Name: 脑切片中传入通路的光遗传学激活和挥发性麻醉剂对反应的调节 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学习利用光遗传学技术激活离体脑切片中的丘脑皮层和皮层皮层传入通路，研究异氟烷等挥发性麻醉剂对突触反应和神经元网络活动的调节作用。该方法可精确靶向特定细胞类型，为理解麻醉机制提供重要依据。

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作者感谢 Bryan Krause 在本项目中提供的技术支持与指导。
本工作由国际麻醉研究学会（IMRA 资助 AR）、美国国立卫生研究院（R01 GM109086 资助 MIB）以及美国威斯康星大学麦迪逊分校医学院和公共卫生学院麻醉学系资助。

本方案中涉及动物的所有操作均经威斯康星大学麦迪逊分校医学院与公共卫生学院动物护理与使用委员会批准。
1. 繁殖在中间神经元亚群中表达荧光报告蛋白的小鼠
<ol>
	<li>将纯合的 Cre 依赖性 tdTomato 雄性小鼠与纯合的 SOM-Cre 雌性小鼠或纯合的 PV-Cre 雌性小鼠配对。 
	注意：通过使用相应的 Cre 品系，也可靶向其他特定的神经元群体。</li>
	<li>让杂合子后代至少生长至 3 周龄后再进行后续操作。对于本实验所述内容，无需进行基因分型，因为纯合亲本所产生的后代均对细胞类型特异性 Cre 重组酶和 Cre 依赖性报告基因等位基因呈杂合状态。</li>
</ol>
2. 进行单侧立体定位病毒载体注射
<ol>
	<li>根据仪器用户手册中的说明，调整微电极拉制仪用于制备注射用微电极的参数（推荐参数见表1）。拉制玻璃微电极。</li>
	<li>打断微电极尖端，使其尖端直径约为 30 µm，并在数毫米长度内保持最小的锥度。</li>
	<li>根据已有文献记载的方法，确定注射病毒的合适滴度和体积。在本实验中，单侧注射 1.0 μL（滴度：3.1–5.7 TU/mL）可获得良好效果。</li>
	<li>用石蜡油将微电极完全回填。将微电极安装至微量注射器上，并推动少量石蜡油通过尖端，以确保尖端无堵塞。</li>
	<li>前端填充至少 1.0 μL 的病毒载体。本实验所用的重组腺相关病毒载体为 AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP。</li>
	<li>在手术区域铺设无菌洞巾。对立体定位手术器械进行灭菌处理，并放置于洞巾上。</li>
	<li>使用异氟烷（诱导浓度 3%，维持浓度 1.5–2%）与氧气混合气体对 SOM-tdTomato 或 PV-tdTomato 杂合子动物进行麻醉。在整个手术过程中，定期通过夹趾反应确认麻醉深度。每 10–15 分钟监测一次呼吸频率，确保动物处于手术所需的麻醉水平，无过度活动。</li>
	<li>剃除动物头部顶部的毛发。在手术区域充分涂抹 70% 异丙醇和含碘消毒液，并在眼窝处涂抹眼用软膏以防止黏膜干燥。在手术部位皮下注射布比卡因/利多卡因（1:1 比例，1.0 mg/kg）以实现局部麻醉。</li>
	<li>将动物固定于立体定位仪中。</li>
	<li>使用手术刀沿颅骨背侧表面皮肤的矢状轴做切口。用镊子将皮肤拉开。根据需要使用 0.9% 生理盐水保持颅骨湿润。</li>
	<li>在颅骨表面用铅笔轻轻标记前后向与侧向坐标的交点。在横断面上相应坐标处钻孔（以 Bregma 为参考，单位为 mm；扣带回皮层（Cg）注射：前向 0.2，侧向 0.3；后丘脑（Po）注射：后向 2.25，侧向 3.4）。 
	注意：标记线应超出钻孔边界，以便准确引导微电极的定位。</li>
	<li>打开并平衡气浮平台。</li>
	<li>将立体定位仪的电极操纵器调整至 0° 角度用于 Cg 注射，或在冠状面调整至 45° 角度用于 Po 注射。</li>
	<li>将注射泵安装至电极操纵器上。将微注射泵控制器连接至注射泵。</li>
	<li>将微电极尖端移至接近（但不接触）脑表面的位置，即第 2.11 步所标记坐标的交点处。沿其纵轴以约 1 mm/s 的速度将微电极插入脑内，深度为 0.9 mm（Cg 注射）或 3.1 mm（Po 注射）。继续操作前等待 10 分钟。</li>
	<li>在 10 分钟内注射 1.0 µL 病毒载体（100 nL/min）。若观察到病毒从插入部位溢出，应将注射速率减慢至 50 nL/min。</li>
	<li>注射完成后，等待 10 分钟，再缓慢撤出注射微电极。</li>
	<li>缝合头皮切口，并皮下注射 2–5 mg/kg 的美洛昔康。</li>
	<li>停止异氟烷麻醉，监测动物从麻醉中苏醒的过程。按照机构动物护理与使用委员会规定的程序进行术后恢复，包括进一步给予镇痛药物。</li>
</ol>
3. 急性脑切片的制备
<ol>
	<li>在收获组织前，至少预留 3 周时间以确保病毒载体的充分表达。</li>
	<li>准备 1 L 用于切片的人工脑脊液（切片用人工脑脊液，sACSF）。成分详见表 2。</li>
	<li>在整个切片过程中，通过气体分散管向 sACSF 中持续通入溶解的 95% O2/5% CO2 混合气体。</li>
	<li>为振动切片机准备冰浴环境。将冰冷的样品台安装到切片机上，并固定蓝宝石刀片以进行组织切片。</li>
	<li>使用 3% 异氟烷与氧气麻醉小鼠，直至其翻正反射消失。</li>
	<li>使用断头器断头处死小鼠，并立即将头部浸入 4°C 的 sACSF 中。为保持组织活性，请尽快完成后续操作步骤。</li>
	<li>在颅底做一小切口，轻轻移除各颅骨板，打开颅腔。随后轻柔地去除下方的硬脑膜。</li>
	<li>在脑组织仍位于颅腔内时，使用刀片切除小脑。在左半球矢状面中线外侧附近做第二个垂直切口。</li>
	<li>准备用于切片的组织块。
	<ol>
		<li>轻柔地将脑组织从颅腔中取出，将其放置在滤纸上，使平整的矢状切面朝下。将滤纸连同脑组织一起对准修块模板，并与模板轮廓对齐（补充图 1）。</li>
