Name: 精确的大脑映射，在小鼠中执行神经-免疫动力学的重复体内振动成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学习在小鼠中使用双光子显微镜进行慢性颅窗植入和重复体内成像的技术。该方法可实现对神经胶质血管结构的长期可视化，揭示细胞动态和神经退行性变化。

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感谢Eyo实验室成员对本文所述观点的讨论。感谢弗吉尼亚大学Kipnis实验室的Justin Rustenhoven博士惠赠NG2DsRed小鼠33。本研究由美国国立卫生研究院下属国家神经疾病与卒中研究所资助，项目编号为U.B.E（K22 NS104392）。

所有步骤均符合弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会制定并批准的指南。
1. 颅窗植入术的小鼠准备
注意：多种带有荧光标签的转基因小鼠品系均适用于成像。
<ol>
	<li>使用 CX3CR1GFP/+ 小鼠26 在活体中观察小胶质细胞。通常使用体重为 17–25 g 的幼年至年轻成年小鼠，年龄为 4 至 10 周。 
	注意：尽管该方法也适用于断奶前小鼠，但由于需要将小鼠放回笼中由母鼠喂养，若母鼠在术后未能妥善照顾幼崽，则可能使恢复过程复杂化。因此，建议使用已断奶的小鼠。</li>
	<li>在麻醉室中使用异氟烷（5% 流速的氧气中诱导麻醉 1 分钟）对小鼠进行麻醉。通过捏压脚趾和/或尾巴检查小鼠是否不再出现任何运动或抽搐反应。将小鼠从麻醉室中取出，在开放空气中使用毛发修剪器彻底剃除两耳之间从眼睛水平至颈部顶端区域的头部毛发。 
	注意：所用异氟烷的浓度取决于诱导室的大小。因此，对于较小的诱导室，可使用 3–4% 的异氟烷有效诱导麻醉，而较大的诱导室则需要高达 5% 的浓度。</li>
	<li>将小鼠转移至立体定位手术站的鼻罩进行麻醉维持（手术期间维持浓度为 1.5–2%），使用耳杆固定其头部，并将小鼠置于加热垫上以保持体温。</li>
	<li>用眼膏润滑双眼。在切口部位皮下注射 100 µL 0.25% 布比卡因（为小鼠提供可持续 8–12 小时的局部镇痛）和 100 µL 4 mg/mL 地塞米松（以减少手术操作可能引起的炎症反应）。在进入下一步之前，让小鼠静置至少 5 分钟。</li>
	<li>用碘伏和 70% 酒精交替擦拭剃净的头部三次。使用手术刀或剪刀沿中线做头皮切口，从两耳之间的颅骨后部延伸至两眼之间的额部区域。剪开剩余皮肤以暴露颅骨。&#160;</li>
	<li>用 3% 过氧化氢（H2O2）清除位于头皮与下方颅骨之间的结缔组织，并根据立体定位坐标确定需要成像的脑区。 
	注意：颅骨表面切口处常会出现少量出血（步骤 1.5）。这种出血通常在 3–5 分钟内自行停止。使用过氧化氢清洁有助于止血。此前的布比卡因处理（步骤 1.4）也被证实可减少此期间的出血量。</li>
</ol>
2. 小鼠颅窗植入手术
<ol>
	<li>使用牙科钻头（尖端直径0.7 mm）在颅骨上钻一个直径约4 mm的圆形开口，并用尖头镊子小心移除该部分颅骨。若需对6至8周龄小鼠的体感皮层进行成像，颅窗中心应位于前囟后方-2.5 mm、左右两侧±2.0 mm处。钻孔过程中，需定期使用无菌生理盐水和棉签湿润颅骨，以冷却脑组织、清除骨屑并软化颅骨以便最终移除。 
	注意：颅窗坐标的设定会因目标脑区及小鼠年龄的不同而有所变化。</li>
	<li>移除颅骨后，将一片经生理盐水湿润的小型盖玻片（#0号，厚度0.1 ± 0.02 mm）小心放置于颅窗内，再用无菌擦拭纸吸去多余生理盐水。</li>
	<li>使用尖头涂布工具（如移液器吸头或折断的木制棉签尖端），在窗口周围涂抹氰基丙烯酸酯胶水，使其粘附于脑组织和颅骨上。先在其余颅骨表面涂上底漆胶，并用固化灯照射20–40秒使其固化。随后用最终胶水在窗口周围构建一个围堰结构，并再次用固化灯照射20–40秒完成固化。</li>
	<li>首先使用底漆胶作为底涂，将一小块头固定板粘附于颅窗对侧半球的颅骨上，然后再使用最终胶水加固。每次均需用固化灯照射20–40秒进行固化。 
