Name: 分析阿拉伯恐惧症中渗透应激信号的磷蛋白分析策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 学习基于IMAC阶段吸头的磷酸化蛋白质组学方法，用于分析拟南芥渗透应激信号通路。该技术可实现高通量、深度覆盖的磷酸化肽段富集与分离，助力植物信号转导研究。

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本工作得到中国科学院战略性先导科技专项（XDB27040106）的资助。

1. 样品制备
<ol>
	<li>用铝箔采集对照组和胁迫处理的幼苗（1 g），并用液氮速冻样品。 
	注意：通常从两周大的幼苗中获得的蛋白浓度高于成熟植株。1 g 幼苗可产生约 10 mg 蛋白裂解液，足以用于质谱分析。步骤 1 中所有离心步骤均在 16,000 x g 条件下进行。</li>
	<li>使用装有液氮的研钵和研杵将冷冻的幼苗研磨成细粉。</li>
	<li>向研钵中加入 1 mL 裂解缓冲液（含 6 M 盐酸胍的 100 mM Tris-HCl，pH 8.5），并加入 10 mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）、40 mM 2-氯乙酰胺（CAA）、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物），用研杵辅助混匀。</li>
	<li>将植物裂解液转移至 1.5 mL 离心管中，在 95 °C 加热 5 分钟。</li>
	<li>将离心管置于冰上 10 分钟。在冰上超声处理 10 秒，暂停 10 秒，重复三次。</li>
	<li>离心 20 分钟，取 150 µL 植物裂解液分装至 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>向离心管中加入 600 µL 100% 甲醇。涡旋混匀后离心沉淀。</li>
	<li>向离心管中加入 150 µL 100% 氯仿。涡旋混匀后离心沉淀。</li>
	<li>向离心管中加入 450 µL ddH2O。涡旋混匀后离心 3 分钟。</li>
	<li>弃去上层水相。向离心管中加入 600 µL 100% 甲醇。离心 3 分钟后弃去溶液。</li>
	<li>用 600 µL 100% 甲醇洗涤蛋白沉淀。弃去溶液后将蛋白沉淀空气干燥。</li>
	<li>将蛋白沉淀重悬于 600 µL 消化缓冲液（含 12 mM 脱氧胆酸钠（SDC）/12 mM 月桂酰肌氨酸钠（SLS）的 100 mM Tris-HCl，pH 8.5）中。超声处理至悬浮液均匀。</li>
	<li>使用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度，并用消化缓冲液调整浓度至 4 µg/µL。取 100 µL 裂解液（含 400 µg 蛋白）转移至新离心管中。</li>
	<li>向离心管中加入 292 µL 50 mM 三乙基碳酸氢铵（TEAB）和 8 µL Lys-C（2.5 单位/mL）。37 °C 孵育 3 小时。</li>
	<li>向离心管中加入 100 µL 50 mM TEAB 和 8 µg 胰蛋白酶。37 °C 孵育 12 小时。</li>
	<li>向离心管中加入 25 µL 10% 三氟乙酸（TFA）。涡旋混匀后在 4 °C 离心 20 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至预处理的脱盐柱中进行脱盐。使用真空离心浓缩仪干燥洗脱液。 
	注意：先用 1 mL 甲醇活化树脂，再用含 0.1% TFA 的 80% 乙腈（ACN）1 mL 洗涤。随后用至少 3 mL 含 0.1% TFA 的 5% ACN 洗去有机溶剂。将步骤 1.16 制备的酸化肽样品上样至柱中，再用至少 3 mL 含 0.1% TFA 的 5% ACN 洗柱。对于盐浓度较高的样品，可能需要更多次洗涤。用 1 mL 含 0.1% TFA 的 80% ACN 洗脱磷酸化肽。</li>
</ol>
