Name: 斑马鱼中具有功能化荧光硅纳米粒子的异种移植人类癌细胞的Vivo靶向 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 了解利用斑马鱼胚胎评估功能化纳米粒子靶向人类癌细胞效率的方法。该技术可筛选最优纳米粒子，为大型动物实验和临床试验提供可靠依据，助力癌症靶向治疗研究。

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作者感谢 Kaylee Smith 女士、Lauren Kwok 女士和 Alexander Floru 先生对稿件的校对。H.F. 感谢美国国立卫生研究院（NIH，项目号 CA134743 和 CA215059）、美国癌症协会（项目号 RSG-17-204-01-TBG）以及圣巴尔德里克基金会提供的资助。F.J.F.L. 感谢波士顿大学创新中心纳米技术癌症交叉学科培训项目（BUnano Cross-Disciplinary Training in Nanotechnology for Cancer, XTNC）提供的博士后奖学金。I.S. 感谢美国国家科学基金会（NSF，项目号 CBET 1605405）和美国国立卫生研究院（NIH，项目号 R41AI142890）的支持。

所有动物实验程序均经波士顿大学医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，方案编号：PROTO201800543。
1. 生成Casper斑马鱼胚胎
<ol>
	<li>选择成年个体 Casper 至少3月龄的鱼类用于自然繁殖以产生透明个体 Casper 斑马鱼胚胎</li>
	<li>晚上用养鱼用水填充双室交配箱，用隔板将上部水箱隔开，将一条雄鱼放入隔室的一侧，一条或两条雌鱼放入另一侧，用隔板将鱼隔开过夜。</li>
	<li>第二天早上8:00开灯后取出隔板。加入人工丰容植物，并将上层容器略微倾斜，形成浅水区域。让鱼类繁殖3-4小时。</li>
	<li>提起装有鱼类的交配箱上层腔室，并将其放回原来的鱼箱中。</li>
	<li>将底部腔室中的卵收集起来，通过滤网倾倒水以获取卵。将卵转移至无菌培养皿中，密度不超过每皿200枚卵。去除任何死亡或未受精的卵，并用新鲜的鱼水加满培养皿至三分之二容量。 
	注意：受精且健康的卵应呈半透明且圆形。任何浑浊、发白或变形的卵均应去除。鱼水取自鱼类饲养设施中的鱼缸。</li>
	<li>将胚胎置于28.5 °C培养箱中过夜孵育。</li>
	<li>第二天早上按照上述标准方案漂白胚胎 斑马鱼手册16并将胚胎放回培养箱（可选步骤）。</li>
	<li>下午从培养箱中取出24 hpf的胚胎，用蛋白酶去除胚胎的绒毛膜。
	<ol>
		<li>尽可能移除培养皿中胚胎的鱼水，并向培养皿中加入数滴蛋白酶溶液（1 mg/mL，溶于鱼水）。轻轻晃动培养皿。当观察到卵膜开始解体时，用移液器将胚胎上下吹打数次，以进一步破坏卵膜，释放胚胎。</li>
		<li>一旦大部分胚胎脱膜，立即向培养皿中加入新鲜的鱼水以终止反应。用鱼水将胚胎冲洗3次，去除漂浮的卵膜。将胚胎放回培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 移植用人源癌细胞的制备
<ol>
	<li>将培养箱温度精确设置为 35.5 °C。使用置于培养箱内的温度计监测，确保温度持续稳定。</li>
	<li>将 1 L 鱼水装入玻璃瓶中进行高压灭菌。通过向 100 mL 高压灭菌后的鱼水中加入 3 g 电泳级琼脂糖，并用微波炉加热至琼脂糖完全溶解，制备 3% 琼脂糖溶液。
	<ol>
		<li>将热的琼脂糖溶液倒入培养皿中，至其容量的 3/4。将显微注射模具放置在琼脂糖上，确保模具不与培养皿底部接触，且其下方无气泡产生。</li>
		<li>让溶液凝固后，小心地从培养皿中取出模具。用高压灭菌的鱼水填充培养皿，并在 4 °C 下保存。在收获 HeLa 细胞前，将琼脂糖板和鱼水预先在 35.5 °C 培养箱中温育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用下列参数在拉针仪上拉制 1.0 mm 外径 × 0.78 mm 内径的硼硅酸盐玻璃毛细管：气压 500，加热 560，拉力 100，速度 100，时间/延迟 200。将拉制好的针头插入橡皮泥中，存放于已用乙醇擦拭过的大型培养皿内。 
	警告：拉制后的针头非常尖锐且易碎，操作时需格外小心。</li>
	<li>通过将 MS222 溶解于高压灭菌的鱼水中，配制三卡因甲磺酸盐（MS222，4 mg/mL）的储备液。使用前充分涡旋混匀。将 MS222 储备液按 1:100 比例稀释于鱼水中（即向 20 mL 鱼水中加入 200 µL MS222 储备液，终浓度为 40 µg/mL），用于后续操作中胚胎的麻醉。</li>
	<li>通过使用 PLenti6.2_miRFP670 慢病毒转导 hLabel HeLa 细胞，按照文献17所述方法进行培养。在移植前 30 分钟至 1 小时收获 RFP+ HeLa 细胞。 
	注意：人源 HeLa 细胞已在含 5% CO2 的 37 °C 组织培养箱中，于完全生长培养基（含 10% FBS 的 DMEM 培养基）中培养至约 70% 汇合度。
	<ol>
		<li>在组织培养超净台中通过抽吸去除 HeLa 细胞培养基。用无菌 PBS 短暂冲洗细胞层，以去除所有血清残留。</li>