	注意：若此过程中胶水完全覆盖了颅骨表面，则无需缝合。</li>
</ol>
3. 术后护理
<ol>
	<li>让小鼠在无麻醉状态下苏醒（在加热垫上恢复可缩短恢复时间），待其完全清醒后放回原笼。皮下注射一次缓释布托啡诺（0.5 mg/kg），作为术后镇痛，药效可持续72小时。</li>
	<li>为促进小鼠术后健康恢复，应提供额外的软质食物，可将常规固体饲料浸泡于水中软化，或使用凝胶状食物。 
	注意：手术后一次性提供软质食物即可。</li>
	<li>在手术后的最初72小时内，每天监测小鼠的健康状况和恢复情况。此后，最早可在窗植入手术后2周开始进行成像。 
	注意：若手术操作得当，小鼠将恢复良好，表现为正常的活动行为、充分的笼内探索、良好的水合状态、稳定的体重增长，以及与笼内其他小鼠和物品的广泛互动。若小鼠出现嗜睡、脱水或术后体重减轻超过10%，则应实施安乐死并从研究中剔除。</li>
</ol>
4. 初始成像的双光子脑图谱绘制
<ol>
	<li>用异氟烷（5%诱导，1.5%维持）麻醉小鼠。使用螺钉将头固定器固定在双光子显微镜载物台上，并将小鼠头部置于35℃加热板上维持体温 &#730;C. 腹腔注射 100 &#181;L 血管染料，如罗丹明B（2 mg/mL）。 
	注意：成像也可在未麻醉的清醒小鼠中进行。然而，近期研究表明，麻醉会影响小胶质细胞的监视动态27,28,29 并且清醒小鼠在进行双光子成像时，即使在至少25天的慢性成像过程中，头部固定仍会增加其应激反应（参见 Juczewski 等，2020）30.</li>
	<li>用蘸有70%乙醇的棉签轻轻清洁颅窗表面。在颅窗上滴加几滴水或生理盐水，并将物镜浸入溶液中，因为该物镜为浸液式物镜。</li>
	<li>通过落射荧光显微镜目镜观察时，手绘粗略图以标记主要血管解剖标志，并记录于实验记录本中。利用此图在双光子成像过程中识别特定脑区。或者，可通过显微镜连接的相机、手持相机或手机拍摄血管图像。 
	注意：这些手绘图像和照片旨在帮助在双光子成像前于显微镜下重新定位相同的大致区域。这些并非精确的图像定位。</li>
	<li>在双光子成像下，根据需要采集荧光标记的细胞和血管的图像。仔细记录相应的坐标信息，以确保能够准确定位同一区域进行后续成像。在首次成像过程中采集多个视野，例如每隔1-2 μm获取一组z轴层扫图像 &#181;m 通过组织体积。 
	注意：在使用双光子采集图像时，利用血管标志物进行粗略定位。如果需要精细定位，可使用 Thy1-YFP 小鼠中 YFP 标记的树突作为精细定位参考。31 小鼠被使用。
	<ol>
		<li>使用以下推荐参数进行成像：880–900 nm 的激发波长为最佳；对于 GFP 和/或 dsRed/Rhodamine 的激发，采用 565 nm 二向色镜，并搭配 525/50 nm（绿色通道）和 620/60 nm（红色通道）的发射滤光片；为分离 GFP 与 YFP，采用 509 nm 二向色镜，并搭配 500/15 nm 和 537/26 nm 发射滤光片；脑组织处的激光功率维持在 25 mW 或以下；图像分辨率为 1024 × 1024 像素，使用 25× 0.9 NA 物镜并在 1.5× 放大倍数下，视场为 295.24 × 295.24 &#181;m</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像结束后，将小鼠从显微镜载物台上取下，使其从麻醉状态中苏醒，并放回饲养笼，直至下一次成像实验。</li>
</ol>
5. 双光子成像与重复成像
<ol>
	<li>在初次成像后的数小时至数月内的后续成像过程中，用异氟烷麻醉小鼠（诱导浓度5%，维持浓度1.5%），将其固定在双光子显微镜上，置于加热板上保持体温，并重新注射100 µl 血管染料（如罗丹明B，2 mg/mL）。</li>
	<li>在ImageJ中打开先前获得的图像，并结合此前成像记录的笔记，定位先前&#160;成像&#160;的区域，仔细重新成像。&#160;</li>
	<li>重复此过程，直至成像窗口保持清晰，或根据研究需要持续进行。</li>
</ol>