		<li>根据模板上的标线，在冠状面上做两个平行切口。如有需要，可滴加少量 sACSF 以保持滤纸湿润。</li>
		<li>在进行步骤 3.8.4 时，将组织块短暂置于 4°C 的 sACSF 中。</li>
		<li>在冰冷的样品台上涂抹少量超级胶水。</li>
		<li>从冷 sACSF 中取出组织块，用吸水纸的一角吸去多余的液体。将组织块的后部冠状面粘附于样品台上，确保脑组织的背侧朝向蓝宝石刀片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集厚度为 500 µm 的冠状脑切片。将目标切片置于尼龙网膜上（补充图 2），放入 34 °C 的 sACSF 中，并使容器逐渐恢复至室温。 
	注：本研究所述实验中，电生理记录采集自布雷加马点后约 2.25 mm 处的冠状切片，用于研究非初级感觉区域——内侧次级视觉皮层（V2MM）。</li>
</ol>
4. 含溶解挥发性麻醉剂异氟烷的实验用人工脑脊液（eACSF）袋的制备
<ol>
	<li>配制 300 mL 的 3.0% 异氟烷储备混合气。
	<ol>
		<li>在密封的聚四氟乙烯气体袋中，加入约 100 mL 的 95% O2/5% CO2 气体混合物至 20–30 mL 液态异氟烷和少量 0.9% 生理盐水中。静置至少 30 分钟，使异氟烷在液相和气相之间达到平衡。</li>
		<li>使用以下公式计算需加入储备袋中的饱和异氟烷气体量 Vsat： 
		<img alt="溶液中异氟烷浓度的计算公式，V_sat 计算公式，化学。" src="/files/ftp_upload/61333/61333equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
		其中 P%stock 为储备气体的目标组成（本例中为 3%），Vstock 为储备气体袋的最终体积，Pisoflurane 为室温下异氟烷的分压（约 240 mmHg），Ptotal 为大气压（约 760 mmHg）。</li>
		<li>将计算所得的饱和气体量加入一个空的气体袋中，再用 95% O2/5% CO2 气体混合物充填，使储备袋总体积达到 300 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 2 L 人工脑脊液，用于实验过程中对脑片的灌流（实验用 ACSF，eACSF）。成分见表 2。将 95% O2/5% CO2 气体混合物溶解于溶液中。</li>
	<li>分别准备两袋对照组和异氟烷溶液。
	<ol>
		<li>向一个空的聚四氟乙烯气体袋中加入 600 mL eACSF 和 600 mL 的 95% O2/5% CO2 气体混合物。将此袋标记为对照组。</li>
		<li>向另一个空的聚四氟乙烯气体袋中加入 300 mL eACSF。将此袋标记为异氟烷组。</li>
		<li>选择一个具有生理相关性的平衡气相浓度的异氟烷。实验中采用相当于 1.3% 异氟烷的气体浓度。小鼠在吸入 0.9% 异氟烷时失去翻正反射，推测此时已丧失意识。</li>
		<li>使用以下公式计算室温下的等效气相浓度 P%(Troom)31： 
		<img alt="与温度差异相关的湿度校正公式方程。" src="/files/ftp_upload/61333/61333equ02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"> 
		其中 P%(Tbody) 为步骤 4.3.3 中选定的生理相关气相浓度，Troom 为 25 °C，Tbody 为 37 °C。</li>
		<li>使用以下公式计算需从储备气体袋中加入异氟烷溶液的气体体积 Vstock： 
		<img alt="静态平衡公式，Vstock 计算，显示科学中使用的 Vsolution 和 P% 等变量。" src="/files/ftp_upload/61333/61333equ03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 3"> 
		其中 Vsolution 为异氟烷袋中 eACSF 的体积（300 mL），P%(Troom) 取自公式（2），λ 为异氟烷在生理盐水/气体中的奥斯瓦尔德分配系数（λ = 1.232），P%stock 为储备气体袋的气相浓度（P%stock = 3.0%）。</li>
		<li>向异氟烷溶液袋中加入步骤 4.3.5 计算所得的来自储备气体袋的气体体积 Vstock。</li>
		<li>向异氟烷溶液袋中加入适量 95% O2/5% CO2 气体混合物，使异氟烷溶液袋中气体总体积达到 300 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将对照组和异氟烷组气体袋置于摇床上振荡至少 1 小时，以使异氟烷达到相平衡。</li>
	<li>在所有数据采集完成后，可使用麻醉气体监测仪测量袋中剩余溶液上方平衡后的异氟烷气相浓度，以验证实际浓度是否正确。</li>
	<li>以水相单位报告挥发性气体的实验浓度，因为毫摩尔浓度对温度变化更具稳定性。使用以下公式将室温下的气相浓度 P%(Troom) 转换为等效水相浓度（Caqueous，单位为 mM）31： 
	<img alt="化学平衡方程：C&lt;sub&gt;aqueous&lt;/sub&gt;=0.44614*α*P°%(T&lt;sub&gt;room&lt;/sub&gt;) 在科学研究中的应用。" src="/files/ftp_upload/61333/61333equ04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 4"> 
	其中 α 为异氟烷在 25°C 时生理盐水/气体中的本生分配系数32。</li>