2. 串联质谱标签（TMT）标记
<ol>
	<li>将干燥的多肽重悬于 100 µL 的 200 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液中，pH 8.5。</li>
	<li>将每个通道的 TMT 试剂（0.8 mg）溶解于 40 µL 无水乙腈（ACN）中。涡旋振荡 TMT 试剂管 5 分钟，然后离心。</li>
	<li>将 40 µL TMT 溶液转移至样品管中，在室温下孵育 1 小时。 
	注意：在本实验中，通道 126 至 128 标记了未经甘露醇处理的植物的三个生物学重复样本，通道 129 至 131 标记了经甘露醇处理的植物的三个生物学重复样本。</li>
	<li>加入 8 µL 的 5% 羟胺溶液，孵育 15 分钟。</li>
	<li>将 6 个样品混合于一个 5 mL 离心管中，并加入 14 µL 的 10% 三氟乙酸（TFA）。</li>
	<li>向管中加入 3,876 µL 的 0.1% TFA。涡旋振荡后离心。</li>
	<li>将溶液转移至预处理过的脱盐柱中进行脱盐。使用真空浓缩仪干燥洗脱液。</li>
</ol>
3. IMAC阶段尖端的制备
<ol>
	<li>使用16 G钝头针穿透聚丙烯筛板。 
	注意：将切割工具垂直于筛板表面，来回滚动数次，确保筛板被完全切下。将切下的筛板放入培养皿中保存。将针插入200 µL移液器吸头中，并用推杆将筛板推入吸头内。</li>
	<li>用推杆轻轻将筛板压入吸头，以封闭吸头末端。
	<ol>
		<li>将筛板以相同的压力装入各个吸头中，以提高可重复性。Stage tips制备的可重复性对于保持恒定的反压至关重要，反压会影响离心步骤的时间以及技术重复之间的可重复性。</li>
		<li>若在活化步骤中发现Stage tips反压过高，应弃用该吸头，以避免上样时可能发生吸头堵塞。这可能是由于筛板被压入过紧所致。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将Ni-NTA离心柱倒置，放置于1.5 mL离心管上。</li>
	<li>使用推杆轻轻按压Ni-NTA微珠的筛板，将微珠推入离心管中。 
	注意：务必轻柔按压筛板，避免微珠损失或吸附在离心柱上。</li>
</ol>
4. Hp-RP 柱尖的制备
<ol>
	<li>使用C8膜制备Hp-RP阶段小柱，方法同IMAC阶段小柱的制备。 
	注意：切勿对膜施加过大的压力，以免导致筛板过度紧密，增加小柱的反压。所有离心步骤在步骤4中均以1,000 x g 离心5分钟。</li>
	<li>将1 mg C18微球悬浮于100 µL 100%甲醇中，并使微球溶液通过小柱。</li>
	<li>向小柱中加入20 µL缓冲液8（80%乙腈/20% 200 mM NH4HCO2，pH 10.0），并通过离心使缓冲液8通过小柱。</li>
	<li>向小柱中加入20 µL缓冲液A（200 mM NH4HCO2），并通过离心使缓冲液A通过小柱。 
	注意：使用离心机时应确保平衡，并避免Hp-RP阶段小柱完全干燥。</li>
</ol>
5. 旋转适配器的制备
<ol>
	<li>使用尖头镊子在1.5 mL离心管管盖中心穿一个小孔。</li>
	<li>将IMAC阶段尖端或Hp-RP阶段尖端插入离心适配器的孔中。 
	注意：确保阶段尖端不靠近离心适配器的底部。</li>
</ol>
6. 使用 IMAC 阶段尖端进行磷酸化肽段富集
<ol>
	<li>用400 µL上样缓冲液（6%乙酸（AA），pH 3.0）重悬10 mg Ni-NTA凝胶，并将全部凝胶溶液转移至每个小柱中，通过离心使溶液过柱。 
	注意：除步骤6.8外，所有离心步骤均在200 x g 条件下离心3分钟。</li>
	<li>向固相萃取小柱中加入100 µL 50 mM乙二胺四乙酸（EDTA），以去除IMAC小柱中的镍离子，并通过离心使溶液过柱。</li>
	<li>向固相萃取小柱中加入100 µL上样缓冲液，并通过离心使溶液过柱。</li>
	<li>向固相萃取小柱中加入100 µL含50 mM FeCl3的6% AA溶液，并通过离心使溶液过柱。Fe3+离子将与IMAC小柱发生螯合。</li>
