Name: C. elegans 中大型外层囊中体内神经聚合和有机体挤出评分的定量方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 了解利用C. elegans进行神经元外囊体生成定量评分的活体成像方法。该技术通过荧光显微镜观察神经聚集体和细胞器挤出过程，为研究神经退行性疾病中的细胞废物清除机制提供可重复的分析平台。

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我们感谢以下 NIH 基金项目：R01AG047101 和 R37AG56510。&#160;Driscoll 实验室和 Grant 实验室的成员为所述实验方案的开发与精细优化做出了广泛贡献，开展了严谨的实验并保持了密切的沟通。

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</ol>

对的表征 体内 以大型细胞外囊泡（exopher）形式清除聚集体和细胞器的分子机制研究尚处于起步阶段。关于被排出货物的指定、这些货物在细胞内的极性聚集、生成exopher的决策调控、介导外排过程的分子机器，以及exopher与邻近细胞中降解机制的相互作用等问题，仍有待阐明。此外， 体内 能够传递包括钙离子、聚集体和线粒体在内的生物物质的管状连接结构的可视化，其本身即为一个引人入胜且尚未得到充分研究的生物学现象。为何某些细胞比其他细胞更容易产生外泌体样结构（exopher）的问题目前仍未解决，但可通过本实验方案中所述的方法从遗传学角度逐步开展研究。
本方案详细描述了实现可重复的外泌体（exopher）产生评分的方法，重点关注如何区分外泌体与邻近细胞的胞体、选择适当的分析时间以捕捉外泌体产生的高峰期，以及严格控制培养条件以消除可能影响外泌体水平的非预期应激因素。可通过量化早期出现的大型外泌体，或周围表皮组织中“星夜”样弥散结构的存在，作为外泌体产生的证据。通常情况下，在基础条件下表达mCherry的神经元中，特定类型神经元产生外泌体的比例为5-25%。通过可控地引入应激条件，可显著提高外泌体的产生率，使高达90%的神经元产生外突结构，这一策略特别适用于筛选调控外泌体形成的遗传或药物因子。
在人类神经退行性疾病中，大分子聚集体可从病变神经元转移至邻近细胞，从而促进病理学改变的扩散。外排囊泡（exopher）机制可能通过一种在不同物种间保守的聚集体外排机制发挥作用。阐明该机制 体内 能够增强该过程效率（即更有效的蛋白质稳态调控）或阻断该过程的分子，可被用于指导设计新型策略，以应对多种神经退行性疾病。因此，本文所述方案可用于经典的遗传诱变筛选、全基因组范围的RNAi筛选（通过系统性敲低基因以鉴定增强因子和抑制因子），或用于药物干预研究，以鉴定该过程的候选药理学调控分子。该方法原理简单，但操作较为繁琐。外泌体体积较大，可直接使用高倍解剖显微镜进行观察。然而， 秀丽隐杆线虫 神经元相对较小，观察其细胞器或细胞膜需要高倍率的共聚焦图像，这一过程较为缓慢。提高通量的可选方案包括采用多孔板格式的高内涵成像方法。
采用标准化方法对出泡体进行评分，应作为系统性遗传学解析神经元如何组织并清除细胞碎片这一过程的基础。

