胎儿接触产妇炎症的穆林模型，研究急性胆管炎对新生儿肠道发育的影响

我们开发了一个胆管炎模型，以模拟胎儿接触产妇炎症（FEMI），而不会引起活体并发症，以检查FEMI对后代肠道发育的影响。这允许研究胆管炎后肠道损伤发展的机械原因。

该 FEMI 协议可以研究胎儿暴露于母体炎症后对新生儿的长期影响。这与坏死性小肠结肠炎 （NEC） 的发展尤其相关。这种技术类似于绒毛膜羊膜炎中常见的无菌性炎症，缺乏活细菌会对发育中的肠道和微生物组产生混杂影响。

该协议最重要的步骤是 LPS 注射以诱导 FEMI。使用适当的 LPS 剂量并且注射不会对妊娠小鼠造成腹膜内创伤至关重要。首先用无菌盐水将 LPS 原液稀释 1 至 100，使工作浓度为 20 μg/mL。

在妊娠第 E15 天注射怀孕的母鼠。注射前立即称量小鼠以确定适当的 LPS 剂量，使用等体积的生理盐水用于对照动物。将 LPS 溶液涡旋 3 次，持续 15 秒。

然后将其吸入 1 毫升注射器中。使用 scruffing 技术约束怀孕的小鼠，并将其保持在背侧卧位。将大约 4 到 20 号、8 毫米的针头斜向上插入，以 30 到 40 度角覆盖腹部的右下腹。

向后拉注射器柱塞以确保负压。如果存在负压，则继续注射。监测小鼠约 30 分钟，然后将它们放回笼子中度过怀孕的剩余时间。

在 E20 通过阴道分娩幼崽，并让它们留在母亲身边，接受随意喂养。在出生后第 14 天收获肠道。使用剪刀和镊子沿着腹部中线，穿过皮肤和腹膜，在整个腹部长度上做一个垂直切口。

切除从胃到盲肠的小肠，并切除肠系膜。分离小肠的远端三分之一，丢弃近端小肠、盲肠和结肠。用剪刀将回肠部分分成两半。

然后将近端一半置于 RNA 稳定溶液中用于 RNA 定量，将远端一半置于 10% 中性缓冲福尔马林中用于玻片制备。将石蜡包埋的组织切成 5 微米厚的切片，然后将它们安装在载玻片上。对载玻片进行脱蜡处理，然后根据标准程序用苏木精和伊红对切片进行染色。

由两名独立的盲法研究人员使用光学显微镜评估全身性肠道损伤，采用三分制，评估绒毛完整性和与基底膜的分离。分配零分来描述正常粘膜。给 1 分来描述轻度损伤，包括上皮下 Gruenhagen 间隙的发展、空泡化或局限于固有层或绒毛尖端的上皮下抬升。

给 2 分来描述严重损伤，表现为上皮隆起和空泡化大于绒毛的一半、绒毛变形或固有层粘膜溃疡和崩解。将玻片浸入二甲苯中两次，持续 10 分钟。然后用 100% 乙醇冲洗它们。

将玻片浸入 100% 乙醇、90% 乙醇、70% 乙醇和 50% 乙醇中 3 分钟。然后在流水下清洗玻片 5 分钟，使切片远离水，以防止组织样本丢失。用标准咖啡过滤器过滤 Alcian 蓝染色溶液，并用它来对载玻片染色 15 分钟。

然后在流来水中清洗它们两分钟。在 200 mL 双蒸水中稀释 1 mg 高碘酸，然后将玻片浸入该溶液中 5 分钟。在流水下洗涤 1 分钟后，用 Schiff 试剂对载玻片染色 10 分钟，然后再次洗涤 5 分钟。

接下来，用苏木精染色 1 分钟，然后用水洗涤 2 分钟。将它们浸入酸性酒精中一分钟，然后在 Scott 的自来水中浸泡一分钟，然后在流动的自来水下洗涤一分钟。要使载玻片脱水，请将每张载玻片浸入 70% 乙醇、90% 乙醇和 100% 乙醇中 10 次。

将玻片浸入 100% 乙醇中 10 分钟，然后在新鲜二甲苯中浸入两次，每次 3 分钟。在标本上滴一滴封固剂，并在顶部放置盖玻片。在显微镜下计数杯状细胞。

对于每块肠道组织，计算杯状细胞和 500 个上皮细胞的数量。然后将杯状细胞表达为每 100 个上皮细胞的比率。计算 Paneth 单元格。

对于每块肠组织，记录每个肠隐窝的 Paneth 细胞的比率，每块肠组织计数 100 个肠隐窝。胚胎第 15 天胎儿暴露于母体炎症 （FEMI） 会导致剂量依赖性流产和剂量依赖性早产率。FEMI 在出生时和出生后 8 周时会引起严重的肠道损伤。

这种损伤发生在没有对动物进行任何额外刺激的情况下，这表明单独的 FEMI 会破坏新生鼠肠道的正常稳态。定量小肠远端三分之一中产生粘蛋白的杯状细胞和产生抗菌肽的 Paneth 细胞的数量。研究发现，与没有 FEMI 的动物相比，FEMI 通过诱导两种细胞类型的丢失来破坏肠上皮的正常组成。

为了研究 FEMI 对新生儿炎症反应的影响，对有和没有 FEMI 的幼仔血清中的各种血清炎症标志物进行了定量，包括白细胞介素-1 β 、 白细胞介素-10 、 KCGRO 和白细胞介素-6。FEMI 显着增加了 P0 时所有细胞因子的炎症级联反应。晚年的炎症级联反应因时间点和细胞因子而异。有趣的是，FEMI 组和假手术组在 P7 到 P28 的 IL6 水平相似。

然而，尽管没有二次干预，但 FEMI 组在 P56 的水平显着升高。执行初始 LPS 剂量曲线至关重要，因为不同的 LPS 库存可能具有不同的效力。我们发现，我们的新生儿结局取决于用于诱导 FEMI 的 LPS 剂量。