	<li>加入100 µL上样缓冲液以平衡固相萃取小柱，并通过离心使溶液过柱。</li>
	<li>将步骤2.7中制备的样品肽溶液100 µL加入固相萃取小柱中，并通过离心使溶液过柱。 
	注意：取一个新的离心管作为离心适配器，收集穿流液，并将穿流液保存于冷冻环境中以备后续分析。</li>
	<li>向固相萃取小柱中加入100 µL洗涤缓冲液（4.5% AA和25% ACN），并通过离心使溶液过柱。</li>
	<li>使用上样缓冲液进行第二次洗涤。向固相萃取小柱中加入100 µL上样缓冲液，并在1000 × g条件下离心3分钟。 
	注意：确保固相萃取小柱中的洗涤缓冲液被上样缓冲液完全替换，以避免在洗脱步骤中发生磷酸化肽的损失。在磷酸化肽洗脱前需对IMAC固相萃取小柱进行平衡，确保乙腈（ACN）浓度低于5%。</li>
	<li>用剪刀剪去IMAC固相萃取小柱前端，然后将其插入Hp-RP小柱中。确保两层小柱不接触离心机盖。</li>
</ol>
7. 使用 Hp-RP C18 层析尖端进行磷酸化肽段的分级分离
<ol>
	<li>向修剪好的IMAC阶段尖端加入100 µL洗脱缓冲液（200 mM磷酸铵（NH4H2PO4）），并通过离心使溶液穿过阶段尖端的两层。 
	注意：如果溶液无法通过阶段尖端，可提高离心速度。步骤7中的所有离心步骤均在1,000 x g 条件下离心5分钟。所有Hp-RP缓冲液详见表1。</li>
	<li>使用镊子丢弃IMAC阶段尖端，并向Hp-RP阶段尖端加入20 µL缓冲液A，通过离心使缓冲液穿过尖端。 
	注意：在丢弃IMAC阶段尖端前，确保所有洗脱缓冲液均已通过。</li>
	<li>加入20 µL缓冲液1以洗脱第1组分，并通过离心将洗脱液收集至新管中。依次使用缓冲液2、3、4、5、6、7和8重复该过程，将每种组分的洗脱液分别收集至不同的新管中。使用真空浓缩仪将各组分的最终洗脱液干燥。 
	注意：需新鲜配制分级缓冲液。准备8个新管作为各组分的离心适配器，将每种组分的洗脱液分别收集至不同的离心适配器中。磷酸化肽在碱性条件下不稳定，因此应立即使用浓缩仪干燥洗脱液，或立即用10%三氟乙酸（TFA）酸化。</li>
</ol>
8. 液相色谱-串联质谱分析及数据分析
<ol>
	<li>加入 5 µL 0.1% 甲酸（FA），并使用质谱仪分析样品。</li>
	<li>对每份组分运行 90 分钟梯度，缓冲液 B 比例为 6–30%（80% 乙腈和 0.1% 甲酸）。</li>
	<li>使用高能碰撞解离（HCD）对前 10 个标记肽段进行碎裂，并进行数据库搜索以鉴定磷酸化位点。</li>
	<li>将原始文件载入 MaxQuant 软件，命名实验，并设置组分和翻译后修饰（PTM）。 
	注意：MaxQuant 软件的操作教程可访问 https://www.maxquant.org/ 获取。</li>
	<li>在 LC-MS/MS 运行类型中选择报告离子 MS2，等重标签选择 6plex TMT。启用 PIF 过滤功能，并将最小 PIF 设为 0.75。</li>
	<li>在可变修饰选项中选择乙酰化（蛋白质 N 端）、氧化（M）和磷酸化（STY）；在固定修饰选项中选择卡巴酰甲基化（C）。</li>
	<li>设置消化模式为特异性，选择胰蛋白酶/P 作为消化酶，并允许最多两个漏切位点。</li>
	<li>将 PSM 错误发现率（FDR）和蛋白质 FDR 均设为 0.01，将修饰肽段的最低得分设为 40。</li>
	<li>将 Arabidopsis thaliana 数据库添加至 fasta 文件列表中，并运行数据库搜索。</li>
	<li>数据库搜索完成后，将磷酸化（STY）位点的 txt 文件载入 Perseus 软件。 
	注意：Perseus 软件的详细教程可访问 https://www.maxquant.org/perseus/ 获取。</li>
	<li>过滤掉反向匹配的磷酸化位点，并以定位概率 75% 为阈值过滤未定位的磷酸化位点。</li>
	<li>使用磷酸化位点的强度值进行统计分析。</li>
</ol>