</ol>
5. 多通道记录硬件和软件的准备
<ol>
	<li>根据制造商说明设置16通道数据采集系统。 
	注意：可使用多种市售的放大器和数据采集系统来收集多通道记录。在本实验中，模拟信号通过电极参考板传送到两个放大器，在其中被放大（2000倍）并过滤（0.1–10 kHz）。数据采集系统的模拟输入以40 kHz进行数字化。</li>
	<li>将合适的16通道前置放大器适配器固定到显微镜微操作器上。调整适配器方向，使雌性连接端口朝下。</li>
	<li>调节该微操作器的操作角度，使其朝向记录室下方，与水平方向成约70°角。</li>
	<li>通过固定在微操作器上的前置放大器适配器，将前置放大器输入端连接至用于体外电生理学的16 × 1探针。</li>
	<li>将前置放大器输出连接器连接至数据采集系统。</li>
	<li>安装适当的数据采集软件。配置15个输入通道，以对应前15个多通道探针触点的输入信号。将剩余的一个通道配置为接收细胞内电极的输入信号。 
	注意：在采集和分析数据时，务必考虑电极和适配器的对应关系图，以确保每个信号与其采集所用的电极触点正确对应。</li>
</ol>
6. 光刺激方案的配置
<ol>
	<li>设置光传递系统并安装配套软件。</li>
	<li>打开软件。选择硬件接线配置，其中触发源（数字/TTL 输出）向光传递系统提供触发输入信号，光传递系统则向 470 nm LED 提供触发输出信号。</li>
	<li>安装高倍物镜。使用数字相机，对高倍物镜与光传递系统的配合使用进行校准。</li>
	<li>创建新的光刺激模式序列。
	<ol>
		<li>创建所需图案。在本实验中，使用直径为 150 µm 的圆形，以实现对轴突末梢特定层的激活。</li>
		<li>为构建模式序列，将该模式复制并粘贴至任意数量的试验中。</li>
		<li>创建一个波形列表，其中包含任意光强度、脉冲持续时间或脉冲次数的波形。</li>
		<li>将波形随机分配给每个模式。每个模式及其分配的波形对应于一个来自数字 TTL 输入的触发脉冲，即一次试验。</li>
		<li>保存该模式序列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在数据采集软件中创建新协议。
	<ol>
		<li>设置试验次数，使其等于刚刚创建的模式序列中的模式数量。</li>
		<li>选择信号输入，以匹配步骤 5.6 中配置的输入。配置一个协议，提供单个数字 TTL 输出，并在数字触发前后适当的时间段内记录这 16 个输入通道的信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 将多通道探针放置于离体脑组织切片中
<ol>
	<li>以3-6 mL/min的流速灌注已通气的eACSF（不要使用密封袋装）。</li>
	<li>将含有目标区域的脑片转移至显微镜灌流室中的网格支架上，并用铂金丝网固定（见补充图3）。</li>
	<li>旋转网格支架，使多通道探针远端电极触点的连线大致垂直于软脑膜表面。</li>
	<li>在宽场照明条件下，通过显微操作器精细控制，将多通道探针缓慢下降至脑片表面附近。</li>
	<li>旋转滤光片转轮，选择合适的滤光片组以观察皮层传入纤维轴突末梢中表达的荧光报告蛋白。如有必要，可旋转脑片以更精确地使探针对准软脑膜表面。</li>
	<li>将探针定位在脑片平面稍上方，沿x轴方向距离最终目标位置约200 µm处，确保至少有一个通道位于记录组织区域边界之外。</li>
	<li>沿探针的纵轴方向缓慢推进操作器，将探针插入脑片。为尽量减少对组织的损伤，仅推进至锐利的探针尖端刚好可见于组织表面下方即可。这样可在确保电极触点与组织接触的同时，最大程度减少组织损伤。</li>
</ol>
8. 膜片钳技术靶向神经元并获得全细胞记录构型
<ol>
	<li>将eACSF的来源切换至袋装的对照溶液。</li>
	<li>识别荧光标记的细胞，用于靶向膜片钳记录。
	<ol>
		<li>将孔径光圈缩小至最小直径。使用低倍物镜，并将组织调至焦点。</li>
		<li>将光线居中对准多通道探针附近但不重叠的组织区域。</li>
		<li>切换至高倍（40x或60x）水浸物镜，操作时需小心避免多通道探针与物镜接触。</li>
		<li>旋转滤光片转轮，选择合适的滤光片组，以便成像表达Cre依赖性荧光标记的细胞。</li>
		<li>识别一个荧光标记的细胞作为膜片钳记录的目标。抬高物镜，为下放膜片钳电极留出足够空间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将膜片钳电极（见表1）用内液（表2）灌注，并安装至电极夹持器中。使用1 mL注射器施加约0.1 mL空气对应的正压。</li>
	<li>将膜片钳电极放入溶液中，并在视觉引导下将电极尖端调至焦点。</li>
	<li>按照先前已演示的步骤33，从目标细胞获得全细胞记录。</li>
	<li>若计划评估细胞内在特性的变化（例如输入电阻、对电流阶跃的峰电位发放频率），则进行此类记录；否则，进入下述的轴突刺激方案。</li>
</ol>
9. 轴突末梢的层特异性光遗传学激活
<ol>
	<li>在 x-y 平面内调节视野，使光刺激轮廓与脑片上目标位置对齐。</li>
	<li>加载光刺激程序，并准备光传递系统以接收数字 TTL 脉冲。</li>
	<li>在同时记录细胞外场电位和细胞内膜电位波动的同时，进行光遗传学激活轴突末梢。</li>
	<li>将 eACSF 源切换至异氟烷溶液，灌注药物 15 分钟。如有需要，在药物灌注期间采集自发性记录。</li>
	<li>重复步骤 9.2–9.3。</li>
	<li>将 eACSF 源切换回对照溶液，洗脱药物 20 分钟。如有需要，在药物洗脱期间采集自发性记录。</li>
	<li>重复步骤 9.2–9.3。</li>
</ol>