		<li>向 T-75 培养瓶中加入 3.0 mL 无菌胰蛋白酶-EDTA 溶液，并将细胞放回 37 °C 组织培养箱中孵育 3–5 分钟，以促进酶解消化。在显微镜下观察培养瓶，直至约 80% 的细胞悬浮。</li>
		<li>向培养瓶中加入 6–8 mL 完全生长培养基。用移液器轻轻吹打收集细胞至 15 mL 无菌离心管中。在 135 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>吸除上清液，将 HeLa 细胞重悬于 3 mL 完全生长培养基中。重复上述洗涤步骤两次。最后将细胞重悬于 1 mL 完全生长培养基中，并使用血细胞计数板在显微镜下进行细胞计数。</li>
		<li>再次离心细胞，弃去上清液，将细胞重悬于 1.5 mL 微量离心管中，浓度为 5 × 107 个细胞/mL。在转运至鱼类实验设施时，用手握住离心管以保持细胞温度。 
		注意：在注射胚胎前或注射过程中，始终应将细胞存放于 35.5 °C 培养箱内以保持其温度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 人类癌细胞的移植
<ol>
	<li>移植前使用乙醇擦拭布清洁工作区域（例如剪刀、镊子、塑料移液管、刀片）。</li>
	<li>使用塑料移液管将胚胎沿琼脂糖板的凹槽排列整齐，使胚胎侧卧，头部朝前。 
	注意：确保鱼水覆盖胚胎。另留出部分胚胎不注射癌细胞，作为对照组使用。</li>
	<li>打开气源和显微注射仪。从培养箱中取出HeLa细胞，用P200枪头将细胞上下吹打20-30次。立即使用剪去末端的凝胶上样枪头吸取3 µL细胞混合液装入注射针中。小心地将枪头插入针的尖端底部。如有需要，轻轻晃动针管，使细胞混合液流入针尖，充满尖端部分。
	<ol>
		<li>将注射针插入针夹中。用镊子小心折断针尖。调节显微注射仪的压力和注射时间，以排出针尖内的所有气泡。逐步降低压力和注射时间，直至注射液滴大小约为1 nL。</li>
		<li>将注射板置于显微镜下合适位置，使胚胎的卵黄面朝向注射针。通过加入五滴稀释的MS222溶液（40 µg/mL）对胚胎进行麻醉。</li>
		<li>调整注射器位置，使针尖接触每个胚胎的卵周腔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>踩下脚踏开关，将细胞混合液注射到卵周腔下方的血管化区域。</li>
	<li>用非优势手移动注射板至下一个胚胎，同时用优势手推动和回撤注射器，并踩下脚踏开关以持续完成注射。向已注射的胚胎滴加数滴无菌鱼水。当板上所有胚胎注射完成后，用无菌鱼水将胚胎冲洗至无菌培养皿中，并立即转移至35.5 °C培养箱中。</li>
	<li>注射3小时后，检查胚胎并移除死亡个体。</li>
	<li>将存活的胚胎放回35.5 °C培养箱中继续孵育20-24小时，使HeLa细胞从注射部位扩散至身体其他部位。 
	注意：胚胎需在35.5 °C培养箱中孵育，以促进人源癌细胞的存活与迁移，因为这些细胞在鱼类胚胎常规孵育温度28.5 °C下生长不佳。</li>
</ol>
4. 注射纳米颗粒或载体
<ol>
	<li>次日早晨，用五滴稀释的 MS222 溶液麻醉移植后的胚胎。切勿加入过多 MS222，否则会导致胚胎死亡。在荧光显微镜下，小心挑出带有 RFP+ HeLa 细胞尾部转移的胚胎，并将其转移至含有无菌鱼水的新培养皿中。</li>
	<li>使用以下参数按第 2 节所述方法制备注射针：气压设为 500，加热温度设为 645，拉力设为 60，速度设为 50，时间/延迟设为 100。</li>
	<li>按照步骤 3.1–3.3 的操作流程对胚胎进行定位，并将载体（如 H2O）或纳米颗粒溶液装入注射针中。</li>
	<li>向眼后方注射 0.5 nL 的 1 mg/mL 纳米颗粒溶液，并按照步骤 3.5–3.6 所述继续操作（图 1B）。眼后区域富含毛细血管，有助于纳米颗粒进入循环系统。</li>
	<li>采用类似方法，将用于悬浮纳米颗粒的载体（如 H2O）注射到移植了 HeLa 细胞的胚胎以及未移植的胚胎（即对照组）中（图 1A, C）。</li>
	<li>将所有注射后的胚胎在 35.5 °C 条件下孵育。</li>
</ol>
5. 纳米颗粒与癌细胞的成像与示踪
<ol>
	<li>在注射纳米颗粒后的0、30、60、90、120、180和210分钟，于荧光显微镜下观察注射后的胚胎，以监测纳米颗粒在循环系统中的分布情况及其对癌细胞的靶向程度。根据所测试纳米颗粒的类型，最早可在注射后30分钟观察到对癌细胞的靶向作用。</li>
	<li>用移液器将2-3个胚胎转移至培养皿中，并加入五滴稀释的MS222溶液（40 µg/mL）以固定胚胎。待胚胎停止游动后，吸除大部分液体，使胚胎侧卧放置。</li>
	<li>使用末端连接细软毛刷的移液器调整胚胎位置，使其侧卧，头部朝前，仅显示一只眼睛。</li>
	<li>在低倍镜（2x）下以红色、蓝色和明场通道对胚胎进行成像，以获取整个胚胎的图像；再在高倍镜（6.4x）下重复成像，以获取尾部区域的图像。在红色通道下对焦，以避免纳米颗粒信号串扰。 
	注意：成像过程中胚胎必须保持静止。任何移动都会导致图像模糊，并影响不同通道图像的叠加。</li>
	<li>成像结束后立即向胚胎中加入新鲜的养鱼用水，并将其放回培养箱。重复步骤5.2–5.4，以在不同时间点对胚胎进行成像。</li>
</ol>

