Name: HDM过敏原中免疫原RNA物种的识别和特征，可调节嗜酸性肺炎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 了解如何识别屋尘螨过敏原中免疫原性双链RNA物种，并评估其在小鼠模型中调节嗜酸性肺炎和先天免疫反应的能力。该方法简单高效，可用于研究过敏性哮喘的免疫机制。

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感谢 Karla Gorena 女士在流式细胞术方面的技术支持。L.S. 受中国国家留学基金管理委员会和湖南省研究生创新基金（CX201713068）资助。H.H.A. 受沙特阿拉伯萨卡凯阿尔-朱夫大学应用医学科学学院临床实验室科学系资助。X.D.L. 受德克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥医学院启动基金以及 Max 和 Minnei Voelcker 基金资助。

本研究所述实验程序已获德克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥分校机构动物照护与使用委员会批准。
1. 点印迹法检测屋尘螨总RNA中dsRNA结构的存在
<ol>
	<li>从过敏原、昆虫及非昆虫过敏原中提取总RNA
	<ol>
		<li>将采集的活体屋尘螨（HDM）、昆虫或非昆虫动物，或购自商业来源的样本放入50 mL离心管中，迅速用液氮冷冻2. 然后于 -70 &#176;C 用于后续总RNA提取。 
		注意：本实验选择屋尘螨（HDM）、昆虫和非昆虫动物，是因为它们是已知常见的过敏原来源。此外，这些生物的RNA是否具有免疫刺激功能尚不明确。</li>
		<li>转移适量（相当于 100 &#956;L 体积或更小的尘螨、昆虫或非昆虫动物，储存在 -70 &#176;C 加入含有珠子（1.4 mm 陶瓷球）的 2 mL 管中，然后将试管置于液氮中冷冻2 容器中放置约10分钟。</li>
		<li>用于总RNA提取时，加入1 mL基于硫氰酸胍的RNA提取试剂24 向每个试管中加入，然后使用高能细胞破碎仪在最大速度下破碎昆虫及非昆虫小型动物，持续45秒，并在冰上冷却。重复此步骤两次。</li>
		<li>将步骤1.1.3中的溶液转移至一个新的1.5 mL离心管中，并加入 200 &#956;L 加入氯仿至各管，涡旋混匀。在14,000 ×g条件下离心 x g 14 分钟 4 &#176;C.</li>
		<li>离心完成后，转移上层水相（200 &#956;L) 转移至含有 500 &#956;L 加入异丙醇以沉淀RNA沉淀物。切勿扰动中间相。上相与异丙醇的推荐体积比为1:2.5。</li>
		<li>轻柔涡旋混匀，然后将离心管在14,000 × g条件下离心 x g 14 分钟 4 &#176;C.</li>
		<li>小心吸除上清液，然后用 500 &#956;L 75%乙醇，7,500离心 x g 10 分钟 4 &#176;C. 小心移除所有液体，将沉淀空气干燥后，用 20-50 &#956;L 无RNase的H2O.</li>
		<li>使用分光光度计，按照以下参数测定RNA浓度：
		<ol>
			<li>打开相关软件，选择要测量的核酸类型。将样本类型更改为RNA。</li>
			<li>使用1-进行空白测定2 &#956;L 无RNase的H2O. 用无RNase的H2O. 现在，仪器已准备就绪，可进行测量。</li>
			<li>加载 1-2 &#956;L RNA样品的浓度并测定RNA浓度（&#956;g/&#956;L). 
			注意：RNA 在 260 和 280 nm 处的吸光度比值（A260/280）约为 2.0（1.9–2.2）时，通常被认为是“纯”的。若不能立即进行后续处理，应将 RNA 样品保存于 -70 ℃ &#730;C，并避免冻融循环，以保持RNA完整。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用dsRNA特异性J2抗体检测总RNA中的dsRNA结构
	<ol>
		<li>准备两份 20 &#956;L RNA 样本（200 ng/&#956;L）。一个经过RNase-III处理（1 &#956;L 用于 1 &#956;g RNA，于指定温度孵育 37 &#176;C 60 分钟），另一组不进行 RNase-III 处理。 
		注意：此处使用 RNase III 特异性降解 dsRNA，而不降解单链 RNA25.</li>
		<li>用铅笔在膜上标记出RNA样品将要点样的网格位置。</li>
		<li>斑点 2 &#956;L 200 纳克/&#956;L 将RNA样品转移至带正电荷的尼龙膜上。</li>
		<li>在紫外交联仪中以1,200微焦耳×100的剂量将样品交联至膜上。在样品点样位置重复步骤1.2.3和1.2.4两次。最终总量将达到0.8&#160;&#956;g 每块印迹。 