聚集体和功能障碍线粒体的神经毒性挑战长期以来被认为属于细胞内在问题，但近年来研究逐渐明确，起源于一个神经元的错误折叠人类疾病相关蛋白亦可扩散至邻近细胞，促进病理过程1。同样，哺乳动物的线粒体可从其原始生成细胞中释放，用于跨细胞降解2，或用于挽救受损邻近细胞中的线粒体群体3。通常观察到各种尺寸的囊泡可将细胞物质转移至邻近细胞或周围液体环境中4。某些排出的囊泡大小接近平均神经元胞体（平均触觉神经元胞体约 6 µm），足以容纳大型聚集体和细胞器。
一种能够携带蛋白质聚集体和细胞器的大囊泡外排现象的显著例子发生在表达高拷贝数报告基因构建体的 C. elegans 触觉感受神经元中，该构建体编码一种有害的、易于聚集且抗降解的 mCherry5。这些来自触觉神经元的外排结构被称为“外泌体”（exophers），平均直径约为 4 µm，可选择性地包裹 mCherry 或其他聚集体，并被直接递送至邻近的下皮层组织，而下皮层通常包绕着触觉感受神经元。下皮层会尝试通过溶酶体途径进行降解，但某些不可消化的内容物（如 mCherry 聚集体）可被下皮层再次外排至动物体内充满液体的假体腔中，随后 mCherry 可被远端的清道夫细胞（称为体腔细胞，coelomocytes）摄取并长期储存（图 1，图 2）5。
这些大型挤出的外吐小体囊泡被触觉感受器的质膜包裹，离开细胞后可包含聚集的人类疾病相关蛋白、线粒体以及溶酶体。外吐小体的生成过程似乎涉及对潜在毒性物质的分选（例如，易于聚集的表达型mCherry会被分隔出来，而可溶性、无害的蛋白如GFP则主要保留在神经元胞体中）。通过这种方式，神经元实现了对威胁性物质的定向排出5。蛋白稳态的挑战，例如由&#160;自噬基因敲低、MG132介导的蛋白酶体抑制，或转基因表达与人类疾病相关的蛋白（如亨廷顿病相关的多聚谷氨酰胺扩增片段Q128，或阿尔茨海默病相关的Aβ1-42片段）所引起的压力，均可增加产生外吐小体的神经元数量5。
由于外泌体（exophers）是最近才被记录的，其生物学特性值得描述。外泌体最初发现于，并且研究最为深入的是在 秀丽隐杆线虫 触觉感受神经元。共有六种 秀丽隐杆线虫 细胞体分布在全身各处的机械感觉触觉神经元（图3A）因其超微结构具有独特的15条原纤维微管而被称为微管细胞。触觉感受神经元包括前端的AVM（前腹侧微管神经元）、ALMR和ALML（前外侧微管神经元右侧和左侧）、位置更靠中央的PVM（后腹侧微管神经元），以及尾部的后侧PLMR和PLML（后外侧微管神经元右侧和左侧）。有趣的是，尽管这六种触觉感受神经元表达相同的有害转基因，但其产生外泌体（exophers）的速率却各不相同。图3C在六种机械感知触觉感受神经元中，ALMR神经元发生外泌体生成的频率高于其他触觉神经元。因此，通常通过聚焦ALMR来定量触觉神经元中外泌体的数量。
排泡生成是一个动态过程，通常始于神经元胞浆的肿胀（图1A-B）。细胞内容物、细胞器或蛋白质聚集体被聚集到神经元胞体的一侧，最常见的是向ALMR神经元的后端（远离突起的神经突方向）聚集，形成排泡前结构域（PED）（图1B）。当PED开始向外突出时，可观察到早期突起，形成一个明显的突出芽状结构。当排泡前结构域的最大直径比胞体与排泡连接处颈部的缩窄直径大约⅓时，定义为晚期芽状结构（图1C）。&#160;排泡可以从胞体向几乎任意方向释放，但大多数排泡从细胞体的后部排出，并保持与起源胞体大致相同的焦平面。
随着出芽颈部收缩成一条细丝，外泌体可从起源的胞体移开。外泌体可通过此细丝与胞体保持连接（图1D，箭头），之后可能完全脱离。细胞内容物如钙离子、蛋白聚集体和线粒体可通过该细丝转运至相连的外泌体5，尽管大部分被挤出的物质是在大规模出芽过程中进入外泌体腔室的。当不再有可见的连接管或细丝，且外泌体与供体胞体完全分离时，即被视为成熟外泌体（图1E）。
由外泌体产生 秀丽隐杆线虫 触觉神经元立即接触到其周围的表皮组织。通常情况下，exopher囊泡似乎在表皮组织内向后部尾侧移动，在exopher内容物被靶向降解之前，其位置可能已距离胞体较远（例如，可达约100 µm）图1F））。荧光外泌体囊泡在表皮下层分裂成许多更小的囊泡，呈现出被称为“星夜”（starry night）的形态图1G 和 图2）。在“星夜”阶段，与最初的单一外排泡相比，可观察到点状荧光物质分散在表皮合胞体中，形成许多更小的荧光点。“星夜”在低倍镜下呈点状，高倍镜下则表现为点状和/或网状结构，位于表皮层内。“星夜”的荧光信号通常比外排泡及神经元表达的荧光更弱。图2B-C）。mCherry 分散至多个点状囊泡中，被认为涉及吞噬体成熟及与表皮下细胞的内体/溶酶体网络融合。部分外排小体内容物可能在表皮下溶酶体网络中被降解，但一些抗降解的残留物（如 mCherry 聚集体）则被排出表皮下组织进入假体腔——一种可容纳细胞碎片的液体腔室。随后，这些荧光物质被远处的清道细胞——即体腔细胞——所摄取（图2C），可浓缩、储存并再次尝试降解 mCherry。
聚集体的挤压与转移现象在不同门类生物中具有保守性，已在C. elegans5,6,7和D. melanogaster8,9等遗传模型以及多种哺乳动物模型中被报道。在哺乳动物细胞中也观察到了类似外泌体（exopher-like）的突出结构10，这一发现提示聚集体和细胞器排出可能由保守的机制所介导。因此，外泌体的生成可能是一种保守的细胞碎片清除机制，构成了神经元蛋白质稳态和线粒体质量控制的一个基本但此前未被认识的分支；当该过程失衡时，可能主动促进神经退行性疾病的发生。未来的研究仍需明确参与碎片识别与分选、向特定亚细胞区域转运、挤压排出、连接胞体与晚期外泌体的管状结构的形成/断裂，以及由邻近细胞识别并远程降解大体积挤出囊泡的相关分子。利用线虫和果蝇模型开展的研究将对阐明聚集体和细胞器收集与转移的机制至关重要，这些模型所提供的无偏倚遗传学方法和强大的细胞生物学工具，有助于在生理背景下鉴定参与该过程的分子。 
解析外泌体生物学机制的关键第一步是制定可重复的实验方案 体内 外泌体定量。该 秀丽隐杆线虫 该模型在此类研究中具有独特优势，因其身体透明，当外泌体携带荧光标记的蛋白质或细胞器时，可被直接观察到。已有研究报道，外泌体可由 秀丽隐杆线虫 多巴胺能神经元 PDE 和 CEP，ASE 和 ASER 感觉神经元，以及染料填充的纤毛神经元5由于触觉感受神经元产生的外体（exopher）特征最为明确，本文重点介绍利用触觉神经元进行外体分析的方法。然而，该基本方法也可适用于检测和量化任何细胞产生的外体。检测和定量由不同细胞产生的外体的实验方案 秀丽隐杆线虫 表达mCherry蛋白的转基因触觉感受器神经元被标示出来，重点在于可监测的运输 cargo 及评分时的时间限制。本文阐述了相关研究方法 体内 外小体的鉴定，以及调控外小体生成的环境与遗传条件的定量分析。实验方案强调，为确定基础水平的外小体生成并实现不同基因型间的比较，必须严格维持恒定的非应激条件。