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<li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+Mass+Tag+labeling+facilitates+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+analysis+of+hydrophilic+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides.</a> Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

植物蛋白质组和磷酸化蛋白质组的动态范围和复杂性仍然是限制磷酸化蛋白质组学分析深度的因素。尽管单次液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）分析已能够鉴定出超过10,000个磷酸化位点21,22，但对整个植物磷酸化蛋白质组的覆盖仍有限。因此，迫切需要一种具有高灵敏度和优异分离效率的磷酸化蛋白质组学工作流程，以全面描绘植物在响应环境胁迫时的信号转导网络。基于商用高压液相色谱（HPLC）柱的色谱技术是质谱分析前降低肽段复杂性的常用方法23,24。然而，HPLC方法在灵敏度和通量方面面临样品收集步骤繁琐以及洗脱体积较大的主要挑战。StageTip是一种可用于实现肽段预分级或富集的替代方法，适用于高灵敏度和高通量的研究。这种结合了同重标记、磷酸肽富集与分级的新磷酸化蛋白质组学工作流程，相较于其他磷酸化蛋白质组学方法，能够实现更全面的覆盖和更深的检测深度25,<...

高盐、低温和干旱会引起渗透胁迫，这是影响植物生产力的主要环境因素1,2。蛋白质磷酸化是植物响应渗透胁迫过程中介导信号感知与转导的最重要翻译后修饰之一3,4,5。SNF1相关蛋白激酶2（SnRK2s）参与渗透胁迫信号通路6。SnRK2家族的十个成员中有九个在渗透胁迫下表现出显著激活7,8。在所有十个SnRK2基因均发生突变的snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10十重（snrk2-dec）突变体中，植物对渗透胁迫表现出超敏感性。在snrk2-dec突变体中，渗透胁迫诱导的肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）积累、脱落酸（ABA）生物合成以及基因表达均显著降低，凸显了SnRK2s在渗透胁迫响应中的关键作用6。然而，SnRK2激酶如何调控这些生物学过程仍不清楚。分析渗透胁迫下磷酸化蛋白质组的动态变化是填补这一空白、阐明植物中渗透胁迫触发的防御机制的有效途径。
质谱法（MS）是绘制植物磷酸化蛋白质组的有力技术9。然而，由于植物蛋白质组的动态范围广泛以及植物裂解液成分复杂，植物磷酸化蛋白质组的表征仍然面临挑战4。为克服这些挑战，我们开发了一种通用的植物磷酸化蛋白质组学工作流程，可有效去除光合色素和次生代谢物等不必要的干扰，实现对植物磷酸化蛋白质组的深度覆盖10。已有多种磷酸化肽段富集方法被用于质谱分析前的样品前处理，例如固定化金属离子亲和色谱（IMAC）和金属氧化物色谱（MOC）11,12,13,14,15,16。酸性非磷酸化肽段与磷酸化肽段共纯化是影响磷酸化肽段检测的主要干扰因素。此前，我们通过标准化IMAC上样缓冲液的pH值和有机酸浓度，有效抑制了非磷酸化肽段的结合，无需进行预分级步骤即可实现超过90%的富集特异性11。
在多步磷酸化肽富集与分级过程中，样品损失会降低磷酸化肽鉴定的灵敏度，并限制磷酸化蛋白质组的覆盖深度。停止-洗脱-提取小柱（stage tips）是一种移液枪头，其末端装有小型圆盘，可用于色谱法进行肽段的分级和纯化17。通过避免在管之间转移样品，可最大限度减少stage tip操作过程中的样品损失。我们已成功将stage tip应用于Ga3+-IMAC和Fe3+-IMAC，以分离低丰度的多磷酸化肽与单磷酸化肽，从而提升了人类磷酸化蛋白质组的覆盖深度15。此外，高pH反相（Hp-RP）stage tip的应用相比强阳离子交换（SCX）和强阴离子交换（SAX）色谱法，实现了更广泛的人类膜蛋白质组覆盖18。因此，整合IMAC与Hp-RP stage tip技术可简化流程，同时以高特异性和高通量提升植物磷酸化蛋白质组的覆盖范围。我们已证实，该策略从拟南芥（Arabidopsis）幼苗中鉴定出超过20,000个磷酸化位点，显著增强了植物磷酸化蛋白质组的覆盖深度19。
本文报道了一种基于Stage Tip的磷酸化蛋白质组学实验方案，用于拟南芥（Arabidopsis）中的磷酸化蛋白质组分析。该工作流程被应用于研究野生型和snrk2-dec突变体幼苗在渗透胁迫下的磷酸化蛋白质组变化。磷酸化蛋白质组分析揭示了参与激酶激活和早期渗透胁迫信号传导的磷酸化位点。通过对野生型与snrk2-dec突变体磷酸化蛋白质组数据的比较分析，发现了RAF样激酶（RAF）-SnRK2激酶级联反应，该级联在高等植物的渗透胁迫信号传导中发挥关键作用。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>eppendorf</td><td>22431081</td><td>Protein LoBind，1.5 mL，PCR 洁净，无色，100 支</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 吸头</td><td>Gilson</td><td>F1739311</td><td></td></tr><tr><td>2-氯乙酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0267</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5438080100</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216003</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白定量试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>平头针头</td><td>Hamilton</td><td>90516</td><td>Kel-F 接头（KF），3 型针尖，16 号规格</td></tr><tr><td>C18-AQ 填料</td><td>Dr. Maisch</td><td>ReproSil-Pur-C18-AQ 5 &amp;micro;m</td><td></td></tr><tr><td>C8 Empore 萃取盘</td><td>3 M</td><td>2214</td><td>47 mm</td></tr><tr><td>离心机</td><td>eppendorf</td><td>22620444</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CX1058</td><td></td></tr><tr><td>数据分析软件</td><td></td><td>Perseus 1.6.2.1</td><td>https://maxquant.net/perseus/</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>筛板</td><td>Agilent</td><td>12131024</td><td>SPE 小柱用筛板</td></tr><tr><td>盐酸胍</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50933</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1153334000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>三氯化铁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-orbitrap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Velos Pro</td><td></td></tr><tr><td>质谱仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LTQ-Orbitrap Velos Pro</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>纳米液相色谱系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Easy-nLC 1000</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 离心柱</td><td>Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>月桂酰肌氨酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>推杆</td><td>Hamilton</td><td>1122-01</td><td>适用于 1702 型（25 &amp;mu;l）的 N、RN、LT、LTN 型推杆组件</td></tr><tr><td>搜索引擎软件</td><td></td><td>MaxQuant 1.5.4.1</td><td>&lt;u&gt;https://www.maxquant.org&lt;/u&gt;</td></tr><tr><td>SEP-PAK 小柱 50 mg</td><td>Waters</td><td>WAT054960</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>真空离心浓缩仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD121P</td><td></td></tr><tr><td>TMT 6-plex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90061</td><td></td></tr><tr><td>三乙基碳酸氢铵缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91707</td><td></td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris 盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