		注意：点样量不得超过 2 &#956;L 每次在膜上点样一个RNA样本。</li>
		<li>用含5%脱脂奶粉的TBS-T缓冲液在室温下振荡孵育1小时，以封闭非特异性结合位点。移除步骤1.2.5中的封闭液，加入以含1%脱脂奶粉的TBS-T缓冲液按1:1,000比例稀释的抗dsRNA J2抗体，于4°C振荡孵育过夜。 4 &#176;C.</li>
		<li>用 TBS-T 缓冲液洗涤膜 5 分钟，并重复此步骤 3 次。加入二抗（碱性磷酸酶标记的 Anti-Mouse IgG，用 1% 脱脂牛奶按 1:5,000 稀释），于室温在摇床上孵育 1 小时。用 TBS-T 缓冲液洗涤膜 5 分钟，并重复此步骤 3 次。</li>
		<li>加入底物（BCIP/NBT），孵育5-15分钟，直至出现理想的信号。</li>
		<li>通过用 ddH₂O 冲洗膜来终止反应2O.</li>
		<li>用纸巾将膜干燥，并用智能手机拍照（结果示例如下图所示） 图1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 采用RT-qPCR检测HDM总RNA刺激肺部ISGs表达的能力
<ol>
	<li>从小鼠肺组织中分离RNA 
	注意：小鼠（雌性，8–12 周龄，C57BL/6J）在特定无病原体条件下饲养。
	<ol>
		<li>用异氟烷短暂麻醉动物，随后通过气管内滴注给药 5 &#956;g （用……稀释） 80 &#956;L PBS) 经 RNase III 处理与未处理的 HDM RNA</li>
		<li>HDM RNA 处理后 16–18 小时，通过 CO2 吸入数分钟后，将小鼠置于平台上，用针固定四肢。</li>
		<li>用70%乙醇对小鼠进行消毒，然后使用灭菌剪刀从腹部开始沿中线剪开皮肤至颈部。</li>
		<li>用针固定皮肤，剪开肋骨以暴露肺部。取出整块肺组织，用冷的PBS冲洗。将肺组织置于滤纸上，分别从每个肺叶切取一小块组织放入含有珠子的2 mL离心管中（200-300 &#956;L 体积为1.4 mm的陶瓷珠。 
		注意：使用陶瓷珠的目的是研磨整肺组织</li>
		<li>将试管放入液氮中冷冻肺组织样本2 容器中放置约10分钟。</li>
		<li>添加 500 &#956;L 加入基于硫氰酸胍的RNA提取试剂至各管中，使用匀浆器破碎肺组织45秒。每次操作间将样本置于冰上冷却。重复此步骤两次。</li>
		<li>按照步骤 1.1.4–1.1.7 进行肺组织 RNA 提取。</li>
		<li>空气干燥沉淀，并用适量无RNase的H2O（约20-30 &#956;L).</li>
		<li>按照步骤1.1.8中所述方法测定RNA浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用RT-qPCR检测HDM RNA刺激肺部基因表达的能力。
	<ol>
		<li>使用 100 ng/&#956;L 以肺组织中提取的RNA为模板，按照参考方案进行cDNA合成26.</li>
		<li>设置一个 RT-qPCR 反应 10 &#956;L/well 使用上述生成的 cDNA 和基因特异性引物对，在 384 孔板中进行表1 和 表2).</li>
		<li>用透明粘性封膜严密密封各孔，涡旋混匀 30 秒。以 1,000 × g 离心平板 x g 30 秒，以收集各孔底部的样品。</li>
		<li>将 PCR 板装载到实时荧光定量 PCR 仪上，并使用热循环仪程序开始运行 RT-qPCR 反应（表3).</li>
		<li>程序完成后，将结果导出至电子表格文件，或使用制造商提供的软件进行数据分析（代表性结果如图所示） 图2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过流式细胞术分析 HDM RNA 对 BAL 和肺组织中嗜酸性粒细胞浸润的影响
<ol>
	<li>用于FACS分析的BAL液体采集
	<ol>
		<li>处死经HDM变应原提取物处理的小鼠（雌性，8-12周龄，C57BL/6J），处理方案依据所示实验设计进行 图3B）由 CO2 吸入</li>
		<li>将小鼠置于平台上，用针固定四肢。</li>
		<li>用70%乙醇对小鼠进行消毒。使用剪刀从腹部上方区域向颈部剪开皮肤。</li>
		<li>用镊子轻轻将唾液腺与胸骨舌骨肌小心分离，以暴露气管。用镊子将一根尼龙线（约10 cm）从气管下方穿过。</li>
		<li>在喉部下方约 2 mm 处的气管上做一切口，切口大小以刚好能插入导管为宜。切勿切断气管。用线将气管与导管结扎固定。</li>
		<li>用1 mL PBS+EDTA装填注射器，并将其连接至套管末端。将1 mL PBS+EDTA注入肺部，然后完全吸出液体。小心地将注射器从套管上取下并转移&#160;将溶液加入预置冰上的15 mL离心管中。</li>
		<li>用新鲜的PBS+EDTA重新装填注射器，并重复此步骤2次。</li>