<table><tbody><tr><td>95B 科学级 CMOS 相机</td><td>Photometrics Prime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;mu;L 低吸附吸头</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Appleton Woods</td><td>CC214</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L 低吸附吸头</td><td>Sarstedt</td><td>70.1130.105</td><td></td></tr><tr><td>13% 次氯酸钠</td><td>Acros Organics</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>2 L 锥形瓶</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>FLA4036</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 血清移液管</td><td>Appleton Woods</td><td>CC216</td><td></td></tr><tr><td>300 &amp;mu;L 低吸附吸头</td><td>Sarstedt</td><td>70.765.105</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 血清移液管</td><td>Appleton Woods</td><td>CC117</td><td></td></tr><tr><td>5-氟-2'-脱氧尿苷 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497.ME</td><td></td></tr><tr><td>9 cm 无菌培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>11309283</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Vwr</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans 野生型菌株</td><td>由 CGC 提供</td><td>N2</td><td>C. elegans 菌株</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Acros</td><td>110190250</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>E. coli OP50 菌株</td><td>由 CGC 提供</td><td>Op50</td><td>E. coli 菌株</td></tr><tr><td>FBS10 标准显微镜</td><td>Meyer Instruments</td><td>KSC 410-1-100-1</td><td>FBS10 标准型，带培养皿底座、100/100 三目镜筒和翻转变焦功能</td></tr><tr><td>270 mm 玻璃移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>FB50255</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>75004515</td><td></td></tr><tr><td>接种环</td><td>Fisher Scientific</td><td>11821741</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基胶囊</td><td>MP Biomedicals</td><td>3002-031</td><td></td></tr><tr><td>LDI &amp;ndash; 激光二极管照明器</td><td>89 North</td><td></td><td></td></tr><tr><td>左旋咪唑</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16595-80-5</td><td></td></tr><tr><td>M4 多通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td>4982000012</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Multitron Standard 摇床培养箱</td><td>Infors HT</td><td>INFO28573</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 1 L 离心瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120-1000</td><td></td></tr><tr><td>P10 移液器</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>P1000 移液器</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 移液器</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>pipeteboy 2</td><td>VWR</td><td>612-0927</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯微珠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00131491</td><td></td></tr><tr><td>RC5C plus 落地式离心机</td><td>Sorvall</td><td>9900884</td><td></td></tr><tr><td>可重复使用带环细胞学载玻片</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22037242</td><td></td></tr><tr><td>SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP]</td><td>Driscoll 实验室定制</td><td></td><td>在触觉神经元中表达 GFP</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13422</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/4880/53</td><td></td></tr><tr><td>Tactrol 2 自动灭菌器</td><td>Priorclave</td><td></td><td></td></tr><tr><td>吐温-X</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28313</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>X-Light V2 转盘共聚焦成像系统</td><td>CrestOptics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]</td><td>Driscoll 实验室定制</td><td></td><td>在触觉神经元中表达 mCherry</td></tr><tr><td>ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]</td><td>Driscoll 实验室定制</td><td></td><td>在触觉神经元中表达 Q128</td></tr><tr><td>ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]</td><td>Driscoll 实验室定制</td><td></td><td>在触觉神经元中表达 mitoROGFP</td></tr><tr><td>ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]</td><td>Driscoll 实验室定制</td><td></td><td>在触觉神经元中表达自噬标志物</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