磷酸化蛋白质组学策略用于分析渗透压应激信号通路 拟南芥

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

在渗透胁迫条件下，蛋白质磷酸化对酶活性和基因表达的调控至关重要。基于质谱（MS）的磷酸化蛋白质组学已彻底改变了植物信号转导的研究方式。然而，由于需要大量起始材料以及长时间的质谱检测才能实现较深的覆盖深度，限制了对植物全磷酸化蛋白质组动态变化进行高通量研究的应用。为了提高植物磷酸化蛋白质组学的灵敏度和通量，我们开发了一种基于停止-洗脱提取（stage tip）技术并结合串联质谱标签（TMT）标记的磷酸化蛋白质组学方法，用于快速、全面地分析植物在渗透胁迫下的磷酸化变化。该方法充分利用了stage tip技术操作简便和高通量的特点，整个流程使用两个tip仅需约一小时即可完成磷酸肽的富集、分级和样品纯化步骤，显示出该方法易于使用且效率高。该方法不仅实现了深度的植物磷酸化蛋白质组分析（&#62; 11,000个磷酸肽鉴定），还表现出优异的分级分离效率（相邻组分间的重叠率 &#60; 5%）。此外，通过TMT标记实现了多重检测，用于定量野生型和snrk2十重突变体植物的磷酸化蛋白质组变化。该方法已成功应用于揭示Raf样激酶在渗透胁迫下的磷酸化事件，为理解陆生植物早期渗透信号通路提供了新的见解。