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</ol>

I.S. 宣布对 NanoScience Solutions, LLC（获得 STTR NIH R41AI142890 拨款的单位）存在利益关系。其余所有作者均声明不存在利益冲突。

本文所述方案利用斑马鱼作为活体系统，用于检测纳米颗粒识别和靶向转移性人类癌细胞的能力。多个因素可能影响实验的成功实施。首先，胚胎必须在48小时（hpf）时完全发育。胚胎处于正确的发育阶段，才能耐受并存活人类癌细胞的移植。相比更年长且发育更成熟的胚胎，小于48 hpf的胚胎存活率显著降低。其次，应尽可能保持癌细胞的活性，确保其满足以下条件：1）处于指数生长期21；2）在移植前30分钟至1小时内新鲜收获；3）全程保持温暖。第三，注射针头不得堵塞。在将细胞混合物装入针头前，需将HeLa细胞上下吹打至少20次。第四，移植人类癌细胞和注射纳米颗粒应使用不同类型的针头。用于人类细胞移植的针头相对较宽，并带有一定角度以避免细胞堵塞；而用于纳米颗粒注射的针头则较尖且细。第五，注射位置不同。人类细胞的移植位置为卵周腔，而纳米颗粒注射时针头应插入眼部后方富含毛细血管的区域。最后，操作者的熟练程度至关重要。经验丰富的操作者可准确地将HeLa细胞注入卵周腔，而缺乏经验者常将肿瘤细胞注入卵黄区域，导致肿瘤细胞几乎无法在鱼体内扩散。同样，由经验丰富的操作者处理时，胚胎的存活率显著更高，至少有50%的癌细胞移植胚胎能够...