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<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).</li>
<li>Chakrabarty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+serotype+and+timing+of+injection+determines+AAV+transduction+in+the+neonatal+mice+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain.</a> PLoS One. 8 (6), 67680(2013).</li>
<li>Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+genetic+access+to+transiently+active+neurons+via+TRAP%3A+targeted+recombination+in+active+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations.</a> Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).</li>
<li>Pilz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neurogenesis+in+the+adult+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus.</a> Science. 359 (6376), 658-662 (2018).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kilohertz+two-photon+fluorescence+microscopy+imaging+of+neural+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo.</a> Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).</li>
<li>Yang, W., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of neural activity.</a> Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).</li>
<li>Hannan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+deep+neural+activity+from+the+cortical+surface+during+hippocampal+epileptiform+events+in+the+rat+brain+using+electrical+impedance+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography.</a> Neuroimage. 209, 116525(2020).</li>
<li>Kulkarni, R. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Two-Photon+Voltage+Imaging+with+Sulfonated+Rhodamine+Dyes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes.</a> ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).</li>
<li>Chamberland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+imaging+of+subcellular+voltage+dynamics+in+neuronal+tissue+with+genetically+encoded+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators.</a> Elife. 6, (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

活体双光子成像技术的出现为探索健康大脑中大量存在的细胞相互作用和动态过程提供了新的机遇。早期的研究主要采用开颅骨窗方法，通过急性或慢性成像来观察神经元树突37,38。该方法也可用于阐明大脑中的神经免疫相互作用。本实验方案描述了一种可靠的方法，可用于在短期或长期内对荧光标记的细胞（尤其是小胶质细胞，即大脑中的常驻免疫细胞）进行长时间成像。文中详细介绍了使用染料标记的血管和/或荧光标记的树突，以实现对目标脑区的粗略或精细定位，从而支持对细胞进行重复且可靠的成像。尽管本文推荐使用Thy1YFP小鼠品系进行精细脑区定位，但也可采用其他技术或小鼠品系来标记特定的神经元群体，例如胚胎内电穿孔39,40、出生后早期腺相关病毒（AAV）注射41，或使用TRAP小鼠42。此外，尽管本文讨论的重点是皮层成像，...