		<li>离心步骤3.1.7中获得的含合并BAL的离心管，以500 × g离心沉淀细胞 x g 7 分钟 4 &#176;C记录BAL液体积，然后将上清液转移至两支1.5 mL离心管中，注意勿扰动沉淀。 
		注意：BAL 上清液可保存在 -70 &#176;C 用于后续分析，例如 ELISA。</li>
		<li>如果由于严重的肺部炎症导致沉淀物中存在红细胞，在去除上清液后，加入 500 &#956;L 加入红细胞裂解缓冲液，重悬混匀。将溶液转移至新的1.5 mL离心管中，以500 × g离心7分钟 x g 在 4 &#176;C.</li>
		<li>移除上清液，并将沉淀重悬于 150 &#956;L FACS缓冲液</li>
		<li>转移 150 &#956;L 将重悬的样品加入96孔板中，以500 × g离心7分钟 x g 在 4 &#176;C.</li>
		<li>迅速将培养板倒置在纸巾上，以收集位于孔底部的细胞。</li>
		<li>在含有 2.4G2 封闭抗体的 FACS 缓冲液中，用抗体对细胞进行染色（2.5 &#956;g / 100 &#956;L）。在室温下避光孵育平板30分钟。</li>
		<li>染色后，以500 × g离心培养板，使细胞沉淀 x g 7 分钟 4 &#176;C.</li>
		<li>将培养板倒置在纸巾上以去除染色液，然后通过重悬进行洗涤 100 &#956;L FACS缓冲液。接着，将培养板再次在500 × g下离心 x g 7 分钟 4 &#176;C 将培养板倒置在纸巾上，去除FACS缓冲液。</li>
		<li>将样品重悬于 150 &#956;L FACS 缓冲液，并将样品转移至含有 FACS 缓冲液的 FACS 管中 350 &#956;L FACS 缓冲液。加入 25 &#956;L 向每个样本中加入计数微球。样本现可进行流式细胞术分析。 
		注意：如所示，使用抗体标记支气管肺泡灌洗液中的多种细胞类型。流式细胞术检测前加入计数微球。流式细胞术数据采用市售软件进行分析。参见 图3 和 表4 用于门控策略。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于FACS分析的肺组织消化
	<ol>
		<li>按照步骤 3.1.1 - 3.1.3 进行操作。</li>
		<li>从腹部开始用灭菌剪刀剪开皮肤至颈部。用针固定皮肤，剪开肋骨以暴露肺脏。</li>
		<li>取出整个肺组织，用冷的PBS洗涤。将样品置于含有 50 &#956;L 肺组织消化液</li>
		<li>用弯头剪刀将肺组织剪成小块。将肺组织转移至6孔板中，加入8 mL肺组织消化液。将培养板置于摇床中 37 &#176;C 孵育箱中孵育45分钟。</li>
		<li>孵育后，使用1.5 mL离心管的管盖研磨肺组织。将一个 70 &#181;m 将滤器置于新的6孔板上，并通过滤器加入样品 0.22 &#181;m 过滤器</li>
		<li>将过滤后的溶液转移至15 mL离心管中，然后在500 ×g条件下离心 x g 7 分钟 4 &#176;C吸弃上清液，将沉淀重悬于1 mL红细胞裂解缓冲液中，冰上静置3 min。</li>
		<li>将样品转移至 1.5 mL 离心管中，在 500 ×g 条件下离心 x g 7 分钟 4 &#176;C重复 2 次</li>
		<li>用 1 mL FACS 缓冲液洗涤肺细胞 2 次。吸除上清液，将沉淀重悬于 1 mL FACS 缓冲液中，然后转移 100 &#956;L 将样品加入96孔板中。</li>
		<li>将培养板以500 × g离心7分钟 x g 在 4 &#176;C按照肺组织消化样本细胞染色的步骤（3.1.13 至 3.1.16）进行操作，以用于流式细胞术分析支气管肺泡灌洗液样本。 
		注意：肺部嗜酸性粒细胞经指定抗体标记后，与计数微球混合，用于后续流式细胞术分析。流式细胞术数据采用配套软件进行分析。参考 图3 用于评估屋尘螨RNA诱导的免疫反应。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 统计分析
<ol>
	<li>使用商业化的软件进行统计分析。</li>
	<li>通过非配对双尾 Student t 检验比较两组数据，确定 p 值。</li>
	<li>根据参考微球（上图）的绝对计数，使用以下公式计算嗜酸性粒细胞的绝对数量</li>
</ol>
<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/61183/61183equ01.jpg" />
<ol start="4">
	<li>确定 p 采用双因素方差分析（two-way ANOVA）及Sidak多重比较检验对多个组别进行比较。</li>
	<li>考虑一个 p 将小于 0.05 的值视为具有统计学意义。 p 数值在图中以 *p 标注 &#60;0.05，**p&#60;0.01，***p&#60;0.001，以及 ****p&#60;0.0001. 
	注意：所有缓冲液配方均以 表5.</li>
</ol>