开发能够检测、靶向并摧毁癌细胞的纳米颗粒，引起了物理学家和生物医学研究人员的广泛关注。纳米医学的兴起推动了多种纳米颗粒的发展，例如与靶向配体和/或化疗药物偶联的纳米颗粒1,2,3。纳米颗粒所具备的附加特性使其能够与生物系统相互作用，高效且准确地感知和监测生物事件，同时兼具治疗功能。金纳米颗粒和氧化铁纳米颗粒主要分别用于计算机断层扫描和磁共振成像。而金纳米颗粒和氧化铁纳米颗粒的酶活性可通过比色法实现对癌细胞的检测，荧光纳米颗粒则非常适合体内成像应用4。其中，超亮荧光纳米颗粒尤为有利，因其能够在使用更少颗粒的同时实现早期癌症检测，并降低毒性5。
尽管具有这些优势，纳米颗粒仍需通过体内动物模型实验来筛选合适的纳米材料并优化合成工艺。此外，与药物类似，纳米颗粒也依赖动物模型进行临床前测试，以评估其有效性和毒性。目前最广泛使用的临床前模型是小鼠，作为一种哺乳动物，其饲养成本相对较高。在癌症研究中，通常使用基因工程小鼠或异种移植小鼠6,7。这些实验周期通常持续数周至数月。特别是在癌症转移研究中，癌细胞被直接注射到小鼠的循环系统中，注射部位包括尾静脉和脾脏8,9,10。然而，这些模型仅能模拟转移的终末阶段，即肿瘤细胞穿出血管并在远端器官定植的过程。此外，由于成像可视化的限制，在小鼠体内监测肿瘤细胞迁移以及纳米颗粒对肿瘤细胞的靶向作用尤为困难。
斑马鱼（Danio rerio）因其繁殖力强、成本低、发育迅速、光学透明以及基因保守性高等特点，已成为癌症研究中一种强大的脊椎动物模型11,12。与小鼠模型相比，斑马鱼的另一优势在于其体外受精特性，使得胚胎在发育全过程均可被实时观察。斑马鱼的胚胎发育速度很快，受精后24小时（hpf）内，脊椎动物的基本体轴结构已初步形成13。到72 hpf时，胚胎已从绒毛膜中孵化，由胚胎期进入幼鱼阶段。斑马鱼尤其是其Casper品系的透明特性14，为在活体动物中可视化观察癌细胞的迁移过程以及纳米颗粒对癌细胞的识别与靶向提供了独特机会。最后，斑马鱼在受精后48小时即发育出先天免疫系统，而适应性免疫系统则发育较晚，直到受精后28天才具备功能15。这一免疫系统发育的时间差，使其成为移植多种人类癌细胞的理想模型，且不会发生免疫排斥反应。
本文介绍了一种利用斑马鱼透明且发育迅速的特性，在活体中展示荧光纳米颗粒识别并靶向人类癌细胞的方法。在该实验中，经基因工程改造表达红色荧光蛋白的人宫颈癌细胞（HeLa细胞）被注射至48小时龄胚胎卵黄囊腔的血管化区域。20至24小时后，HeLa细胞已通过斑马鱼循环系统扩散至整个胚胎。随后，向表现出明显转移现象的胚胎眼后部富含毛细血管的区域显微注射约0.5 nL的纳米颗粒溶液。利用该技术，超亮荧光二氧化硅纳米颗粒可在注射后20至30分钟内迅速靶向HeLa细胞。由于其操作简便且效率高，斑马鱼成为一种可靠的活体模型，可用于测试多种纳米颗粒靶向特定癌细胞的能力。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>KSE scientific</td><td>BMK-A1705</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>1.0 mm O.D. x 0,78 mm</td><td></td></tr><tr><td>计算机和显示器</td><td>ThinkCentre</td><td>X000335</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（杜氏改良伊格尔培养基）</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>由 Fisher 销售</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>鱼类培养箱</td><td>VWR</td><td>35960-056</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fishersci 品牌</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>磁力架</td><td>World Precision Instruments</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器加样头</td><td>Eppendorf</td><td>E5242956003</td><td>由 Fisher 销售</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MMPI-3</td><td></td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>Sutter instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Olympus MVX-10 荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>MVX-10</td><td></td></tr><tr><td>P200 加样头</td><td>Fishersci 品牌</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.fishersci.com/shop/products/corning-universal-fit-pipet-tips-bulk-packed-6/07200293?keyword=true&quot; target=&quot;_blank">07-200-293&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>PBS（杜氏磷酸盐缓冲液，1X）</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td>由 Fisher 销售</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Corning</td><td>SB93102</td><td>由 Fisher 销售</td></tr><tr><td>塑料移液管</td><td>Fishersci 品牌</td><td>50-998-100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;https://www.addgene.org/113726/&quot; target=&quot;_blank">pLenti6.2_miRFP670&lt;/a&gt;</td><td>Addgene</td><td>13726</td><td></td></tr><tr><td>气动皮升注射泵</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYSPV820</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K（Pronase）</td><td>Roche-Sigma-Fisher</td><td>50-100-3275</td><td>Roche 产品，由 Sigma 生产，Fisher 销售</td></tr><tr><td>刀片</td><td>Fishersci 品牌</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>SZ51 解剖显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐（Tricaine methanesulfonate）</td><td>Western Chemicals</td><td>NC0872873</td><td>由 Fisher 销售</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td>由 Fisher 销售</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fishersci 品牌</td><td>12-000-122</td><td></td></tr></tbody></table>

