研究神经-胶质相互作用在缺血中的作用的细胞培养模型

在这里，我们提出了一个简单的方法，使用特定的培养媒体，允许建立神经元和星细胞丰富的区域性，或神经元胶质培养物从胚胎皮层，具有高产量和可重复性。

缺血性中风是一种临床疾病，其特征是脑组织灌注过低，导致神经元丧失。大量证据表明，胶质和小便池细胞之间的相互作用在缺血事件后产生压力效应。为了探索潜在的保护机制，开发允许研究缺血环境中神经元-胶质相互作用的模型非常重要。

在这里，我们提出了一个简单的方法，从大鼠胚胎皮层分离星形细胞和神经元，通过使用特定的文化媒介，允许建立神经元或星细胞丰富的区域性或新胶质文化具有高产量和可重复性。为了研究星核细胞和神经元之间的串扰，我们提出了一种基于共培养系统的方法，即在盖滑中培养的神经元与多孔板中镀在一体的单层星细胞保持接触。这两种文化由小石蜡球保持一部分。

这种方法允许独立操作和将特定处理应用到每种细胞类型，这在许多研究中代表了优势。为了模拟缺血性中风期间发生的情况，培养物受到缺氧和葡萄糖剥夺协议。该协议是研究神经元-胶质相互作用在缺血性中风中的作用的有用工具。

从大鼠胚胎皮层绝缘开始。胚胎是在妊娠15天后从一组大鼠身上获得的，并被放置在一个含有PBS的无菌猎鹰管中。还在蛋黄袋胚胎内被放置在含有冷 PBS 的培养皿中。

在剪刀和钳子的帮助下，蛋黄囊被打破，胚胎被取出，放在另一个含有冷PBS的培养皿中，放在冰袋上。打破蛋黄囊时必须非常小心，不要损坏胚胎。将胚胎置于解剖显微镜下，用扭动器轻轻固定胚胎。

初始切口应与皮层平行。小心不要斩首动物。头皮和小心删除不损害皮质脑组织。

下一个切口将皮层分开。去除组织中的血管。最后，使用移液器，将皮质组织转移到带PBS的猎鹰管中。

单细胞悬浮液是通过使用直径减小的尖端机械消化皮质脑组织获得的。确保组织在消化后均匀化，在400G下将材料离心三分钟。丢弃上流水，在培养中重新悬浮沉积物，以前加热到37度。

使用 Neubauer 腔室计算悬浮液中存在的细胞总数，并准备稀释以产生足够的细胞密度。最后，在多井中播种细胞，并在37度孵育。为了为共培养系统准备材料，在加热块中加热石蜡，直到其变成液体。

然后，借助立体玻璃巴斯德移液器，在以前放置在多井的盖滑上准备小球体，并涂上聚-D-Lysine。在两种培养物接触前24小时，改变神经元和星细胞的培养培养，以补充其NBM与或不带热灭活的FBS。当两种培养物准备好使用时，将位于盖上、带石蜡球的神经元转移到含有星形细胞的井中，使用以前浸入70%乙醇的钳子。

将两种细胞类型置于接触中后，等待8至12小时，然后开始不同的刺激和过程。氧气和葡萄糖的剥夺是在生长七天的培养中进行的。去除培养培养素，用HSSS培养剂洗两次，无需葡萄糖补充。

确保所有含有葡萄糖的介质都洗净。密封缺氧室，将含有95%氮气和5%二氧化碳的气体混合物加入4分钟，流量为20升，以更换室内的氧气。然后，停止流动，将缺氧室放在37度的孵化器中。

在缺氧和葡萄糖剥夺期后，用适当的培养库代替无葡萄糖补充的培养素，并在37度下孵育细胞。为了描述皮质培养的类型，我们在三种皮质培养物中进行了免疫组织化学，以评估表达GFPA或 MAP2的细胞数量，这些细胞分别是分别广泛用于天体细胞和神经元细胞的标记。这些分析表明，当这个协议，我们能够获得一个纯丰富的富集的星细胞与约97%的细胞表达GFAP。

关于神经元丰富的培养，我们验证了约78%的细胞表达 MAP2。然而，我们识别约18%的GFAP和 MAP2阴性细胞。对于神经元-胶质皮质培养，观察到约49%的细胞为 MAP2 阳性。

31% 为 GFAP 阳性。20% 他们不对 Gfap 或 MAP2 负责。皮质培养建立7天后，神经元-胶质培养和神经元富集培养接受OGD手术4小时和6小时。

在此过程之后，细胞被标记为 MAP2，然后使用荧光显微镜量化 MAP2 阳性细胞的数量。在神经元-胶质培养中，当培养被提交到4小时的OGD周期时，神经元的数量减少了约30%。经过6小时的OGD期后，病变的延长增加，达到神经元损失的60%左右。

关于暴露于OGD的神经元的丰富培养，观察到 MAP2 细胞的数量减少约 41% 和 64%。此外，据观察，在神经元丰富的培养文化中，与在4小时内也接触OGD的神经元胶质培养相比，损伤延长略有增加。总之，这里代表一个体外模型，研究以简单、快速、昂贵和可重复的方式建立的缺血性中风。

此外，所述方法还允许实现神经元和富含星细胞的初级培养，但也允许神经元-胶质培养。因此，提供一个伟大的体外模型，建模几个脑部疾病与更高的复杂程度，比不朽的细胞系和纯粹的神经元或胶质培养。