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<li>Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+inhibition+of+frontal-to-parietal+feedback+connectivity+is+a+neurophysiologic+correlate+of+general+anesthesia+in+surgical+patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients.</a> PLoS.One. 6 (10), 25155(2011).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+Properties+in+Transitions+of+Consciousness+during+Propofol-induced+Sedation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16791(2017).</li>
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<li>Franks, N. P., Lieb, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+actions+of+volatile+general+anaesthetics+at+molecular+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Selective actions of volatile general anaesthetics at molecular and cellular levels.</a> British Journal of Anaesthesia. 71 (1), 65-76 (1993).</li>
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<li>Banks, M. I., Pearce, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+actions+of+volatile+anesthetics+on+GABAA+IPSCs%3A+dissociation+of+blocking+and+prolonging+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects.</a> Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).</li>
<li>Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+measures+of+volatile+anesthetics+in+the+aqueous+phase+using+calcium+sensitive+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种在离体脑片中评估选择性激活传入通路所引发的细胞内和细胞外反应的实验方案。
利用光遗传学工具和并行记录方案，研究人员能够在同时记录特定中间神经元群体反应的同时，探究局部神经元群体对远端脑区传入输入的响应。光遗传学技术的应用使得即使胞体已不再连接，传入投射的轴突末梢仍能得以保存并被激活。这缓解了以往对离体（ex vivo）脑片所施加的几何学限制，因为长距离电连接的完整性不再至关重要。然而，在制备脑片时仍需注意选择适当的几何切面，以尽可能保留感兴趣的剩余连接。例如，锥体细胞沿皮层柱呈垂直方向排列，而本实验中多通道探针所记录的诱发性网络活动依赖于此类局部连接的完整性。因此，采用冠状面切片以维持局部连接的完整。
在选择光遗传学构建体及相关荧光报告蛋白时，必须考虑其激发/发射光谱特性以及显微镜的光学系统。持续的光照刺激可能导致多种视蛋白变体部分失活34，这一问题可通过选择激发光谱与视蛋白无重叠的报告蛋白来避免。此外，也可根据实验范式选择具有不同动力学特性或光敏...