中枢神经系统（CNS）受到多种常驻细胞类型之间复杂相互作用的调控，这些细胞包括神经元、胶质细胞以及血管相关细胞。传统上，神经细胞的研究主要在分离培养、共培养1,2,3,4,5（体外）或离体脑组织（离体）6,7,8,9,10 的条件下进行。然而，仍需进一步理解神经细胞在完整活体大脑原生环境中的行为及其相互作用。在本实验方案中，我们描述了一种方法，用于在活体条件下定位感兴趣区域，并在后续成像过程中精确定位并重新成像这些区域，从而在较长时间内追踪各种中枢神经系统细胞类型之间的复杂相互作用。
活体成像技术的发展极大地促进了人们对神经功能的深入理解11,12,13,14,15。具体而言，这些方法相较于传统的体外（in vitro）和离体（ex vivo）方法具有多项优势。首先，活体成像系统包含具有生理相关性的细胞和组织成分，例如完整的脉管系统以及各种细胞间的相互作用，有助于全面理解神经网络的生理特性。其次，近期研究发现，某些神经细胞（如小胶质细胞）一旦脱离其原始微环境，便会丧失其身份特征及相应的生理功能16,17，而这些特性在活体环境中则可得以保留。第三，活体成像系统支持持续数周至数月的稳定纵向研究，可用于观察中枢神经系统（CNS）内细胞间的动态相互作用。最后，鉴于越来越多的证据表明外周免疫系统18,19和微生物组20,21在中枢神经系统生理中的重要作用，活体系统为探究这些因素对中枢神经系统细胞的影响提供了理想的平台。因此，利用纵向活体成像技术研究健康、损伤及疾病状态下神经-免疫系统的生理机制与相互作用，是对传统研究方法极为有益的补充。
在本实验方案中，我们介绍了一种可靠的方法，用于对大脑中的不同细胞类型进行成像，以小胶质细胞、神经元和NG2+细胞为例。目前已有两种在体可视化神经细胞的方法：颅骨磨薄法和开颅植入颅窗法。尽管颅骨磨薄法已被广泛应用，并因其可避免开颅法的一些缺点（如胶质细胞激活、高于生理水平的树突棘动态变化以及需使用抗炎药物22,23,24,25）而更受青睐，但该方法也存在若干关键缺陷。首先，颅骨磨薄操作极为精细，许多研究人员难以掌握，尤其是在需要重复磨薄时尤为困难。其原因在于实验者通常难以准确判断颅骨是否已磨薄至约20 µm的厚度。其次，为了在不同小鼠之间进行充分比较，磨薄程度必须完全一致，而不同成像实验或不同小鼠之间磨薄效果的差异可能会影响神经结构的可视化。第三，在进行纵向成像时，采用颅骨磨薄的小鼠仅能用于有限次数的成像，尤其是在需要重复磨薄的情况下。第四，由于仍有部分骨组织残留，颅骨磨薄法可能会影响成像的深度清晰度，导致对较浅层结构的可视化效果较好，而对深层区域的成像效果较差。因此，诸如海马等较深脑区结构无法通过颅骨磨薄法成功成像。鉴于上述问题，有必要开发替代性或互补性的方法以克服这些局限。
与减薄颅骨方法相对，开颅窗植入方法采用一种将颅骨替换为光学透明玻璃盖玻片的技术。该方法可实现近乎无限次数的成像操作。此外，由于颅骨被玻璃盖玻片取代，该技术可在数小时至数月的长时间内提供清晰的观察窗口，用于观测荧光标记的脑细胞，因此可用于研究与生理学、衰老及病理过程相关的细胞活动与相互作用。
总体而言，我们详细描述了通过立体定位开颅术植入慢性颅窗的步骤，该方法可实现对感兴趣脑区的活体成像。我们还介绍了如何利用大体稳定的脑血管或荧光标记的树突，分别生成感兴趣脑区的粗略或精细定位图谱。该方法可用于多次成像实验。因此，该技术的重要性在于能够对脑内结构（包括不同类型细胞的排列方式、形态特征及其相互作用）的长期变化或稳定状态进行成像观察。

<table><tbody><tr><td>盖玻片（3 mm）</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0726</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水（Krazy Glue）</td><td>Amazon</td><td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&amp;amp;qid=1583856837&amp;amp;s=pet-supplies&amp;amp;sr=8-2</td><td></td></tr><tr><td>Demi Ultra LED 固化灯系统</td><td>Dental Health Products, Inc</td><td>910860-1</td><td></td></tr><tr><td>牙科钻机</td><td>Osada: www.osadausa.edu</td><td>EXL-M40</td><td></td></tr><tr><td>钻头</td><td>Fine Science Tools</td><td>#19008-07</td><td></td></tr><tr><td>眼药膏</td><td>Henry Schien</td><td>1338333</td><td></td></tr><tr><td>iBond Total Etch（底漆胶）</td><td>Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)</td><td>66040094</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明 B</td><td>Millipore Sigma</td><td>81-88-9 (R6626)</td><td></td></tr><tr><td>Tetris Evoflow 胶水（终层胶）</td><td>Top Dent (Ivoclar Vivadent)</td><td>#595956</td><td></td></tr><tr><td>Wahl Brav Mini+</td><td>Amazon</td><td>https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&amp;amp;linkCode=df0&amp;amp;hvadid=167141013968&amp;amp;hvpos=&amp;amp;hvnetw=g&amp;amp;hvrand=12368793083893626704&amp;amp;hvpone=&amp;amp;hvptwo=&amp;amp;hvqmt=&amp;amp;hvdev=c&amp;amp;hvdvcmdl=&amp;amp;hvlocint=&amp;amp;hvlocphy=9008337&amp;amp;hvtargid=pla-332197544154&amp;amp;psc=1</td><td></td></tr></tbody></table>

