一种用于毒性测试中真实、重复吸入空气颗粒物暴露的气液界面支气管上皮模型
2020年5月13日
本文描述了一种体外支气管模型的细胞培养及暴露方法，可用于对颗粒物进行真实、重复的吸入暴露，以开展毒性测试。
本方案描述了如何通过气液界面培养和暴露人支气管上皮细胞。这是一种更接近真实情况的模型，用于研究肺部对吸入颗粒物的暴露反应。采用这些方法制备的肺细胞能够模拟肺部的真实环境。细胞将产生黏液，形成紧密屏障，并在数周内保持活性。该方法可用于研究空气颗粒物的毒性效应，也可用于研究呼吸道感染性疾病以及吸入性药物的作用。首次尝试本方案时，请注意，建立气液界面模型需要专业知识，同时也需要专用的测量设备。首先，将细胞用预热的细胞培养基或CCM稀释至浓度为每毫升50万个细胞（适用于6孔插件）或每毫升25万个细胞（适用于12孔插件）。在无菌条件下放置带有插件的细胞培养板，并向基底侧加入预热的CCM。混匀细胞悬液后，用移液器将其滴加到细胞培养插件的膜顶部。盖上培养板，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。在浸没条件下培养细胞7天，使其达到汇合状态，每两到三天更换一次CCM。测量跨上皮电阻时，使用配备筷子式电极组的上皮细胞伏欧计。用70%乙醇清洁电极。将较长的电极插入外侧培养基中，直至接触培养皿底部；将较短的电极插入培养基中，但不要接触膜。首先在未接种细胞的空插件上开始收集测量数据。待读数稳定后，记录以欧姆为单位的电阻值。此数值即为无细胞插件膜本身的电阻，也称为空白电阻。对每个插件重复测量，并从总电阻中减去空白电阻以获得真实电阻值，再乘以插件的表面积。从插件的顶端侧移除培养基，并向孔板的基底侧加入预热的CCM。培养基应从底部接触膜，但不得渗漏至插件顶部。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中于气液界面条件下继续培养7天，每两到三天更换一次基底侧培养基。在颗粒物暴露前短时间内，制备1%的纳米颗粒悬浮液。用96%乙醇对纳米颗粒（NPs）进行预润湿，然后加入纯水，使最终NP浓度为1%。将样品管置于冰上的烧杯中，超声处理16分钟。向装有分散液的瓶中加入搅拌子，然后通过细管将瓶子连接至蠕动泵，并调节流速为每小时25毫升。暴露前一天，开启自动暴露系统（AES），并让舱内温度升至37
概述
本研究旨在建立一种体外支气管模型，用于模拟反复吸入空气颗粒物的暴露过程，以进行毒性测试。培养的人支气管上皮细胞具有较长的存活时间，并能真实地产生黏液，使该模型适用于毒理学研究及传染病相关研究。
关键研究组成部分
研究领域
- 毒理学
- 呼吸生物学
- 体外模型
背景
- 对真实肺部暴露模型的需求
- 研究吸入颗粒物的重要性
- 在药物递送和传染病研究中的应用
使用的方法
- 人支气管上皮细胞的细胞培养技术
- 气液界面培养条件
- 跨上皮电阻的测量
主要结果
- 细胞形成紧密屏障并分泌黏液
- 在受控条件下可维持数周的细胞活性
- 该方法已验证可用于毒理学评估
结论
- 该模型有效模拟了肺部对吸入颗粒物的暴露
- 对毒性测试和呼吸系统研究具有重要意义
常见问题
行业重要性概述
体外支气管上皮模型对于预测吸入毒性测试和呼吸药物递送研究至关重要。采用Calu-3细胞的气液界面（ALI）系统可实现重复、低剂量暴露研究，更贴近人体气道生理条件，从而提高早期化合物评价的转化可靠性。该方法满足了呼吸系统生物制药研发中对生理相关性强、可重复模型的需求。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可实现对吸入化合物在气道上皮作用机制方面的风险降低。
- 通过长期维持紧密连接和黏液分泌，支持功能性的靶点验证。
- 有助于提高呼吸系统毒性和安全性评价的预测可靠性。
筛选与检测方法开发
- 提供一种经过验证且可重复的系统，用于定量测量上皮屏障的完整性。
- 支持对重复性低浓度颗粒暴露进行检测方法的标准化。
- 可在连续流动条件下可靠评估气载化合物的影响。
转化与临床前研究
- 与疾病相关的气道模型相一致，适用于转化生物标志物研究。
- 确保从体外发现到临床前吸入毒理学工作流程的连续性。
- 通过模拟真实暴露场景，降低后期研发失败的风险。
流程与工作流整合
这种气液界面支气管模型可整合到呼吸系统治疗药物和吸入毒理学从发现到临床前研究的连续流程中。
- Discovery Biology: 支持气道屏障功能和颗粒物毒性的假设验证。
- Screening: 提供可重复、定量的跨上皮电阻和细胞活力读数。
- Analytics: 实现暴露浓度和递送剂量的连续监测。
- Translational Research: 通过与疾病相关的终点指标，将体外研究结果与临床前吸入研究相衔接。
- Enterprise Reuse: 提供一个标准化平台，可适应多种空气颗粒物和药物研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高呼吸毒性测试的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：增强重复暴露实验方案的可重复性和可扩展性。
- 战略价值：优化呼吸系统研发项目组合中的决策流程，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持对吸入性化合物及制剂进行基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备气液界面细胞培养和上皮屏障功能检测的专业知识。
- 需要专用仪器以实现持续流动暴露和电阻监测。
- 要求跨团队在暴露方案和数据分析方面进行标准化。
- 在模型允许的范围内，可适用于多种空气颗粒物类型和浓度。
- 依赖于在长期培养过程中维持细胞活力和紧密连接完整性。