挥发性麻醉药在一个多世纪以来的各种临床和学术环境中得到了广泛应用。不同类别的麻醉药具有独特且通常不重叠的分子靶点1,2,3，但几乎所有这些药物都能导致意识丧失。尽管其行为效应相当可预测，但麻醉药诱导意识丧失的具体机制在很大程度上仍不清楚。麻醉药可能通过作用于皮质-丘脑环路，干扰皮质层级中的信息整合，从而最终影响意识的水平和内容4,5,6,7,8,9。更广泛地说，皮质-丘脑环路的调节可能在实验性10或药理学诱导的意识状态改变中发挥作用11，也可能参与睡眠12以及意识的病理生理障碍13,14。 
麻醉过程中意识丧失与恢复的机制难以捉摸，部分原因可能在于麻醉药物在细胞、网络和系统水平上具有非线性、协同的作用15。例如，异氟烷可抑制特定脑区内的活动16,17,18，损害远距离脑区之间的功能连接19,20,21,22,23，并以通路特异性方式减弱突触反应24,25。然而，从分子到系统水平，哪些麻醉效应是导致意识丧失所必需或充分的，目前仍不明确。除了采用无创技术开展大量关于意识的临床研究外19,20,26，实验人员还应致力于解析支持意识体验的不同细胞和神经网络相互作用。
通过简化完整大脑中存在的复杂相互作用，离体脑片使得研究大脑动态系统的孤立组分成为可能9。脑片制备方法在保留局部神经环路相对完整的解剖结构的同时，兼具体外操作的灵活性。然而，直到最近，方法学上的限制一直阻碍了对脑片中长程传入纤维的突触和环路特性的研究27,28；皮质丘脑纤维束走行迂曲，使得通过电刺激激活独立的传入通路几乎无法实现。
研究麻醉剂对脑片标本的影响面临额外的挑战。由于缺乏完整的呼吸和循环系统，麻醉剂必须通过灌流方式施加，且其浓度需仔细匹配至估计的效应部位浓度。对于许多静脉麻醉剂而言，其在组织中的平衡速度较慢，使得传统的药理学研究变得繁琐29,30。在离体标本中研究挥发性气体麻醉剂的影响相对可行，但也存在挑战，包括将吸入的分压剂量转换为水相浓度，以及需要通过人工脑脊液对药物向组织的递送系统进行改造31。
本文描述了研究人员可利用挥发性麻醉剂异氟烷（isoflurane）已被充分证实的理化特性，将其用于离体脑片的药物递送，以高时空分辨率激活皮层特定区域的通路特异性和层次特异性输入，并对特定神经元群体进行同步的层状记录和靶向膜片钳记录。综合这些方法，研究人员能够在从突触到局部神经网络的多个层面，检测挥发性麻醉剂引起的多种可观察电生理反应特性的变化。

