一种用于研究缺血过程中神经元-胶质细胞相互作用的细胞培养模型

缺血性脑卒中是一种以脑组织灌注不足为特征的临床病症，可导致神经元丢失。大量证据表明，在缺血事件发生后，胶质细胞与尿路细胞之间的相互作用会产生压力效应。为了探索潜在的保护机制，建立能够在缺血环境中研究神经元-胶质细胞相互作用的模型至关重要。

本文介绍了一种从大鼠胚胎皮层中分离星形胶质细胞和神经元的简单方法，通过使用特定的培养基，可高效且可重复地建立富含神经元或星形胶质细胞的培养体系，或建立新型胶质细胞培养体系。为了研究星形胶质细胞与神经元之间的相互作用，我们提出了一种基于共培养系统的方法，其中将培养在盖玻片上的神经元与接种于多孔板中的星形胶质细胞单层保持接触。两种培养物之间由微小的石蜡球隔开。

该方法可对每种细胞类型进行独立操作并施加特定处理，这在许多研究中具有优势。为了模拟缺血性脑卒中发生时的情况，将细胞培养物置于缺氧缺糖环境中。该方案是研究神经元-胶质细胞相互作用在缺血性脑卒中中作用的有效工具。

从大鼠胚胎皮层分离开始。胚胎取自妊娠15天的大鼠母体，置于含有磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌Falcon管中。仍在卵黄囊内的胚胎被放入含有冷PBS的培养皿中。

借助剪刀和镊子将卵黄囊撕破，取出胚胎并置于另一个含有冷PBS的培养皿中，培养皿需放置在冰袋上。撕破卵黄囊时必须格外小心，以免损伤胚胎。将胚胎置于解剖显微镜下，用镊子轻轻固定胚胎。

初始切口应与皮层平行。注意不要切断动物的头部。小心移除头皮，以免损伤皮层脑组织。

下一步切口用于分离皮层。去除组织中存在的血管。最后，使用移液器将皮层组织转移至含有PBS的Falcon管中。

通过使用直径递减的枪头对大脑皮层组织进行机械消化，获得单细胞悬液。消化完成后，确保组织充分匀浆，然后在400 ×g下离心3分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于预热至37摄氏度的培养基中。

使用血细胞计数板计算悬浮液中细胞的总数，并配制适当细胞密度的稀释液。最后将细胞接种至多孔板中，在37摄氏度条件下孵育。为准备共培养系统所需材料，将石蜡置于加热块中加热至完全融化。

然后，借助立体玻璃巴斯德吸管，在预先放置于多孔板内并包被了多聚-D-赖氨酸的盖玻片上制备微小的石蜡球。在两种细胞培养物接触前24小时，更换神经元和星形胶质细胞的培养基，向NBM中添加或不添加经热灭活的FBS。当两种培养物准备就绪后，用先前浸入70%乙醇的镊子，将附着于含石蜡球的盖玻片上的神经元转移至含有星形胶质细胞的孔中。

将两种细胞放置接触后，等待8至12小时，然后开始不同的刺激和操作。缺氧缺糖处理在培养7天后进行。移除培养基，并用不含葡萄糖的HBSS培养基洗涤细胞两次。

确保洗去所有含葡萄糖的培养基。密封缺氧室，并以每分钟20升的流速通入含有95%氮气和5%二氧化碳的混合气体4分钟，以置换室内原有的氧气。随后停止通气，将缺氧室置于37摄氏度的培养箱中。

在缺氧缺糖处理后，将培养基更换为适用于后续实验的完全培养基（不含葡萄糖补充的 HBSS 替换为适当的完全培养基），并将细胞在 37 摄氏度条件下继续孵育。为了鉴定皮层细胞培养的类型，我们对三种类型的皮层培养细胞进行了免疫组织化学分析，以评估表达 GFAP 或 MAP2 的细胞数量，这两种标记物分别为星形胶质细胞和神经元细胞的常用标志物。分析结果显示，采用本实验方案可获得高度富集的星形胶质细胞纯培养，约 97% 的细胞表达 GFAP。

关于神经元富集培养，我们验证了约78%的细胞表达MAP2。然而，我们发现约18%的细胞为GFAP和MAP2双阴性。对于神经元-胶质细胞皮层培养，观察到约49%的细胞为MAP2阳性。

31%为GFAP阳性，另有20%既不表达GFAP也不表达MAP2。皮层培养建立7天后，神经元-胶质细胞共培养体系和神经元富集培养体系分别接受持续4小时和6小时的氧糖剥夺（OGD）处理。

经过该操作后，使用 MAP2 对细胞进行标记，然后通过荧光显微镜定量 MAP2 阳性细胞的数量。在神经元-胶质细胞共培养体系中，当培养物经受 4 小时的氧糖剥夺（OGD）处理后，观察到神经元数量减少了约 30%。经过 6 小时的 OGD 处理后，损伤范围进一步扩大，神经元丢失达到约 60%。

关于暴露于氧糖剥夺（OGD）的神经元富集培养，观察到MAP2阳性细胞数量减少了约41%和64%。此外，在神经元富集培养中，与同样暴露于4小时OGD的神经元-胶质细胞共培养相比，损伤范围略有增加。总之，本文建立了一种简单、快速、经济且可重复的体外缺血性脑卒中研究模型。

此外，所描述的方法还可用于建立富集神经元和星形胶质细胞的原代培养，以及神经元-胶质细胞共培养体系。因此，相较于永生化细胞系以及纯神经元或纯胶质细胞培养，该方法提供了一种更为复杂的体外模型，可用于模拟多种脑部疾病。