生成人诱导多能干细胞来源的肠道类器官用于发育与疾病建模研究

该方法提供了逐步指导，用于通过将人诱导性多能干细胞分化为定型内胚层，再分化为后肠上皮，最终转入三维培养条件，从而生成人诱导性多能干细胞来源的肠类器官。由人诱导性多能干细胞来源的肠类器官获得的结果相较于单细胞培养的数据具有更高的可转化性，同时相较于原代组织来源的类器官也更为实用，后者在长期培养中往往难以维持。在由分化后的iPSC生成人肠细胞后，使用5毫升血清移液管将每个6孔板孔中的细胞单层从孔底脱离。

将细胞收集至一个15毫升离心管中进行离心。用添加了生长因子的肠道生长培养基重悬细胞沉淀。根据接种的孔数，加入相应体积的细胞外基质。

将30微升细胞悬液加入48孔板相应数量孔的中央。确保细胞外基质（ECM）置于孔的中央对于样品的长期稳定性至关重要。如果细胞外基质接触孔壁，可能会导致其塌陷，造成样品丢失。

将培养板放入细胞培养箱中至少5分钟。当细胞外基质凝固后，向每孔加入300 µL含有生长因子的新鲜肠道生长培养基，并将培养板放回细胞培养箱。48小时后，使用光学显微镜检查各孔中类器官的形成情况。

培养7天后，吸除培养基，加入冰冷的DPBS。使用5毫升血清移液管将类器官和细胞外基质球从培养板上机械吹打下来。随后，将类器官收集至一个15毫升离心管中。

通过离心收集类器官，并吸除上清液至可见的ECM层顶部。将沉淀重悬于15毫升冰上预冷的DPBS中，再次离心细胞。如图所示吸除上清液后，将沉淀重悬于1毫升冰上预冷的PBS中，使用P200移液器手动破坏完整的类器官。

确认类器官完全解离。将解离后的类器官离心，并重新悬浮于所需体积的细胞外基质中，然后接种至新的48孔板中，操作如示。随后，将培养板放回培养箱中孵育5分钟。

5分钟后，从培养箱中取出培养板，加入含有生长因子和ROCK抑制剂的肠道基础培养基。每2-4天更换一次培养基。为在肠道类器官中诱导炎症反应，将类器官培养物每孔中的上清液更换为300微升新鲜配制的、添加了40纳克/毫升TNFα的基础培养基。

然后，将培养板放回细胞培养箱中孵育48小时，以模拟促炎环境。在人iPSC分化过程中，可通过多能性标志物监测基因表达，这些标志物在第0天高表达，并在定型内胚层分化过程中迅速下调。在分化第2天，定型内胚层相关基因应开始表达，并于第3天达到表达高峰。

在后肠特化过程中，应诱导并随时间推移增强 CDX2 和 HNF4alpha 的表达。二维细胞片转移后 48 小时，细胞片应开始自组织形成更致密的三维球状结构，这些结构最初较小，但在随后 7 至 10 天的培养中逐渐增大并变得更加复杂。在类器官未形成清晰的类器官球状形态、未出现明显上皮结构且腔未朝向结构中心之前，不应进行传代。

当类器官发育至该阶段时，可进行免疫细胞化学染色，以确认肠道标志物（如villin和CDX2）的表达。为建立炎症模型，可在组织培养基中加入TNF alpha，持续处理24–48小时，通常可诱导促炎标志物的表达，同时伴随肠道上皮标志物的下调。由人诱导性多能干细胞衍生的肠道类器官可用于药物筛选、疾病建模、基因编辑、肿瘤微环境研究，以及任何感兴趣疾病的转录组学、蛋白质组学和表观遗传学谱型分析。

该方法可帮助许多实验室建立肠道类器官作为模型系统，为其研究提供一种额外的方法。