脑切片中传入通路的光遗传学激活和挥发性麻醉剂对反应的调节
July 23rd, 2020
离体脑切片可用于研究挥发性麻醉剂对传入输入的诱发反应的影响。光遗传学用于独立激活丘脑皮质和皮质皮层传入非原发性新皮层，并且用异氟醚调节突触和网络反应。
该方案可用于研究挥发性麻醉剂是否比其他麻醉剂更能破坏某些概要，以确定它们的影响是细胞类型还是途径特异性的，并确定在种群水平上发生的影响。这种技术的主要优点是我们可以评估挥发性麻醉剂效果的特异性。我们可以同时检测群体活性，靶向特定通路和细胞类型。
首先准备用于切片的组织块。轻轻地将大脑从颅腔中取出，并将其放在滤纸上。沿着平行于中线的大脑矢状面切开，并将组织块放在该矢状面上。
将滤纸引导到阻塞模板上，并将大脑与底层模板轮廓对齐。如模板上的线条所示，在冠状面上进行平行切割，必要时加入一小滴切片 aCSF 以保持滤纸湿润。将组织块置于 4 摄氏度的 aCSF 切片中，并在冰冷的标本载物台上涂抹少量胶水。
从切片 aCSF 上提起组织块，并用吸水毛巾的一角吸走多余的溶液。将组织块的后冠状平面粘在标本台上，使大脑的背表面面向蓝宝石叶片。收集 500 微米厚的冠状脑切片，并将它们放在 34 摄氏度的尼龙网上，以 aCSF 切片。
让容器达到室温。要制备含有溶解异氟醚的实验性 aCSF 袋，请将 600 毫升实验性 aCSF 和 600 毫升 95% 氧气和 5% 二氧化碳气体混合物添加到空的聚四氟乙烯气袋中。标记此袋子控件。
将 300 毫升实验性 aCSF 添加到另一个聚四氟乙烯气袋中，并将该气袋标记为异氟醚。根据手稿说明继续准备异氟醚袋。通过为每个配置文件随机分配波形来配置光线模拟协议。
每个配置文件及其分配的波形对应于来自数字 TTL 输入的一个触发脉冲或一个试验。完成后，保存配置文件序列。要将多通道探针放置在离体脑组织载玻片中，以每分钟 3 至 6 毫升的速度灌注鼓泡的实验 aCSF，并将包含感兴趣区域的脑切片转移到显微镜灌注室中的网状网格上。
用铂金竖琴固定脑切片。旋转网格网格，使多通道探针远端的电极接触线大致垂直于剥离表面。在宽视野照明和显微作器的精细控制下，将多通道探针降低到切片表面。
使用适当的滤光片立方体，以观察在皮质传入神经轴突末端表达的荧光报告蛋白。如有必要，旋转切片以更精确地将探针与剥离表面对齐。将探针放置在切片平面的正上方，沿 x 轴距离最终目标位置 200 微米，在被记录的组织区域之外至少留下一个通道。
沿其纵轴慢慢将探针插入切片中。为了尽量减少对组织的损害，请仅将探头推进到组织表面下方可见锋利尖端的程度。将实验 aCSF 源切换到袋装对照溶液，并识别荧光标记的细胞以进行靶向膜片钳记录。
将孔径限制在最小直径并接合高功率水浸物镜，注意避免多通道探头和物镜之间接触。聚焦组织。将光线置于与多通道探针相邻但不重叠的组织区域上。
使用适当的滤光片组，以便对表达 Cre 依赖性荧光标记物的细胞进行成像。抬起物镜，为降低补片移液器创造充足的空间。用内部溶液装入膜片移液器并将其安装在电极支架上。
使用 1 毫升注射器施加相当于约 0.1 毫升空气的正压。将贴液管放入溶液中，在视觉引导下使吸头聚焦，并从目标细胞获得全细胞记录。该方案中使用的动物在生长生长抑素或小白蛋白阳性中间神经元中表达荧光报告蛋白 tdTomato。
这些中间神经元在视觉引导下以适当的滤光片立方体为目标进行膜片钳。在中间神经元中观察到突触后电位响应于一组 4 个 2 毫秒的光脉冲。还记录了局部场电位。
电流源密度和多单位活性是从局部场电位中提取的。从电流源密度中提取的电流吸收的幅度随着光强度的增加而增加。将三参数非线性 logistic 方程拟合到数据中，以便进行跨通路比较。
突触后电位振幅也随着电流汇幅的增加而增加。在对照、异氟醚和恢复条件下测量对丘脑皮质和皮质-皮质输入的突触反应。在异氟醚条件下，生长抑素和皮质皮质刺激的突触后反应以及诱发的电流吸收受到抑制。
在准备大脑切片时，保持组织的健康至关重要。在整个切片过程中保持组织凉爽非常重要，在不损坏组织的情况下快速工作。多通道细胞外记录可以通过多种方式进行后处理。
例如，宽带信号的高通滤波可分离群体尖峰活动，而电流源密度计算可突出显示突触活动。总之，这些技术使我们能够探索麻醉对皮质回路特定孤立成分的影响，从而深入了解体内意识丧失的机制。
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概述
本研究利用体外脑切片来研究挥发性麻醉剂，特别是异氟烷，对神经元对传入输入的响应的影响。通过光遗传学，研究人员在非主要新皮层中独立激活丘脑皮质和皮质皮质传入，探索麻醉暴露如何调节突触和网络响应。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 突触可塑性
背景
- 理解挥发性麻醉剂如何影响神经元电路至关重要。
- 体外脑切片为此类研究提供了受控环境。
- 光遗传学允许特定神经元通路的激活。
- 麻醉剂对突触响应的影响可以为临床环境中的麻醉提供更广泛的启示。
研究目的
- 确定挥发性麻醉剂是否对不同的突触通路有不同的影响。
- 评估这些影响是否特定于某些细胞类型。
- 评估麻醉暴露期间的群体层面响应。
使用的方法
- 本研究的主要平台涉及来自动物的体外脑切片。
- 目标细胞类型包括肽释放抑制素和小钙结合蛋白阳性中间神经元。
- 脑切片的准备和维持在条件下最大限度地减少组织损伤。
- 实验包括光遗传学刺激以测量突触后电位。
- 关键步骤包括准备实验溶液和配置光刺激协议。
主要结果
- 异氟烷暴露抑制了丘脑皮质和皮质皮质输入的突触响应。
- 光强度增加时，突触后电位幅度增加，表明目标中间神经元的响应性。
- 电流源密度计算突出了特定条件下的增强突触活动。
- 结果表明麻醉剂对神经元兴奋性和突触调节有明确的影响。
结论
- 本研究展示了体外脑切片在检查麻醉对神经电路影响的实用性。
- 它提供了受挥发性麻醉剂影响的突触动力学的洞察，有助于深入理解麻醉下的神经元机制。
- 这些发现可能影响有关麻醉及其对大脑功能影响的临床实践。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise dissection of anesthetic effects on defined neural pathways and cell types, supporting mechanistic de-risking in CNS drug discovery. By isolating thalamocortical and corticocortical inputs in ex vivo brain slices, it provides quantitative, pathway-specific readouts that enhance target validation confidence. The approach aids in predicting how CNS-active compounds modulate network excitability and synaptic transmission, informing early go/no-go decisions in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether volatile anesthetics differentially affect synaptic pathways.
