鉴定和表征尘螨过敏原中调节嗜酸性粒细胞肺部炎症的免疫原性RNA种类

本方案旨在解决一个非常重要 yet 尚未解决的问题，即微生物物质和环境过敏原如何调控过敏性炎症的发生发展。具体而言，本文所述方法可用于回答尘螨中的双链RNA是否在体内具有免疫原性，并能够调节嗜酸性粒细胞肺部炎症。这些技术的主要优势在于操作简单、高效、高度可重复，并且仅需使用常规工具和设备即可完成。

这些方法也可用于评估由呼吸道病毒感染引起的肺部疾病。我实验室的研究生 Li She 将协助演示该实验步骤。首先从过敏原、昆虫以及非昆虫过敏原中分离总 RNA。

将适量样本转移至含有1.4毫米陶瓷珠的2毫升离心管中，并将离心管置于液氮容器中冷冻约10分钟。向每根离心管中加入1毫升基于硫氰酸胍的RNA提取试剂。然后使用高能细胞破碎仪以最大速度震荡45秒，以破碎昆虫及非昆虫小型动物样本。

将样品置于冰上冷却，并重复此过程两次。将溶液转移至新的1.5毫升离心管中。向每根离心管中加入200 µL氯仿，然后涡旋混匀样品。

在4 °C条件下，以14,000 × g离心14分钟。然后将上层水相转移至含有500 µL异丙醇的新离心管中。混匀样品。

然后在4°C条件下以14,000 × g离心14分钟。小心吸去上清液。随后用500 µL 75%乙醇洗涤RNA沉淀，在4°C条件下以7,500 × g离心10分钟。

小心移除所有液体。将沉淀空气干燥后，用 20 至 50 微升无 RNase 的水溶解 RNA。为检测总 RNA 中的双链 RNA 结构，取 2 微升浓度为每微升 200 纳克的 RNA 样品，点样于带正电荷的尼龙膜上。

在紫外交联仪中，以1,200微焦每100的条件将样品交联至膜上。重复点样和交联步骤两次，最终每印迹含有总计1.2微克RNA。在室温下，用含5%脱脂奶粉的TBS-T溶液振荡孵育一小时，以封闭非特异性结合位点。

然后去除封闭液，加入用含1%脱脂奶粉的TBS-T缓冲液按1:1,000稀释的抗双链RNA J2抗体。将膜置于4°C条件下振荡孵育过夜。次日，用TBS-T缓冲液洗涤膜三次，每次五分钟。

加入二抗，在室温下孵育膜1小时。然后用TBS-T重复洗涤。加入底物，孵育膜5至15分钟，直至出现理想的信号。

通过用双蒸水冲洗膜来终止反应。收集肺组织样本时，将肺组织置于滤纸上，切除每个肺叶的一小块组织。将每块组织放入含有珠子的2毫升离心管中。

为了采集支气管肺泡灌洗液，先用70%乙醇对已处死的小鼠进行消毒，然后用剪刀从腹部上部至颈部剪开皮肤。用镊子轻轻分开颌下腺和胸骨舌骨肌，暴露气管，随后将一根尼龙线从其下方穿过。

在喉部下方约两毫升处的气管上做一个切口，切口大小以刚好能插入套管为宜，并用线将气管和套管扎紧。将注射器连接到套管末端，用新鲜的PBS-EDTA溶液填充注射器，然后向肺内注入并回吸一毫升该溶液。

将注射器从套管上取下，并将溶液排入一个15毫升离心管中。用新鲜的PBS-EDTA重复此操作洗涤冰浴样品，并收集灌洗液。在4摄氏度下，以500 × g离心7分钟。

然后记录体积，并将上清液转移至两支1.5毫升离心管中，注意不要扰动沉淀。重悬沉淀后，取150微升加入96孔板中，在4摄氏度、500 × g条件下离心7分钟。随后迅速将孔板倒置于纸巾上，以去除上清液。

使用含有 2.4G2 封闭抗体的 FACS 缓冲液对细胞进行抗体染色，并在室温下避光孵育 30 分钟。染色完成后，在 4 摄氏度下以 500 × g 离心 7 分钟，使细胞沉淀。将培养板倒置在纸巾上，以去除染色液。

加入 100 微升 FACS 缓冲液以洗涤细胞，然后重复离心。将样品重悬于 150 微升 FACS 缓冲液中，随后转移至含有额外 350 微升缓冲液的 FACS 管中。向每个样品中加入 25 微升计数微球，然后进行流式细胞术分析。

采用双链RNA特异性小鼠单克隆抗体J2，通过点印迹法检测了屋尘螨、昆虫及其他非昆虫小型动物中长双链RNA结构的存在。使用RNase III将双链RNA消化为12至15个碱基对的片段，这些片段无法被J2检测到。通过RT-qPCR证实，屋尘螨总RNA能够刺激小鼠肺部的天然免疫反应。经RNase III处理后，屋尘螨总RNA的免疫刺激活性消失，表明双链RNA结构对肺部天然免疫活性至关重要。

通过FACS分析评估了屋尘螨总RNA对严重2型肺部炎症发展的抑制作用。嗜酸性粒细胞肺部炎症由屋尘螨提取物诱导，这些提取物经或未经RNase III处理。长链双链RNA物种的降解导致严重的2型肺部炎症，表现为支气管肺泡灌洗液和肺组织中嗜酸性粒细胞数量增加。

值得注意的是，尘螨总RNA处理组中嗜酸性粒细胞的数量与使用内源性含有长链双链RNA物种的原始尘螨提取物处理组相当。在实施该方案时，进行支气管肺泡灌洗液（BAL）的注射和回收操作需格外小心，因为在此阶段任何对肺组织的损伤都可能影响最终结果。除本方法外，还可采用ELISA等其他方法分析BAL液中存在的非细胞可溶性成分。

该技术问世后，为研究人员探索环境过敏原中存在的其他微生物成分铺平了道路，例如能够调控过敏性肺部炎症发展的非双链RNA因子。