定量评分方法 体内 大型外吐囊泡中的神经元聚集体和细胞器外排 秀丽隐杆线虫

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

错误折叠蛋白的毒性及线粒体功能障碍是促进跨物种年龄相关性神经元功能衰退和神经退行性疾病的关键因素。尽管这些神经毒性挑战长期以来被认为属于细胞内在特性，但现有大量证据表明，起源于一个神经元的错误折叠人类疾病蛋白可出现在邻近细胞中，这一现象被认为可能促进人类神经退行性疾病的病理扩散。
C. elegans 成虫神经元在表达聚集性蛋白时，能够释放出较大的（约 4 µm）由膜包被的囊泡，这些囊泡可能包含聚集的蛋白、线粒体和溶酶体。这些大型囊泡被称为“外吐体”（exophers），与外泌体（exosomes）不同（外泌体约小 100 倍，且具有不同的生物发生机制）。通过外吐体排出细胞碎片可能是一种保守的机制，代表了神经元蛋白质稳态和线粒体质量控制的一个基本但此前未被认识的分支，与人类神经退行性疾病中蛋白聚集物扩散的过程相关。
尽管胞外小泡（exopher）的研究主要集中于在触觉神经元中表达高拷贝数转基因mCherry的动物，但这些实验方案同样适用于研究多种类型神经元中荧光标记的细胞器或其他目的蛋白的胞外小泡形成过程（exophergenesis）。
本文描述了秀丽隐杆线虫（C. elegans）外泌体的物理特征、检测策略、鉴定标准、定量的最佳时机，以及可控制影响外泌体产生水平的应激因素的动物培养方案。上述方案的详细信息共同为不同实验室开展外泌体的定量分析建立了标准化参考。本文件旨在为致力于研究外泌体产生机制及其被邻近或远端细胞响应机制的实验室提供领域内的参考资源。

本方案描述了检测和定量秀丽隐杆线虫（C. elegans）细胞以膜结合型胞外小体形式释放的大分子聚集体和/或细胞器外排物（约4 µm）的方法。我们介绍了为深入研究这种碎片排出机制所需使用的品系、培养条件、评分标准、实验时间安排以及显微镜观察的相关注意事项。