- Operational Value: Enables cell type- and pathway-specific assessment of drug effects on neuronal excitability.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds with selective modulation of thalamocortical versus corticocortical transmission.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems with quantifiable extracellular and intracellular responses to afferent stimulation.
- Reproducibility: Standardizes optogenetic stimulation and anesthetic delivery via aCSF for consistent synaptic response measurements.
- Scalability: Supports multi-condition testing (control, drug, recovery) to enable dose-response and time-course profiling.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models thalamocortical circuits implicated in consciousness and sensory processing, aligning with neuropsychiatric indications.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by preserving key physiological properties of cortical networks.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insight into anesthetic-induced suppression of postsynaptic potentials, informing safety pharmacology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical assessment, offering a platform to evaluate CNS compound effects on defined neural circuits before in vivo testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pathway-specific drug actions and biological de-risking of synaptic targets.
- Screening: Delivers assay-ready preparations with quantifiable postsynaptic potential and current source density outputs.
- Analytics: Enables comparison of synaptic responses across conditions using non-linear logistic fitting of light-intensity response curves.
- Translational Research: Maintains cortical circuit integrity to support extrapolation to preclinical efficacy and safety studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening anesthetic and non-anesthetic CNS modulators on isolated afferent pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by isolating cell type-specific effects of volatile anesthetics on synaptic transmission.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized tissue preparation, optogenetic stimulation, and anesthetic delivery in aCSF.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing whether compounds preferentially disrupt thalamocortical or corticocortical signaling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on pathway-selective modulation of interneuron activity in sensory cortex.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, electrophysiology, and brain slice preparation.
- Depends on fluorescence-guided patch clamping and multi-channel extracellular recording systems.
- Necessitates precise control of anesthetic concentration in aCSF and light stimulation protocols.
- Involves adaptation considerations when translating findings across species or disease models.
- Limited by tissue viability duration and the need to maintain physiological conditions throughout experimentation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Preparation of Acute Brain Slices
2:47
Placing Multi-Channel Probe in Ex Vivo Brain Tissue Slice
4:38
Patch Clamping Targeted Neurons and Obtaining Whole-Cell Configuration
5:55
Results: Intracellular and Multi-Channel Extracellular Recordings in Cortical Slice
7:19
Conclusion