<table><tbody><tr><td>2.5倍广视野物镜</td><td>Olympus</td><td>MPLFLN2.5X</td><td></td></tr><tr><td>40倍水浸物镜</td><td>奥林巴斯</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>95% O2/5% CO2 混合气体</td><td>Airgas</td><td>Z02OX95R2003045</td><td></td></tr><tr><td>A16 探针</td><td>NeuroNexus</td><td>A16x1-2mm-100-177-A16</td><td>16通道探针</td></tr><tr><td>AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP</td><td>Karl Deisseroth 实验室，UNC 病毒载体中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻醉气体监测仪（POET II）</td><td>Criticare</td><td>602-3A</td><td></td></tr><tr><td>ATP，镁盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187</td><td>细胞内液</td></tr><tr><td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td><td>杰克逊实验室</td><td>007914</td><td>Cre依赖性tdTomato小鼠</td></tr><tr><td>B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J</td><td>杰克逊实验室</td><td>008069</td><td>PV-Cre 小鼠</td></tr><tr><td>摇摆舞者摇床</td><td>托马斯科学公司</td><td>1210H86-TS</td><td>用于密封气体袋的平衡</td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>通用品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>漂白剂</td><td>通用品牌</td><td></td><td>用于氯化银镀层膜片钳电极</td></tr><tr><td>布比卡因</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl2）</td><td>点科学</td><td>DSC20010</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>毛细玻璃管（膜片钳记录）</td><td>King Precision Glass, Inc.</td><td>KG-33</td><td>硼硅酸盐玻璃管，内径：1.1 mm，外径：1.7 mm，长度：90.0 mm</td></tr><tr><td>毛细玻璃管（病毒注射）</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>3.5&quot;</td></tr><tr><td>控制初级显微操作仪</td><td>Luigs 和 Neumann</td><td>SM8</td><td>用于控制初级显微操作仪</td></tr><tr><td>机械臂控制与移位台操作</td><td>Luigs and Neumann</td><td>SM7</td><td>用于多通道电极和移位台的控制</td></tr><tr><td>Digidata 1440A + Clampex 10</td><td>Molecular Devices</td><td>1440A</td><td>数位板和软件</td></tr><tr><td>E-3603 管路</td><td>Fisher Scientific</td><td>14171208</td><td>用于向孵育室输送95% O2/5% CO2气体混合物 + 膜片钳实验中施加压力</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>点科学</td><td>DSE57060</td><td>细胞内液</td></tr><tr><td>ERP-27 脑电图参考/连接面板</td><td>Neuralynx</td><td>已退休</td><td></td></tr><tr><td>填充针</td><td>World Precision Instruments</td><td>50821912</td><td>用于填充膜片钳移液管</td></tr><tr><td>用于成像EYFP的滤光片组</td><td>Olympus</td><td>U-MRFPHQ</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>09801E</td><td>制备组织块时将切片模板覆盖于其上</td></tr><tr><td>弗拉明/布朗微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>2.5x2.5 盒式灯丝</td></tr><tr><td>气体分散管</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3953312C</td><td></td></tr><tr><td>玻璃注射器（100 mL）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z314390</td><td>用于填充密封气体袋</td></tr><tr><td>葡糖酸钾（K-gluconate）</td><td>点科学</td><td>DSG37020</td><td>细胞内液</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>点科学</td><td>DSG32040</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>GTP，钠盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8877</td><td>细胞内液</td></tr><tr><td>头级探针适配器</td><td>NeuroNexus</td><td>A16-OM16</td><td>连接16通道探针与前置放大器输入端的适配器</td></tr><tr><td>止血钳</td><td>VWR International</td><td>76192-096</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Dot Scientific</td><td>DSH75030</td><td>人工脑脊液，细胞内液</td></tr><tr><td>HS-16 头戴式装置</td><td>Neuralynx</td><td>已退休</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇（70%）</td><td>VWR International</td><td>101223-746</td><td></td></tr><tr><td>初级显微操作仪</td><td>Luigs and Neumann</td><td>210-100 000 0090-R</td><td>用于膜片钳电极的操作</td></tr><tr><td>LED光源控制模块</td><td>Mightex</td><td>BLS-PL02_US</td><td>光遗传学光源控制</td></tr><tr><td>利多卡因</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lynx-8 放大器</td><td>Neuralynx</td><td>已退休</td><td></td></tr><tr><td>Lynx-8 电源供应器</td><td>Neuralynx</td><td>已退休</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁（MgSO₄）</td><td>点科学</td><td>DSM24300</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>mCherry，德克萨斯红滤光片组</td><td>色度</td><td>49008</td><td>用于成像 tdTomato 荧光报告基因</td></tr><tr><td>美洛昔康</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量移液器架</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9044962</td><td></td></tr><tr><td>微量注射泵</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-4</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>通用品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700A</td><td>Molecular Devices/Axon Instruments</td><td>700A</td><td>放大器</td></tr><tr><td>氮气（用于气浮台）</td><td>Airgas</td><td>NI200</td><td></td></tr><tr><td>尼龙网</td><td>Fisher Scientific</td><td>501460083</td><td>用压扁的铂丝弯成马蹄形，将组织片置于其上进行记录</td></tr><tr><td>尼龙，取自连裤袜</td><td>通用品牌</td><td></td><td>用于在孵育室中制作切片平台的小块材料，以及用于制作铂金丝网的单根纤维</td></tr><tr><td>眼用软膏</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1697520</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Dot Scientific</td><td>307</td><td>用于将组织转移至实验装置</td></tr><tr><td>铂丝</td><td>VWR International</td><td>BT124000</td><td>2 cm，压平，制成铂金梳状电极</td></tr><tr><td>Polygon400</td><td>Mightex</td><td>DSI-E-0470-0617-000</td><td>光遗传学光照递送系统，配备 PolyScan2 软件</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>点科学</td><td>DSP41000</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH2PO4）</td><td>点科学</td><td>DSP41200</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>蓝宝石刀片（用于振动切片机）</td><td>VWR International</td><td>100492-502</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-361445</td><td></td></tr><tr><td>密封气体袋</td><td>Fisher Scientific</td><td>109236</td><td></td></tr><tr><td>显微镜用移位台</td><td>Luigs 和 Neumann</td><td>380FMU</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（HCO₃⁻）</td><td>Dot Scientific</td><td>DSS22060</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>点科学</td><td>DSS23020</td><td>人工脑脊液，细胞内液</td></tr><tr><td>Ssttm2.1(cre)Zjh/J（SOM-IRES-Cre）</td><td>杰克逊实验室</td><td>013044</td><td>SOM-Cre 小鼠</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Kopf</td><td>Model 902</td><td>双通道小动物</td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>订书钉</td><td>886833</td><td>在切片制备过程中将组织块固定于样本台</td></tr><tr><td>外科钻孔器</td><td>RAM 产品公司</td><td>数字微扭矩</td><td>Microtorque II</td></tr><tr><td>带鲁尔锁头的注射器（1 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>309628</td><td>用于膜片钳实验中施加压力</td></tr><tr><td>带滑动接头的注射器（1 mL）</td><td>WW Grainger, Inc.</td><td>19G384</td><td>用于填充膜片钳移液管</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>VWR International</td><td>66064-414</td><td></td></tr><tr><td>直立显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>徕卡生物系统公司</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Wypall 擦拭布</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-042-427</td><td></td></tr></tbody></table>