精确脑图谱引导下对小鼠神经-免疫动态进行重复活体成像

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

中枢神经系统（CNS）的功能受到神经元、胶质细胞、基质细胞和血管细胞之间复杂相互作用的调控，这些细胞共同维持其正常功能。尽管在体外分离培养或在离体条件下共同研究这些细胞可提供有价值的生理信息，但在这些环境中仍会遗漏神经细胞生理学的一些关键特征。因此，有必要在神经细胞所处的天然体内环境中对其进行研究。本文详细描述了一种用于在啮齿类动物大脑皮层中对神经细胞进行重复性活体双光子成像的实验方案，该技术可用于在数小时至数月的时间范围内对特定细胞进行可视化和动态观察。我们详细阐述了如何利用整体上稳定的脑血管系统作为粗略定位图谱，或利用荧光标记的树突作为精细图谱，来标记特定脑区。通过这些图谱作为视觉参照，我们展示了如何精确定位同一神经细胞，以实现后续多次重复的活体成像。通过荧光标记的小胶质细胞、神经元以及NG2+细胞的活体成像实例，本方案证明了该技术能够在长时间跨度内对同一脑区的细胞动态进行重复观察，从而有助于深入理解这些细胞在正常生理状态或病理损伤后的结构与功能反应。在必要时，该方法还可与神经细胞的功能性成像相结合，例如钙成像技术。当存在带有不同荧光标签的转基因小鼠模型或特异性染料可用于标记目标细胞时，该方法尤其适用于在活体条件下可视化观察中枢神经系统中不同类型细胞之间的物理相互作用。

为了在活体中观察小胶质细胞的动态变化，采用了双转基因 CX3CR1GFP/+:Thy1YFP 小鼠。使用 Thy1-YFP H 系而非 Thy1-GFP M 系，是为了避免小胶质细胞（GFP）与神经元（YFP）之间的荧光重叠。替代方案可采用以 tdTomato 等荧光蛋白标记小胶质细胞的报告基因小鼠品系，此时则可使用 Thy1-GFP M 系。H 系的一个缺点是 YFP 会标记大量神经元，且随着年龄增长标记信号增强（个人观察）。M 系则仅稀疏地标记部分神经元。在颅窗植入手术后 2 至 4 周内，可通过重复成像追踪小胶质细胞的动态变化。利用大血管定位特定脑区，再结合 YFP 标记的树突进行脑区的精细定位。通过该方法，可将特定树突作为稳定的解剖标志物，用于脑区的精细映射（图 1，图 1b 中的箭头所示）。尽管树突结构稳定，但部分小胶质细胞每日均会发生移动（图 1c）。
<p class="jove_content...

本方案描述了一种慢性颅窗植入技术，可用于在健康和疾病状态下对神经-胶质-血管结构、相互作用及功能进行纵向成像。该技术可作为经颅成像方法的补充替代方案，后者虽然常被优先选用，但存在一些关键性局限。