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<li>Schlee, M., Hartmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discriminating+self+from+non-self+in+nucleic+acid+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing.</a> Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).</li>
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<li>ShortCut RNase III Digestion Protocol (M0245). New England Biolabs. , Available from: 
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<li>IScript cDNA Synthesis Kit Technical Manual. , Available from: 
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<li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+and+sex+dimorphisms+contribute+to+the+severity+of+bleomycin-induced+lung+injury+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).</li>
<li>Card, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+differences+in+murine+airway+responsiveness+and+lipopolysaccharide-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).</li>
<li>Gueders, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+asthma%3A+a+comparison+between+C57BL%2F6+and+BALB%2Fc+strains+regarding+bronchial+responsiveness%2C+inflammation%2C+and+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production.</a> Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).</li>
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本方案描述了如何评估与过敏原相关的微生物RNA的免疫刺激特性及其在过敏性哮喘小鼠模型中对嗜酸性粒细胞肺部炎症发展的效应。尽管长链双链RNA（dsRNA）已被公认是多种病毒复制过程中的中间产物，可强烈激活哺乳动物细胞的干扰素反应，但其在屋尘螨（HDM）过敏原中的存在直到我们近期的工作15才被揭示。本文所采用的RNA点杂交、逆转录定量PCR（RT-qPCR）和流式细胞术（FACS）分析相结合的方法，可为解析环境过敏原中参与调控过敏原诱导的嗜酸性粒细胞炎症的关键固有免疫组分（如dsRNA种类）提供一个良好范例。
在本实验方案中，采用RNA点杂交法，利用小鼠单克隆抗体J2检测天然变应原中双链RNA（dsRNA）结构的存在。该抗体可特异性结合长度不小于40 bp的dsRNA，且不受序列影响。该方法具有高度可靠性，因为J2抗体仍可识别经RNase T1（特异性切割单链RNA的内切核酸酶）预处理的dsRNA样品，但无法识别经RNase III（特异性切割dsRNA的内切核酸酶）预处理的样品。然而需要指出的是，一种广泛使用的dsRNA合成类似物——多...