脑片中传入通路的光遗传学激活及挥发性麻醉剂对反应的调节

Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics

麻醉剂部分通过作用于丘脑皮层环路来影响意识。然而，挥发性麻醉剂对这些环路中不同细胞和网络组分的影响程度尚不明确。离体脑片为研究者提供了一种手段，可用于探究复杂网络中的特定组分，并解析挥发性麻醉剂对诱发电位影响的潜在机制。为了在脑片中分离出可能具有细胞类型和通路特异性的药物效应，研究者必须能够独立激活传入纤维通路，识别不重叠的细胞群体，并将挥发性麻醉剂以水溶液形式施加于组织。本实验方案描述了在离体脑片中测量新皮层两种独立传入通路光遗传学诱发电位的方法。通过记录细胞外反应来评估网络活动，并对表达生长抑素和小清蛋白的中间神经元进行靶向全细胞膜片钳记录。同时介绍了通过人工脑脊液递送生理相关浓度的异氟烷，以调控细胞和网络反应的方法。

本方案中所述步骤的时间线见图1。来自高级皮层区域或非初级丘脑核团的皮层输入在非初级视觉皮层的第1层具有部分重叠的终末投射区24。为了分离独立的丘脑-皮层或皮层-皮层传入通路，将含有ChR2及eYFP荧光报告基因的病毒载体分别注射至Po或Cg区域。位于注射范围内的细胞摄取该病毒载体，并在2-4周后于胞体及投射轴突中表达非特异性阳离子通道ChR2和报告基因（图2A）。随后采集冠状切片。通过使用适当的滤光镜组，对表达病毒载体的轴突进行成像（图2B）。利用ChR2激活轴突终末，可在无需胞体连接的情况下实现对传入纤维的激活。
本研究所使用的动物为SOM-tdTomato或PV-tdTomato杂交小鼠，其分别在表达生长抑素（SOM+）或小清蛋白（PV+）的中间神经元中表达荧光报告蛋白tdTomato。在视觉引导下，通过启用相应的滤光镜组（第1C层），对第2/3层中的S...

离体脑片可用于研究挥发性麻醉剂对传入刺激诱发反应的影响。利用光遗传学技术可独立激活丘脑皮层和皮层间传入纤维，作用于非初级新皮层，并通过异氟烷调节突触和神经网络反应。

麻醉剂部分通过作用于丘脑皮层环路来影响意识。然而，挥发性麻醉剂对……的影响程度

本方案可用于研究挥发性麻醉剂是否对某些突触的影响大于其他突触，判断其效应是否具有细胞类型或信号通路特异性，并确定在群体水平上产生的效应。该技术的主要优势在于能够特异性地评估挥发性麻醉剂的作用效果。我们可在同时检测群体活性的过程中，靶向特定的信号通路和细胞类型。首先准备组织块以进行切片。轻轻将脑组织从颅腔中取出，放置在滤纸上。沿脑的矢状面平行于正中线进行切割，并将组织块置于该矢状面上。将滤纸移至封闭模板上方，使脑组织与模板轮廓对齐。根据模板上的线条指示，在冠状面进行平行切割；必要时滴加少量切片用 aCSF，以保持滤纸湿润。将组织块置于 4 °C 的切片用 aCSF 中，并在冰冷的样品台表面涂上少量胶水。将组织块从切片用 aCSF 中取出，用吸水纸的一角吸去多余的溶液。将组织块的后冠状面粘附到样品台上，脑的背侧朝向蓝宝石刀片。采集500微米厚的冠状脑切片，并将其置于34摄氏度的切片用aCSF中尼龙网膜上。让容器恢复至室温。为制备含有溶解异氟烷的实验用 aCSF 袋，向一个空的聚四氟乙烯气体袋中加入 600 毫升实验用 aCSF 和 600 毫升 95% 氧气与 5% 二氧化碳的混合气体。将此袋标记为对照组。向另一个聚四氟乙烯气体袋中加入 300 毫升实验用 aCSF，并将此袋标记为异氟烷。按照文稿中的说明继续准备异氟烷气体袋。通过将波形随机分配至每个配置文件来设置光刺激模拟程序。每个配置了特定波形的轮廓对应一个来自数字TTL输入的触发脉冲或一次试验。完成后，保存轮廓序列。将多通道探针放置于离体脑组织切片时，以每分钟三至六毫升的速度灌注通入氧气的实验用aCSF，并将包含目标区域的脑切片转移至显微镜灌流室中的网格支架上。用铂金丝网固定脑片。旋转网格，使多通道探针远端电极触点的连线大致与剥离面垂直。在宽场照明和显微操作器的精细控制下，将多通道探针缓慢下降至脑片表面。选择合适的滤光立方体，以观察皮层传入纤维轴突末梢中表达的荧光报告蛋白。如有必要，旋转脑片以更精确地将探针与剥离面对齐。将探针置于脑片平面上方，沿x轴方向距离最终目标位置200微米处，至少留出一个通道位于记录组织区域之外。沿脑片的长轴缓慢插入探针。为尽量减少对组织的损伤，仅将探针推进至尖端在组织表面下方刚好可见的程度。将实验用 aCSF 源切换至袋装对照溶液，并识别荧光标记的细胞以进行靶向膜片钳记录。将孔径调节至最小直径，并启用高倍水浸物镜，注意避免多通道探针与物镜镜头接触。调节至组织清晰对焦。将光线居中对准多通道探针附近但不重叠的组织区域。启用适当的滤光片组，以实现对表达Cre依赖性荧光标记的细胞进行成像。抬高物镜，为降低膜片钳电极留出充足空间。用内液填充膜片钳电极，并将其安装到电极夹持器上。使用1毫升注射器施加相当于约0.1毫升空气的正压。在视觉引导下将膜片电极移入溶液中，并使电极尖端进入视野焦点，对目标细胞进行全细胞记录。本方案中使用的动物在其生长抑素或钙结合蛋白parvalbumin阳性的中间神经元中表达荧光报告蛋白tdTomato。在荧光显微镜下使用适当的滤光镜组进行视觉引导，对这些中间神经元实施了膜片钳记录。中间神经元在受到一串四个、每个持续两毫秒的光脉冲刺激后，产生了突触后电位。同时记录了局部场电位。通过局部场电位提取电流源密度和多单位放电活动。从电流源密度中提取的电流汇的幅度随光强度的增加而增大。采用三参数非线性逻辑方程对数据进行拟合，以实现不同通路间的比较。突触后电位的幅度也随电流汇聚幅度的增加而增大。在对照、异氟烷和恢复条件下，测量了丘脑皮层和皮层-皮层输入的突触反应。在异氟烷条件下，生长抑素和皮层-皮层刺激引起的突触后反应以及诱发电流汇聚均受到抑制。在制备脑切片时，维持组织的活性至关重要。在整个切片过程中，必须保持组织低温，操作迅速且不损伤组织。多通道胞外记录可通过多种方式进行后期处理。例如，对宽带信号进行高通滤波可分离出群体放电活动，而电流源密度计算则能突出突触活动。结合这些技术，我们得以探究麻醉剂对皮层环路中特定独立组分的影响，从而深入理解体内意识丧失的潜在机制。