在斑马鱼体内靶向移植的人类癌细胞的荧光功能化二氧化硅纳米颗粒研究

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

开发能够检测、靶向并摧毁癌细胞的纳米颗粒在纳米医学领域备受关注。为了将纳米技术与其生物医学应用相衔接，需要借助体内动物模型。小鼠是临床前测试的传统动物模型，但其饲养成本相对较高，且由于每只母鼠产仔数量有限，实验周期较长。斑马鱼已成为发育生物学和生物医学研究（包括癌症研究）中一种强大的模型系统。特别是由于其具有光学透明性以及发育迅速的特点，斑马鱼胚胎非常适合用于实时体内监测癌细胞的行为及其与微环境的相互作用。本方法旨在依次将人源癌细胞和功能化纳米颗粒引入透明的Casper斑马鱼胚胎中，并实时监测纳米颗粒在体内的癌细胞识别与靶向过程。该优化后的实验方案表明，用叶酸基团功能化的荧光标记纳米颗粒能够特异性识别并靶向携带不同荧光染料标记的人源转移性宫颈上皮癌细胞。纳米颗粒的识别与靶向过程在注射后30分钟内即可发生。整个实验仅需饲养少数几对成年斑马鱼，且耗时不到4天即可完成。此外，斑马鱼胚胎缺乏功能性适应性免疫系统，因而可实现多种人源癌细胞的移植。因此，本文所述实验方案可用于在多种不同类型的人源癌细胞中测试纳米颗粒，有助于在特定癌症背景下筛选出最优纳米颗粒，为后续在哺乳动物及临床试验中的应用提供支持。

图1 中的实验流程示意图展示了本研究的整体步骤。将透明的 Casper 成年雄鱼和雌鱼进行交配以获得胚胎（第1部分）。在受精后48小时（48 hpf），将表达RFP的HeLa细胞注射到斑马鱼胚胎卵黄囊下方的血管化区域，未注射的胚胎作为对照组（第3部分）。对于具备显微注射经验的操作者而言，胚胎存活率通常较高，在35.5 °C培养箱中（该温度对斑马鱼胚胎并非最适，但为人类癌细胞存活与迁移所必需），至少有50%的移植癌细胞胚胎能够存活。HeLa细胞具有高度侵袭性，注射后8小时内即可侵入血管并扩散至胚胎尾部区域。移植后20–24小时，约50%的移植胚胎显示出HeLa细胞发生转移性扩散的迹象。选择癌细胞已转移至尾部的胚胎用于后续实验。在受精后72小时（72 hpf），对这些胚胎进行眼后注射，实验组注射蓝色荧光纳米颗粒（第4部分及图1B），对照组仅注射载体（图1</stro...