根据Strachan最初提出的卫生假说1，儿童早期接触内毒素等环境微生物因子可预防过敏性疾病的发生2,3。在微生物感染（例如病毒感染）过程中，宿主先天免疫系统对异源核酸（RNA/DNA）的识别可触发防御反应4,5,6。然而，屋尘螨（HDM）或其他昆虫过敏原中是否存在具有免疫原性的核酸（如长链双链RNA（dsRNA））及其流行程度目前尚不清楚。本实验方案旨在确定屋尘螨或昆虫及非昆虫过敏原中是否含有能够激活保护性免疫反应的长链dsRNA，以抑制过敏性哮喘小鼠模型中严重的嗜酸性粒细胞肺部炎症的发展。本文提供了三种简单快速的方法，用于评估屋尘螨总RNA中调控过敏原诱导的嗜酸性粒细胞肺部炎症所必需的结构决定因素。
黏膜免疫系统是人体最大的免疫器官，在抵御微生物感染和过敏性损伤方面发挥着宿主防御的第一道防线作用7,8。长链双链RNA（dsRNA）是多种病毒复制过程中的中间产物，已被证实可作为病原体相关分子模式（PAMP），通过Toll样受体3（TLR3）强烈激活先天免疫反应，诱导干扰素刺激基因（ISGs）的表达9,10,11,12,13,14。我们近期研究发现，屋尘螨（HDM）总RNA中含有dsRNA结构，当通过气管内滴注方式在HDM提取物诱导的小鼠过敏性哮喘模型中给予时，可上调ISGs的表达，并减轻严重的嗜酸性粒细胞肺部炎症15。肺部炎症的严重程度通过流式细胞术分析支气管肺泡灌洗液（BAL）及肺组织中的免疫细胞类型来确定16,17,18,19,20。
本方案包含三个实验：1）利用小鼠单克隆抗体J2通过RNA点印迹法快速检测双链RNA（dsRNA）结构，该抗体能够以序列无关的方式特异性结合长度≥40 bp的dsRNA；2）通过RT-qPCR检测干扰素刺激基因（ISGs）的诱导水平，快速评估免疫刺激性RNA在小鼠肺组织中的体内效应；3）在屋尘螨（HDM）诱导的肺部炎症背景下，采用流式细胞术对支气管肺泡灌洗液（BAL）和肺组织中的嗜酸性粒细胞进行精确定量分析。
上述检测方法不仅可用于研究过敏性肺部疾病，还可用于研究呼吸道细菌和病毒感染。例如，特异性识别双链RNA的J2抗体还可应用于其他实验，如免疫亲和层析、免疫组织化学、酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫染色21,22,23。此外，在支气管肺泡灌洗液收集之后，还可采用多种下游应用来定量分析可溶性成分，如通过ELISA检测细胞因子和趋化因子，并对气道内细胞（例如肺泡巨噬细胞）进行转录谱分析。尽管文献中已有多种评估肺部状况的实验方案，但这些方案大多集中于靶点验证。本文所述方法可用于鉴定环境过敏原中调控过敏性疾病发生发展的关键组分。