错误折叠蛋白的毒性与线粒体功能障碍是促进年龄相关性神经元功能衰退的关键因素，以及……

我们通过一种称为“外泌体生成”（exophergenesis）的过程，表征神经元体内排出聚集体和细胞器的机制。这一生物学过程尚不明确，但可能与神经退行性疾病病理的扩散相关。这些方法对于实现对外泌神经元外泌体（exophers）的可重复评分至关重要，并为解析细胞垃圾通过神经元向邻近细胞转移而被清除的机制提供了平台。明确神经元在体内排出聚集体的机制，可能切实影响新型治疗策略的设计，从而有助于人类神经退行性疾病的治疗。在基础条件下，将相同生物学年龄的秀丽隐杆线虫（C. Elegans）饲养于20摄氏度的恒定温度环境中。为进行细胞内动态及出泡生成（exophergenesis）特征的活体成像，将最多20只线虫置于载玻片上的琼脂糖垫上，并固定线虫。小心地将盖玻片覆盖在麻痹的线虫上，然后将载玻片放置于共聚焦荧光显微镜的载物台上。使用10至40倍物镜在明场下确定所需的Z平面，记录线虫的位置、头尾方向以及阴门位置，这些特征将作为后续神经元和外泌体识别的解剖标志。保持在同一Z平面，切换至10至40倍宽场荧光观察模式，选择相应的胞质报告基因，并沿Z轴调节以观察动物的深度及焦平面内的荧光表达情况。头部可见荧光标记的神经环，而较尖的尾部则包含一至两个清晰可见的后侧触觉神经元胞体。使用63倍物镜进行更高倍数的观察，有助于识别神经环、神经元突起和胞体。首先应识别位于动物头部的神经环以及侧向的神经元突起。为此，可从线虫头部开始，沿Z轴缓慢调节焦距，以确定神经元突起附着处的神经环所在平面。一旦确定了神经环，在荧光视野下沿其连接的神经突起向后外侧追踪至阴门位置，即可观察到胞体。当圆形的胞体或多个胞体处于清晰对焦状态时，重要的是要识别出附近所有的神经元。在触觉神经元的鉴定过程中，首先寻找ALML、ALMR和AVM的胞体，这些应是荧光信号最强的部分，且其神经突起末端具有明显的圆形细胞体作为标志。一旦找到最清晰对焦的神经元胞体，可利用AVM细胞（一种腹侧细胞）来辅助确定方位。如果AVM神经元与ALM处于同一焦平面，则表明线虫侧卧，此时侧向的神经元为ALMR。如果AVM神经元与待判定的ALM不在同一焦平面，则最接近焦平面的触觉神经元为ALML神经元。同样重要的是识别PVM神经元，这是一种位于尾部附近的腹侧触觉神经元。PVM的焦平面可用来判断前部触觉神经元是ALML还是ALMR。如果待确定的ALM与PVM位于同一焦平面，则所观察到的触觉神经元即为ALML神经元。在确定并标记最清晰对焦的ALM后，重要的是要确定靠近目标区域以及所有Z平面中其他胞体的位置，以避免将其误认为外泌体。一旦找到目标触觉神经元ALMR或ALML，需检查该神经元是否存在较大的突出外泌体结构域，其大小应足以被视为芽状外泌体，即至少达到起源胞体大小的五分之一。若未观察到芽状或外泌体结构域，则需进一步检查神经元胞体上是否附有从胞体延伸出的细丝状结构。附着的外泌体倾向于位于更靠近起源细胞体的位置，并且处于相似的Z平面。要识别未附着的外泌体，可寻找集中的被排出的荧光蛋白，这些荧光蛋白通常比细胞体更亮。尽管在此图中显示，但存在一个较大的外泌体。单个胞体可能产生一个以上的荧光实体。在不同焦平面以及远离胞体起源位置的侧向区域寻找未连接的胞外体。胞外体通常从神经元突起的后侧方向远离胞体突出。检查是否存在未被正确定位或识别为神经元胞体的大型球状结构。尽管外泌体（exopher）通常为球形结构，但随着时间推移可能降解，形态变得不规则。注意寻找“星夜现象”（starry night events）以及多个外泌体事件同时出现的情况。为避免将错位或离焦的细胞体误认为外泌体，关键是在观察开始时识别所有邻近的细胞体，即使是在焦外的细胞体也需识别。可以观察到拉长或呈尖状的细胞体，但若无明显收缩位点的突起不应记为外泌体。在外泌体事件定量时，应排除那些未达到细胞体大小五分之一的小型清晰出芽结构。尽管成熟的神经突在发育过程中可显著延伸，且荧光蛋白可能迁移至这些结构的远端，但不应将神经突的延伸视为外泌体（exopher）。为识别非外泌体的荧光结构，务必排除任何自发荧光，因其在宽场荧光显微镜下可能被误认为“星夜”样囊泡碎片。为排除胚胎来源的荧光信号，需在荧光与明场照明之间切换，并检查信号是否与子宫内的卵相关联。本表格总结了已用于监测外吐体（exopher）生成的不同触觉神经元表达的荧光报告系统。已知在外吐体中被排出的货物包括聚集体（如Q128，即人亨廷顿蛋白扩展多聚谷氨酰胺重复序列的融合蛋白）、由溶酶体相关膜蛋白标记的GFP标记溶酶体，以及由基质定位GFP标记的线粒体。细胞质中的GFP不会被强烈排出，而是在胞体中优先保留，尽管GFP仍可用于弱信号可视化外吐体。通常情况下，在基础条件下，表达 mCherry 的 ALMR 神经元从成虫期第一天开始产生外泌体，成虫期第一天至第三天为主要产生阶段，此期间观察到的 ALMR 中外泌体产生率约为 5% 至 25%。特定的应激刺激和遗传干扰可显著增加 ALMR 神经元中外泌体的产生。在检查目标神经元及其周围区域是否存在外泌体结构域、完整外泌体或“星夜”事件之前，必须首先定位所有邻近的神经元。当您能够熟练地手动识别出胞体后，可采用基于高内涵成像的大规模筛选方法以提高通量，从而实现全基因组分析及出胞体生成机制的深入解析。

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