本文介绍了一种利用斑马鱼胚胎研究功能化纳米颗粒在体内靶向人类癌细胞能力的方法。该方法可用于评估和筛选出最适合在大型动物及临床试验中进一步测试的优化纳米颗粒。

开发能够检测、靶向并摧毁癌细胞的纳米颗粒在纳米医学领域备受关注。体内动物实验……

该实验流程可帮助研究人员评估并筛选适用于大型动物研究和临床试验的最佳纳米颗粒。这一简便方法有助于确定纳米颗粒是否能在体内靶向人类癌细胞，以及其靶向效率如何。本次实验操作将由本实验室的博士后研究员Xiodan Qin博士和研究技术员Andrew Lam先生进行示范。傍晚时，用养鱼用水注满两个分隔式交配缸，并使用隔板将上部水槽隔开。将一条雄性斑马鱼放入隔间的一侧，将一条或两条雌性斑马鱼放入另一侧。次日上午8:00移除隔板。添加人工繁殖植株，并将上层水槽略微倾斜，以形成浅水区域。让斑马鱼交配繁殖三到四小时，然后将下层水槽中的水倒入筛网中，收集鱼卵。将鱼卵转移至培养皿中，每皿不超过200枚鱼卵。移除任何死亡或未受精的卵。将培养皿装入三分之二新鲜的鱼水，然后放入培养箱中。24小时后，将培养皿从培养箱中取出，并尽可能多地吸除皿中的水分。加入几滴浓度为1毫克/毫升的蛋白酶溶液，轻轻摇晃培养皿。当观察到卵膜出现降解迹象时，用移液器将胚胎上下吹打数次，以破坏卵膜并释放胚胎。当大部分胚胎已从卵膜中释放后，立即加入新鲜的养鱼用水以终止反应过程。用鱼水冲洗胚胎三次，以去除漂浮的卵膜。将胚胎放回培养箱中。称取3克电泳级琼脂糖加入100毫升经高压灭菌的鱼水中，配制3%琼脂糖溶液。将琼脂糖与鱼水混合物放入微波炉加热，直至琼脂糖完全溶解。制备注射板时，将热的琼脂糖溶液倒入培养皿中，至其四分之三满，然后将微注射模具放置在琼脂糖上。待琼脂糖完全凝固后，小心移除模具。用经高压灭菌的鱼水填充所形成的注射板，并在4°C下保存。制作用于注射的针头时，使用拉针仪将外径为1毫米、内径为0.78毫米的硼硅酸盐玻璃毛细管进行拉制。将注射针头存放于已用乙醇擦拭过的大型培养皿中的橡皮泥上。在收获HeLa细胞之前，将注射用培养板和鱼水于35.5摄氏度的培养箱中预热。移植前30分钟至1小时，收集HeLa细胞。在超净工作台内操作，通过抽吸法移除培养瓶中的培养基。用无菌PBS冲洗细胞，以去除培养基的所有残留痕迹。向培养瓶中加入三毫升无菌胰蛋白酶EDTA，并在37°C下孵育三至五分钟。在显微镜下观察培养瓶，以监测酶消化的进程。当约80%的细胞悬浮时，向培养瓶中加入六至八毫升培养基。用移液器轻柔地收集细胞，并转移至一个15毫升无菌离心管中。在135 ×g 条件下离心5分钟。吸除上清液，并将HeLa细胞重悬于3毫升完全培养基中。重复洗涤步骤两次后，将细胞重悬于一毫升完全培养基中。然后使用血细胞计数板在显微镜下对细胞进行计数。再次离心细胞后，弃去上清液。将细胞重悬于1.5毫升微量离心管中，浓度为每毫升5×10⁷个细胞。转运至斑马鱼养殖设施时，用手握住离心管以保持细胞温度。使用塑料移液器将斑马鱼胚胎转移至注射板上。将胚胎侧放，头部朝前，与培养板上的凹槽对齐。打开气源和显微注射仪。从培养箱中取出HeLa细胞后，使用P200移液器将细

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