<table><tbody><tr><td>0.40 &amp;micro;m Falcon 细胞筛</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>TH.Geyer</td><td>7696702</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>TH.Geyer</td><td>7696705</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>绝对计数微球</td><td>Life Technologies Europe B.V.</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>ACK-红细胞裂解缓冲液</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hybond-N+ 膜</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>蚂蚁</td><td>San Antonio</td><td>备注：本地采集</td><td></td></tr><tr><td>抗体稀释缓冲液</td><td></td><td>（参见表5配方）</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11b V450 大鼠单克隆抗体（克隆号 M1/70）</td><td>BD Bioscience</td><td>560456</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11c PE-Cy7 单克隆抗体（克隆号 N418）</td><td>BioLegend</td><td>117317</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD19 Alexa Fluor 647 单克隆抗体（克隆号 1D3）</td><td>eBioscience</td><td>15-0193-81</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3e APC 单克隆抗体（克隆号 145-2C11）</td><td>Invitrogen</td><td>15-0031-81</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45 APC-Cy7 单克隆抗体（克隆号：30-F11）</td><td>BioLegend</td><td>103130</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>抗小鼠可固定活力染料 eFluor 506</td><td>Invitrogen</td><td>65-0866-14</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG (H+L)，碱性磷酸酶偶联物</td><td>Promega</td><td>S3721</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly-6G FITC 单克隆抗体（克隆号 RB6-8C5）</td><td>Invitrogen</td><td>11-5931-82</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>抗小鼠 MHC II APC-eFluor 780 单克隆抗体（克隆号 M5/114.15.2）</td><td>eBioscience</td><td>47-5321-80</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>抗小鼠 Siglec-F PE 单克隆抗体（克隆号 E50-2440）</td><td>BD Pharmingen</td><td>552126</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>BCIP/NBT 底物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI34042</td><td></td></tr><tr><td>封闭缓冲液</td><td></td><td>（参见表5配方）</td><td></td></tr><tr><td>套管，20G × 1.5&amp;rdquo;</td><td>CADENCE SCIENCE</td><td>9920</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>CFX384 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1855485</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>蟑螂</td><td>Greer Laboratories</td><td>B26</td><td></td></tr><tr><td>计数微球</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>D. farinae</td><td>Greer Laboratories</td><td>B81</td><td></td></tr><tr><td>D. pteronyssinus</td><td>Greer Laboratories</td><td>B82</td><td></td></tr><tr><td>Denville 带盖细胞培养板，96 孔细胞培养板</td><td>Thomas Scientific</td><td>1156F03</td><td></td></tr><tr><td>数字干浴器 - 四模块</td><td>Universal Medical, Inc.</td><td>BSH1004</td><td></td></tr><tr><td>蚯蚓</td><td>San Antonio</td><td>备注：本地采集</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>FACS 缓冲液</td><td></td><td>（参见表5配方）</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 圆底聚丙烯管，5 mL</td><td>STEMCELLTM TECHNOLOGIES</td><td>38056</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪（BD FACS Celesta）</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蝇</td><td>Greer Laboratories</td><td>B8</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>HT-DNA</td><td>Sigma</td><td>D6898</td><td></td></tr><tr><td>体内应用单克隆抗体抗小鼠 CD16/CD32（克隆号：2.4G2）</td><td>Bio X Cell</td><td>BE0307</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成试剂盒</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Abbott Labs</td><td>sc-363629Rx</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2618500</td><td></td></tr><tr><td>J2 抗双链 RNA 单克隆抗体</td><td>SCICONS</td><td>10010200</td><td></td></tr><tr><td>肺组织消化液</td><td></td><td>（参见表5配方）</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Matrix D</td><td>MP Biomedicals</td><td>116913050-CF</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Matrix D，2 mL 管</td><td>MP Biomedicals</td><td>SKU:116913100</td><td></td></tr><tr><td>小鼠（雌性，8–12 周龄，C57BL/6J）</td><td>Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，1.5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30120.094</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>CK30</td><td></td></tr><tr><td>Mini-BeadBeater</td><td>Homogenizers</td><td>SKU:BS:607</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>Biospec</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>蚊子</td><td>Greer Laboratories</td><td>B55</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C</td><td>Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply</td><td>TSCND2000C</td><td></td></tr><tr><td>针头，21 G × 1 1/2 英寸</td><td>BD Biosciences</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1706404</td><td></td></tr><tr><td>尼龙线</td><td>Dynarex</td><td>3243</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>RNase III</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2290</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2283</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-6802</td><td></td></tr><tr><td>摇床或小型实验室混合器</td><td>Boekel Scientific</td><td>201100</td><td></td></tr><tr><td>SPHERO AccuCount 荧光微球</td><td>Spherotech</td><td>ACFP-70-5</td><td>1:10 稀释</td></tr><tr><td>蜘蛛</td><td>San Antonio</td><td>备注：本地采集</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td>（参见表5配方）</td><td></td></tr><tr><td>TBS-T</td><td></td><td>（参见表5配方）</td><td></td></tr><tr><td>总细胞培养基</td><td></td><td>（参见表5配方）</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400 紫外交联仪</td><td>LabX</td><td>20447</td><td></td></tr><tr><td>黄蜂</td><td>San Antonio</td><td>备注：本地采集</td><td></td></tr></tbody></table>

