来自成人鼠心脏的心外肌细胞、心室肌细胞和非肌细胞的同步隔离和文化

大家好，我是 Chris Glembotski。我是凤凰城亚利桑那大学医学院的医学教授。我是同样位于凤凰城的转化心血管中心的主任。

今天，我想向大家介绍两位将要演示我们的新技术的人，Erik Blackwood 博士，我的高级博士后研究员和培训教师，以及高级研究助理 Alina Bilal 小姐。目前的心肌细胞分离方案限制了培养细胞的数量和活力，为进一步了解心脏生理学和病理生理学创造了实验僵局。该方案不仅旨在加快成年小鼠心肌细胞分离的过程，而且还同时从单个小鼠心脏中增加心房和心室心肌细胞的细胞产量和活力。

这项技术对治疗发现具有深远的意义，并且可以在细胞类型特异性水平上更好地表征心房颤动等疾病，从而确定治疗靶点。我们建议以前没有显微外科经验的人在尝试完整的隔离方案之前，广泛练习升主动脉外植和插管步骤。首先用剪刀做一个中线皮肤切口，从腹部中部到下巴快速打开麻醉的 10 周龄 C57 黑色 6J 小鼠的胸部。

进入腹膜并通过钝性解剖清除隔膜。沿着两侧外侧的胸壁切开胸腔，剪掉心脏和胸壁之间的纤维连接。完全切除胸腔后，使用小镊子和剪刀通过心尖轻轻抬起心脏，露出心脏的后部。

要移植心脏，请立即解剖升主动脉上无名动脉下方，并立即将心脏置于冰冷的心脏灌注介质中。快速解剖掉剩余的组织，露出升主动脉，并使用显微解剖钳和剪刀清除主动脉周围区域的多余组织。使用细尖镊子将清洁后的主动脉定位在灌注插管上两毫米处，并用 5-0 丝缝合线固定套管。

用心脏灌注培养基以每分钟 3 毫升的流速冲洗空心心脏 4 分钟，然后切换到消化缓冲液 15 至 17.5 分钟。在灌注的最后几分钟内，收集 8 毫升消化缓冲液流，并将心脏从套管转移到 60 毫米塑料培养皿中，然后去除多余的组织并将心脏浸入 2.5 毫升消化缓冲液中。对于心房细胞分离，将心房从心脏中解剖出来，并将心房放入含有 750 微升消化缓冲液的 30 毫米塑料培养皿中。

使用细尖手术剪刀，将心房切碎并梳理开，然后用细镊子进一步解剖组织，不要搅动或拉开肌纤维。使用无菌移液移液器吸头，继续轻轻混合并解离组织 15 分钟。每 5 分钟，在明场显微镜的 10 倍物镜下观察心房肌细胞解离。

随着组织进一步消化，在将细胞悬液转移到无菌 2 mL 微量离心管中之前，继续使用孔径较小的无菌移液移液器吸头轻轻混合和解离组织。用 750 微升 37 摄氏度肌细胞终止缓冲液 1 冲洗 30 毫米板，并将缓冲液与细胞悬液混合。让心房肌细胞在重力作用下沉淀，并在室温下轻轻搅动 10 分钟。

当形成可见沉淀时，离心细胞悬液并将不含肌细胞的上清液转移到 15 毫升聚丙烯锥形管中，而不会干扰心房肌细胞沉淀。离心非肌细胞组分，并将非肌细胞沉淀重悬于 10 毫升补充有 10% 胎牛血清的 DMEM 中。计数后，将非肌细胞置于适当的实验密度进行下游分析，然后以适当的实验浓度重悬分离的心房肌细胞沉淀，以接种到层粘连蛋白包被的培养板上。

对于心室细胞分离，如刚才对心房组织样品所示，将心室心脏组织切碎，并将所得细胞悬液转移到含有 2.5 毫升 37 摄氏度肌细胞终止缓冲液 1 的 15 毫升聚丙烯锥形管中。用 2.5 毫升 37 摄氏度肌细胞终止缓冲液 1 冲洗解剖板，并将洗涤液与细胞悬液混合。使用无菌移液管，继续轻轻混合并解离组织 4 分钟。

在孵育结束时，使用 10 微升等分试样的细胞检查是否存在杆状肌细胞。将细胞悬液通过无菌 100 μL 尼龙过滤器放入 50 mL聚丙烯锥形管中，并使用 2 mL 先前收集的消化缓冲液从无菌尼龙过滤器中洗涤任何剩余的细胞。让心室肌细胞在重力作用下沉淀 6 分钟，轻轻搅拌，直到在管底部形成可见的颗粒。

使用无菌移液器吸头，将不含肌细胞的上清液转移到 15 毫升聚丙烯锥形管中，而不会干扰心室肌细胞沉淀，并离心非肌细胞组分。将非肌细胞沉淀重悬于 10 毫升补充有 10% 胎牛血清的 DMEM 中用于计数，并以适当浓度接种细胞用于下游分析，然后将分离的心室肌细胞重悬于 2 毫升肌细胞终止缓冲液 2 中用于计数。为了建立逐步模式钙再引入，向脑室肌细胞悬液中加入 50 微升 10 毫摩尔氯化钙，充分混合，在室温下孵育 4 分钟。

孵育结束时，向细胞中再加入 50 μL 10 毫摩尔氯化钙，混合后在室温下再孵育 4 分钟。接下来，用 100 μL 10 毫摩尔氯化钙孵育 4 分钟，用 80 μL 10 毫摩尔氯化钙孵育 4 分钟。最后一次孵育后，根据其计划的下游分析，将钙处理的心室肌细胞重悬于适当体积的心室肌细胞铺板培养基中，并将细胞接种在层粘连蛋白包被的培养板上。

一小时后，用补充有 25 微摩尔 Blebbistatin 的心室肌细胞维持培养基替换上清液。心肌肌钙蛋白 T 是心肌细胞的标志物，在心房和心室心肌细胞培养物中均强强表达。相比之下，心房利钠肽和肌球蛋白轻链 2 分别在心房和心室心肌细胞培养物中强烈且特异性地表达。

成纤维细胞标志物仅在从心房和心室腔分离的非肌细胞培养物中表达。成年小鼠心房和成年小鼠心室肌细胞的 T 小管标志物二氢吡啶和兰尼碱受体的免疫染色显示，在整个分离和长期培养过程中 T 小管完整。肌节条纹模式可用于结合杆状形态和 TO-PRO-3 核染色来评估分离心肌细胞的纯度和活力。

正如预期的那样，心室心肌细胞很大，平均长度约为 150 微米，而心房心肌细胞平均约为 75 微米。此外，在免疫染色分析中，心房心肌细胞表现出心房利钠肽的强烈表达，其染色模式是定位于内质网和分泌颗粒的特征。虽然心房肌细胞在基础条件下分泌心酸钠肽，但分泌物对促分泌剂的反应会增加。

此外，心房心肌细胞分泌心酸利钠肽，并且共分泌仅将一部分激素从其前体状态加工成产物肽。最常见的可避免错误包括在牺牲前没有让动物保持冷静，没有从灌注系统中排出气泡，以及外科医生自己没有保持冷静。在此程序之后，可以执行任何常见的实验程序，包括测定电生理和钙处理参数、免疫细胞化学、肥大反应和信号传导研究，以及模拟缺血再灌注研究。