解Langendorff灌流法分离小鼠心房和心室肌细胞的方法，该方法可实现钙瞬变与L型钙电流的同步记录。...

分离高质量小鼠心房和心室肌细胞用于同时检测Ca2+瞬变和L型钙电流

在心脏病学领域，细胞和分子功能实验的金标准是心肌细胞。本文介绍了对非兰格多夫技术进行的改进，用于分离小鼠心肌细胞。...

一种简单高效且可重复分离小鼠心肌细胞的方法

本方案描述了从成年、幼年、幼虫期及胚胎期斑马鱼（Danio...

用于电生理研究的成年、幼年、幼虫及胚胎斑马鱼心脏和血管平滑肌细胞的分离

我们提出了一种实验方案 离体 人室心肌组织的培养。它允许对收缩力和收缩动力学进行详细分析，并可施加前负荷和后负荷以模拟 在体 更接近生理环境。...

人源心肌组织长期培养的制备

学习从振动切片心肌组织中分离心室心肌细胞的方法，适用于人和动物心脏样本。该技术可获取高产量钙耐受细胞，支持电生理、结构及生化分析，助力研究心脏疾病机制。

从振动切片机制备的心肌薄片中分离人类心室心肌细胞

探索更多视频