中枢神经系统（CNS）的功能受到神经元、胶质细胞、基质细胞和血管细胞之间复杂相互作用的调控，以维持其正常功能。

本方案展示了如何利用活体双光子显微镜对同一脑区在长时间内进行重复观察，以可视化细胞动态变化。该技术的优势在于能够成像脑内细胞成分的长期变化，包括中枢神经系统中不同类型细胞的空间排列、形态学特征及其物理相互作用。该技术在研究脑可塑性和神经退行过程中细胞间相互作用、细胞动态行为及形态学改变方面尤为有用。首先准备一只幼年或年轻成年、4至10周龄、CX3CR1 GFP 杂合小鼠，体重为17至25克，用于颅窗植入。将小鼠麻醉后，使用理发剪在耳间区域剃除头部毛发，大致从眼睛水平位置至颈部顶端。将小鼠转移至立体定位手术台的鼻罩上，并使用耳杆固定其头部。在整个操作过程中，将小鼠保持在加热垫上。用油性眼膏润滑双眼，然后在切口部位皮下注射 100 µL 0.25% 布比卡因和 100 µL 4 mg/mL 地塞米松。至少等待五分钟后再继续操作。用碘伏和70%酒精交替擦拭剃净的头部三次以止血。然后使用手术刀或剪刀沿中线做头皮切口，切口从颅骨后部两耳之间开始，延伸至眼睛之间的额部区域。剪开剩余的皮肤以暴露颅骨。用3%过氧化氢清除头皮与下方颅骨之间的结缔组织，并利用立体定位坐标确定需要成像的脑区。使用牙科钻头在颅骨上钻出一个直径约四毫米的圆形开口。钻孔过程中，需定期使用无菌生理盐水和棉签湿润颅骨，以冷却脑组织。清除骨屑并软化颅骨。操作完成后，用尖头镊子小心移除该部分颅骨。去除颅骨后，将一小块用生理盐水润湿的盖玻片小心地放置在颅窗上。用无菌擦拭纸吸去多余的生理盐水。使用尖头涂抹器，在窗周涂抹氰基丙烯酸酯胶水，使其与脑组织和颅骨粘附。将底漆胶涂抹至颅骨其余区域，并用固化灯照射20至40秒进行固化。用最终胶在窗口周围形成一个凹槽结构，并用固化灯照射20至40秒使其固化。在对侧半球的开颅部位，使用底漆胶将一小块头固定板粘附到颅骨上，然后再使用最终胶进行加固，两次均需用固化灯照射20至40秒完成固化。小鼠苏醒后，皮下注射一剂缓释布托啡诺作为术后镇痛，该剂量可持续镇痛 72 小时。给予额外的含盐食物以促进小鼠健康恢复。植入手术后最早可在两周时进行成像。 使用螺丝将头固定板安装在双光子显微镜载物台上，载物台应通过加热板维持在35摄氏度。皮下注射100 µL血浆血管染料（如罗丹明B）至小鼠体内。用蘸有70%乙醇的棉签轻轻清洁颅窗表面。在颅窗上滴加几滴水或生理盐水，然后将物镜浸入溶液中。降低物镜时，确保激光已关闭，并通过目镜观察，绘制示意图以标注主要血管的解剖标志。利用此图在双光子成像过程中识别特定区域。使用双光子成像采集荧光细胞和血管的图像。参见文本稿件中的成像参数，仔细记录相应的坐标信息，以确保能够重新定位到精确的区域进行后续成像。在本次初始成像过程中，绘制多个视野区域。成像结束后，将小鼠从成像台上取下，使其从麻醉状态中苏醒，并放回其原有的饲养笼中。在后续的成像实验中，利用所获得的记录和图像信息重新定位并成像相应区域。本方案用于在中国台湾YFP-H系小鼠中活体可视化小胶质细胞动态。特定的树突作为稳定标志物，用于脑区的精细定位。尽管树突结构稳定，但部分小胶质细胞每日仍会发生移动。使用单转基因 CX3CR1/GFP 小鼠，可连续观察小胶质细胞长达八周。每次成像过程中，通过注射罗丹明 B 对血管系统进行标记。血管系统保持稳定固定，而小胶质细胞则具有动态特性。采用CX3CR1/GFP小鼠来观察严重癫痫发作前后的小胶质细胞变化。血管床结构保持不变，但小胶质细胞网络及其空间分布呈现短暂性改变。在癫痫发作后24至48小时内观察到更显著的变化。使用双转基因 CX3CR1/GFP 和 NG2DS-Red 小鼠在体内追踪小胶质细胞以及 NG2 阳性细胞。在未标记血管系统的情况下，可识别出小胶质细胞、与血管相关的寄生虫以及少突胶质前体细胞（OPCs）。寄生虫具有沿血管壁延伸的细长突起，而 OPCs 通常具有较大的细胞体，位于远离血管系统的脑实质中。当使用罗丹明B时，尽管成像过程中激发条件相似，寄生虫较亮的荧光仍可与管腔内较弱的罗丹明荧光区分开来。每日成像显示，寄生虫位置稳定，而少突胶质前体细胞（OPCs）和小胶质细胞则具有动态性。必须仔细观察所成像的区域，绘制尽可能准确的代表性图谱，并标注从起始点到达其他位置所采取的步骤。在后续的成像过程中，这些步骤、手绘图谱以及先前获取的图像对于反复识别相同位置至关重要。该技术使研究人员能够阐明神经元-胶质细胞相互作用、神经-免疫相互作用，以及在健康和病理状态下长时间的神经细胞动态。

precise-brain-mapping-to-perform-repetitive-vivo-imaging-neuro-immune

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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一种用于慢性双光子成像的薄颅窗技术 体内 神经炎症模型中鼠类小胶质细胞的成像

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来源：Bisht, K.，等．通过精确脑图谱实现小鼠神经-免疫动态的重复活体成像．J. Vis. Exp.

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