鉴定和表征尘螨过敏原中调节嗜酸性粒细胞肺部炎症的免疫原性rna种类

Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation

环境过敏原（如屋尘螨（HDM））通常以复杂形式存在，其中既包含可引发异常2型免疫应答的过敏性蛋白，也含有可诱导固有免疫应答的微生物成分。这些与过敏原相关的微生物组分在调控2型炎症性疾病（如过敏性哮喘）的发生发展中起着重要作用。然而，其潜在机制在很大程度上仍不明确。本文所述方案旨在确定过敏原相关免疫刺激性RNA的结构特征及其体内活性。具体而言，检测常见过敏原中是否存在可激活肺部干扰素（IFN）应答并抑制&#160;在尘螨（HDM）诱导的过敏性哮喘小鼠模型中，出现严重的肺嗜酸性粒细胞增多。本文包括以下三种检测方法：点印迹（Dot blot）用于显示从包括HDM物种在内的过敏原中分离的总RNA中的双链RNA（dsRNA）结构；逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）用于测定HDM RNA在小鼠肺组织中对干扰素刺激基因（ISGs）表达的激活作用；流式细胞术（FACS）分析用于分别评估HDM RNA对支气管肺泡灌洗液（BAL）和肺组织中嗜酸性粒细胞数量的影响。