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脑切片中传入通路的光遗传学激活和挥发性麻醉剂对反应的调节

本视频介绍了一种同时对含有神经元特异性荧光蛋白的转基因脑片进行成像和记录电活动的方法。该方法包括将脑片置于灌流室中，并用充氧的人工脑脊液维持；使用光源激发荧光标记的细胞；并通过多通道探针和膜片钳技术记录电信号。...

脑切片中神经元细胞的同步光学与电生理监测

本视频演示了一种利用小鼠急性杏仁核脑片分析内侧前额叶皮层（mPFC）与杏仁核神经元之间突触连接的方法。这些小鼠的mPFC神经元表达与荧光蛋白融合的光敏通道蛋白。在光照激活下，光敏通道蛋白可促进离子内流并引发mPFC神经元产生动作电位。随后，mPFC神经元释放神经递质，与杏仁核突触后神经元上的受体结合，触发突触后电流，通过记录这些电流可可视化mPFC-杏仁核之间的连接性。...

杏仁核脑切片中神经元通路的可视化与定位

本视频展示了通过光遗传学刺激内侧前额叶皮层（mPFC）轴突并记录外侧内嗅皮层（LEC）锥体神经元的反应，来研究外侧内嗅皮层（LEC）突触效能的实验方法。该方法结合膜片钳记录与光刺激诱导的突触激活，用于研究突触可塑性。...

光遗传学刺激与大鼠脑片突触事件的电生理记录

我们描述了一种利用光遗传学方法在体外光刺激神经元群体，以表征前脑环路功能拓扑结构和突触特性的方法 in...

光遗传靶向前脑环路的激光扫描光刺激

光遗传学方法被广泛用于操控神经元活动并评估其对脑功能的影响。本文概述了一种技术方案，该方案 在……之后 体内 光敏激活蛋白Channelrhodopsin的表达，使得能够 离体...

离体 光遗传学解析脑片中的恐惧环路

我们展示了如何利用微电极阵列在啮齿类动物脑片上记录并进行电调控由4-氨基吡啶诱导的癫痫样活动。定制的记录室可在长时间的实验过程中维持组织的活性。通过定制的图形用户界面实现电极的实时映射以及刺激电对的选择。...

使用微电极阵列记录和调控啮齿类动物脑片中的癫痫样活动

本方案描述了一组利用离体脑片中的光遗传学刺激，鉴定来自远端脑区的长程输入的细胞类型特异性功能连接的方法。...

在体小鼠脑切片中长程投射通路的光遗传学刺激：颅内立体定位注射方法

通过光遗传学手段操控特定的神经元群体或脑区，可在自由活动的动物中以高时空分辨率调控其行为。结合不同类型的光遗传学工具与慢性植入的光纤，可实现多种神经调控及行为学检测。...

光遗传学操控神经元活动以调节自由活动小鼠的行为

本方案展示了一种追踪腹侧被盖区（VTA）谷氨酸能投射至海马体的简单方法。通过光刺激VTA谷氨酸能神经元并结合CA1区记录，以展示VTA谷氨酸能末梢如何在体内调节CA1区假定锥体神经元的放电频率。...

腹侧被盖区谷氨酸能神经末梢在海马中的体内解剖与功能联合示踪

目前在非人灵长类动物中实施的光遗传学技术需要向大脑内注射病毒载体。理想的注射方法应具有可靠性，并且对于许多应用而言，能够靶向任意深度的单个位点，且这些位点可在死后组织学分析中被清晰、明确地识别。本文介绍了一种具备上述特性的注射方法。...

在麻醉及清醒非人灵长类动物脑内进行光遗传学AAV载体注射

本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。...

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

学习利用光遗传学技术激活离体脑切片中的丘脑皮层和皮层皮层传入通路，研究异氟烷等挥发性麻醉剂对突触反应和神经元网络活动的调节作用。该方法可精确靶向特定细胞类型，为理解麻醉机制提供重要依据。

脑片中传入通路的光遗传学激活及挥发性麻醉剂对反应的调节

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