脑片中传入通路的光遗传学激活及挥发性麻醉剂对反应的调节

本方案可用于研究挥发性麻醉剂是否对某些突触的影响大于其他突触，判断其效应是否具有细胞类型或信号通路特异性，并确定在群体水平上产生的效应。该技术的主要优势在于能够特异性地评估挥发性麻醉剂的作用效果。我们可在同时检测群体活性的过程中，靶向特定的信号通路和细胞类型。

首先准备组织块以进行切片。轻轻将脑组织从颅腔中取出，放置在滤纸上。沿脑的矢状面平行于正中线进行切割，并将组织块置于该矢状面上。

将滤纸移至封闭模板上方，使脑组织与模板轮廓对齐。根据模板上的线条指示，在冠状面进行平行切割；必要时滴加少量切片用 aCSF，以保持滤纸湿润。将组织块置于 4 °C 的切片用 aCSF 中，并在冰冷的样品台表面涂上少量胶水。

将组织块从切片用 aCSF 中取出，用吸水纸的一角吸去多余的溶液。将组织块的后冠状面粘附到样品台上，脑的背侧朝向蓝宝石刀片。采集500微米厚的冠状脑切片，并将其置于34摄氏度的切片用aCSF中尼龙网膜上。

让容器恢复至室温。为制备含有溶解异氟烷的实验用 aCSF 袋，向一个空的聚四氟乙烯气体袋中加入 600 毫升实验用 aCSF 和 600 毫升 95% 氧气与 5% 二氧化碳的混合气体。将此袋标记为对照组。

向另一个聚四氟乙烯气体袋中加入 300 毫升实验用 aCSF，并将此袋标记为异氟烷。按照文稿中的说明继续准备异氟烷气体袋。通过将波形随机分配至每个配置文件来设置光刺激模拟程序。

每个配置了特定波形的轮廓对应一个来自数字TTL输入的触发脉冲或一次试验。完成后，保存轮廓序列。将多通道探针放置于离体脑组织切片时，以每分钟三至六毫升的速度灌注通入氧气的实验用aCSF，并将包含目标区域的脑切片转移至显微镜灌流室中的网格支架上。

用铂金丝网固定脑片。旋转网格，使多通道探针远端电极触点的连线大致与剥离面垂直。在宽场照明和显微操作器的精细控制下，将多通道探针缓慢下降至脑片表面。

选择合适的滤光立方体，以观察皮层传入纤维轴突末梢中表达的荧光报告蛋白。如有必要，旋转脑片以更精确地将探针与剥离面对齐。将探针置于脑片平面上方，沿x轴方向距离最终目标位置200微米处，至少留出一个通道位于记录组织区域之外。

沿脑片的长轴缓慢插入探针。为尽量减少对组织的损伤，仅将探针推进至尖端在组织表面下方刚好可见的程度。将实验用 aCSF 源切换至袋装对照溶液，并识别荧光标记的细胞以进行靶向膜片钳记录。

将孔径调节至最小直径，并启用高倍水浸物镜，注意避免多通道探针与物镜镜头接触。调节至组织清晰对焦。将光线居中对准多通道探针附近但不重叠的组织区域。

启用适当的滤光片组，以实现对表达Cre依赖性荧光标记的细胞进行成像。抬高物镜，为降低膜片钳电极留出充足空间。用内液填充膜片钳电极，并将其安装到电极夹持器上。

使用1毫升注射器施加相当于约0.1毫升空气的正压。在视觉引导下将膜片电极移入溶液中，并使电极尖端进入视野焦点，对目标细胞进行全细胞记录。本方案中使用的动物在其生长抑素或钙结合蛋白parvalbumin阳性的中间神经元中表达荧光报告蛋白tdTomato。

在荧光显微镜下使用适当的滤光镜组进行视觉引导，对这些中间神经元实施了膜片钳记录。中间神经元在受到一串四个、每个持续两毫秒的光脉冲刺激后，产生了突触后电位。同时记录了局部场电位。

通过局部场电位提取电流源密度和多单位放电活动。从电流源密度中提取的电流汇的幅度随光强度的增加而增大。采用三参数非线性逻辑方程对数据进行拟合，以实现不同通路间的比较。

突触后电位的幅度也随电流汇聚幅度的增加而增大。在对照、异氟烷和恢复条件下，测量了丘脑皮层和皮层-皮层输入的突触反应。在异氟烷条件下，生长抑素和皮层-皮层刺激引起的突触后反应以及诱发电流汇聚均受到抑制。

在制备脑切片时，维持组织的活性至关重要。在整个切片过程中，必须保持组织低温，操作迅速且不损伤组织。多通道胞外记录可通过多种方式进行后期处理。

例如，对宽带信号进行高通滤波可分离出群体放电活动，而电流源密度计算则能突出突触活动。结合这些技术，我们得以探究麻醉剂对皮层环路中特定独立组分的影响，从而深入理解体内意识丧失的潜在机制。