采用dsRNA特异性小鼠单克隆抗体J2（≥ 40 bp）通过点印迹法检测了HDM、昆虫及非昆虫小型动物中长dsRNA结构的存在。使用RNase III将dsRNA消化为12–15 bp的dsRNA片段，这些片段无法被J2检测到（图1）。
屋尘螨总RNA以剂量依赖方式刺激小鼠肺部先天免疫反应的能力&#160;通过RT-qPCR进行分析（图2，上图）。RNase III 处理消除了 HDM 总 RNA 的免疫刺激活性，表明 HDM 总 RNA 中的 dsRNA 结构对于肺部的天然免疫活性至关重要（图2，较低。
通过流式细胞术分析评估了屋尘螨（HDM）总RNA对严重2型肺部炎症发展的抑制作用（图3A）。在本研究中，嗜酸性粒细胞肺部炎症由屋尘螨提取物诱导，这些提取物经RNase III处理或未处理，...

环境过敏原（如屋尘螨（HDM））通常含有可激活先天免疫反应以调节过敏性炎症的微生物成分。本文所述方案展示了如何鉴定HDM过敏原中的双链RNA（dsRNA）成分，并表征其在调控嗜酸性粒细胞肺部炎症中的免疫原性活性。

鉴定和表征尘螨过敏原中调节嗜酸性粒细胞肺部炎症的免疫原性RNA种类

环境过敏原（如屋尘螨（HDM））通常以复杂形式存在，包含可引发异常2型免疫反应的变应原蛋白……

本方案旨在解决一个非常重要 yet 尚未解决的问题，即微生物物质和环境过敏原如何调控过敏性炎症的发生发展。具体而言，本文所述方法可用于回答尘螨中的双链RNA是否在体内具有免疫原性，并能够调节嗜酸性粒细胞肺部炎症。这些技术的主要优势在于操作简单、高效、高度可重复，并且仅需使用常规工具和设备即可完成。这些方法也可用于评估由呼吸道病毒感染引起的肺部疾病。我实验室的研究生 Li She 将协助演示该实验步骤。首先从过敏原、昆虫以及非昆虫过敏原中分离总 RNA。将适量样本转移至含有1.4毫米陶瓷珠的2毫升离心管中，并将离心管置于液氮容器中冷冻约10分钟。向每根离心管中加入1毫升基于硫氰酸胍的RNA提取试剂。然后使用高能细胞破碎仪以最大速度震荡45秒，以破碎昆虫及非昆虫小型动物样本。将样品置于冰上冷却，并重复此过程两次。将溶液转移至新的1.5毫升离心管中。向每根离心管中加入200 µL氯仿，然后涡旋混匀样品。在4 °C条件下，以14,000 × g离心14分钟。然后将上层水相转移至含有500 µL异丙醇的新离心管中。混匀样品。然后在4°C条件下以14,000 × g离心14分钟。小心吸去上清液。随后用500 µL 75%乙醇洗涤RNA沉淀，在4°C条件下以7,500 × g离心10分钟。小心移除所有液体。将沉淀空气干燥后，用 20 至 50 微升无 RNase 的水溶解 RNA。为检测总 RNA 中的双链 RNA 结构，取 2 微升浓度为每微升 200 纳克的 RNA 样品，点样于带正电荷的尼龙膜上。在紫外交联仪中，以1,200微焦每100的条件将样品交联至膜上。重复点样和交联步骤两次，最终每印迹含有总计1.2微克RNA。在室温下，用含5%脱脂奶粉的TBS-T溶液振荡孵育一小时，以封闭非特异性结合位点。然后去除封闭液，加入用含1%脱脂奶粉的TBS-T缓冲液按1:1,000稀释的抗双链RNA J2抗体。将膜置于4°C条件下振荡孵育过夜。次日，用TBS-T缓冲液洗涤膜三次，每次五分钟。加入二抗，在室温下孵育膜1小时。然后用TBS-T重复洗涤。加入底物，孵育膜5至15分钟，直至出现理想的信号。通过用双蒸水冲洗膜来终止反应。收集肺组织样本时，将肺组织置于滤纸上，切除每个肺叶的一小块组织。将每块组织放入含有珠子的2毫升离心管中。为了采集支气管肺泡灌洗液，先用70%乙醇对已处死的小鼠进行消毒，然后用剪刀从腹部上部至颈部剪开皮肤。用镊子轻轻分开颌下腺和胸骨舌骨肌，暴露气管，随后将一根尼龙线从其下方穿过。在喉部下方约两毫升处的气管上做一个切口，切口大小以刚好能插入套管为宜，并用线将气管和套管扎紧。将注射器连接到套管末端，用新鲜的PBS-EDTA溶液填充注射器，然后向肺内注入并回吸一毫升该溶液。将注射器从套管上取下，并将溶液排入一个15毫升离心管中。用新鲜的PBS-EDTA重复此操作洗涤冰浴样品，并收集灌洗液。在4摄氏度下，以500 × g离心7分钟。然后记录体积，并将上清液转移至两支1.5毫升离心管中，注意不要扰动沉淀。重悬沉淀后，取150微升加入96孔板中，在4摄氏度、500 × g条件下离心7分钟。随后迅速将孔板倒置于纸巾上，以去除上清液。使用含有 2.4G2 封闭抗体的 FACS 缓冲液对细胞进行抗体染色，并在室温下避光孵育 30 分钟。染色完成后，在 4 摄氏度下以 500 × g 离心 7 分钟，使细胞沉淀。将培养板倒置在纸巾上，以去除染色液。加入 100 微升 FACS 缓冲液以洗涤细胞，然后重复离心。将样品重悬于 150 微升 FACS 缓冲液中，随后转移至含有额外 350 微升缓冲液的 FACS 管中。向每个样品中加入 25 微升计数微球，然后进行流式细胞术分析。采用双链RNA特异性小鼠单克隆抗体J2，通过点印迹法检测了屋尘螨、昆虫及其他非昆虫小型动物中长双链RNA结构的存在。使用RNase III将双链RNA消化为12至15个碱基对的片段，这些片段无法被J2检测到。通过RT-qPCR证实，屋尘螨总RNA能够刺激小鼠肺部的天然免疫反应。经RNase III处理后，屋尘螨总RNA的免疫刺激活性消失，表明双链RNA结构对肺部天然免疫活性至关重要。通过FACS分析评估了屋尘螨总RNA对严重2型肺部炎症发展的抑制作用。嗜酸性粒细胞肺部炎症由屋尘螨提取物诱导，这些提取物经或未经RNase III处理。长链双链RNA物种的降解导致严重的2型肺部炎症，表现为支气管肺泡灌洗液和肺组织中嗜酸性粒细胞数量增加。值得注意的是，尘螨总RNA处理组中嗜酸性粒细胞的数量与使用内源性含有长链双链RNA物种的原始尘螨提取物处理组相当。在实施该方案时，进行支气管肺泡灌洗液（BAL）的注射和回收操作需格外小心，因为在此阶段任何对肺组织的损伤都可能影响最终结果。除本方法外，还可采用ELISA等其他方法分析BAL液中存在的非细胞可溶性成分。该技术问世后，为研究人员探索环境过敏原中存在的其他微生物成分铺平了道路，例如能够调控过敏性肺部炎症发展的非双链RNA因子。

identification-characterization-immunogenic-rna-species-hdm-allergens

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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重复测量啮齿类动物呼吸生理参数并采集气道炎症细胞是理想的研究手段，但通常难以实现。本文介绍一种可重复的小鼠经口插管方法，该方法允许对气道高反应性进行多次测量，并可重复采集气道炎症细胞。...

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我们描述了一种在卵清蛋白诱导的过敏性气道炎症条件下，监测肺树突状细胞对卵清蛋白刺激的成熟与迁移的策略。该策略可经修改后用于评估感染条件下肺树突状细胞的迁移情况。...

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一种基于微流控芯片的过敏原特异性免疫球蛋白E检测系统

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小鼠肺组织中固有和适应性免疫细胞鉴定的流式细胞术分析

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过敏性鼻炎大鼠鼻黏膜组织切片的免疫荧光标记 通过 多色免疫分析

了解如何识别屋尘螨过敏原中免疫原性双链RNA物种，并评估其在小鼠模型中调节嗜酸性肺炎和先天免疫反应的能力。该方法简单高效，可用于研究过敏性哮喘的免疫机制。

鉴定和表征尘螨过敏原中调节嗜酸性粒细胞肺部炎症的免疫原性RNA种类

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