为了展示该工作流程的性能，我们利用IMAC阶段尖端富集结合Hp-RP阶段尖端分级分离，检测了野生型和snrk2-dec突变体幼苗在有或无甘露醇处理30分钟后的磷酸化蛋白质组变化。每个样本均设置三个生物学重复，实验流程如图1所示。每个样本的消化后肽段（400 µg）用一个TMT-6plex通道标记，混合后进行脱盐。使用IMAC阶段尖端进一步富集磷酸化肽段，纯化的磷酸化肽段随后通过Hp-RP阶段尖端分离为八个组分。每个组分均采用90分钟的液相色谱梯度进行分析。原始数据文件通过搜索引擎在Arabidopsis thaliana数据库中进行检索。
共鉴定出 11,077 条独特的磷酸化肽段，对应于 3,630 种磷酸化蛋白，包含 6,852 个定位明确的磷酸化位点（I 类，定位概率 > 0.75）。 &gt; 0.75），表明其覆盖范围广泛 拟南芥 磷酸化蛋白质组。从野生型和 snrk2-dec 突变样本。这说明了该工作流程在提供深入覆盖以阐明信号转导全局视图...

本文介绍了一种磷酸化蛋白质组学方法，即基于停止-洗脱提取尖端的磷酸化蛋白质组学技术，可实现高通量且深度覆盖的 拟南芥 磷酸化蛋白质组。该方法阐明了渗透胁迫信号传导的总体概况 拟南芥

蛋白质磷酸化在渗透压条件下对酶活性和基因表达的调控至关重要。基于质谱（MS）的……

该策略是一种强大的工具，可用于全面研究植物磷酸化蛋白质组在生物或非生物胁迫下的全局变化。该技术能够以简便、高通量的方式实现深入的磷酸化蛋白质组学分析。在进行IMAC阶段尖端小柱制备时，使用16号钝头针穿透聚丙烯多孔圆片，并用推杆轻轻将多孔圆片压入尖端中。然后，将一个倒置的镍-NTA离心柱置于1.5毫升离心管上，使用推杆轻轻将镍-NTA凝胶垫压入管中。进行磷酸化肽段富集时，使用IMAC阶段尖端，向镍-NTA凝胶中加入400微升上样缓冲液，并将全部体积的凝胶溶液加载至一个IMAC阶段尖端中。通过离心使溶液穿过尖端，随后加入100微升50毫摩尔的EDTA，通过离心洗脱去除尖端上的镍离子。通过离心，用100微升上样缓冲液处理尖端。接着，通过离心，用100微升含6%乙酸的50毫摩尔氯化铁溶液处理尖端。通过离心，用100微升上样缓冲液对层进行平衡。随后加入100微升上样缓冲液进行离心，并加入样品肽段。离心后，每次用100微升洗涤缓冲液清洗尖端两次，接着用100微升上样缓冲液再清洗一次。离心结束后，使用剪刀剪去IMAC富集尖端前端，将剪切后的尖端放入高pH反相尖端中。进行磷酸化肽段分级时，使用高pH反相C18 StageTip，通过离心将100微升洗脱缓冲液依次穿过StageTip的两层。离心结束后，用镊子弃去IMAC StageTip，并向高pH反相StageTip中加入20微升缓冲液A。再次离心后，向收集到的组分中加入20微升缓冲液1，并通过离心将洗脱液收集至新的离心管中。使用缓冲液2至8重复该过程，直至收集全部八个组分。然后在真空浓缩仪中干燥每个组分的最终洗脱液。在此代表性分析中，分别从野生型和SnRK2十重突变体样品中鉴定出8,107和7,248个磷酸化肽段，表明该实验流程能够深度覆盖拟南芥信号转导的全局图景，具有高效性。对八个组分中鉴定出的磷酸化肽段数量进行比较，结果显示前两个组分中磷酸化肽段较少，而大多数磷酸化肽段均匀分布在后六个组分中。这表明该方法能够有效分离植物磷酸化蛋白质组中的复杂磷酸化肽段。对相邻组分间磷酸化肽段重叠情况的评估表明，相邻组分中重叠的磷酸化肽段少于5%。甘露醇处理后，野生型样品中有433个磷酸化位点增加，而SnRK2十重突变体样品中有380个位点增加。其中，有312个磷酸化位点在野生型中表现出诱导作用，但在SnRK2十重突变体植株中未表现出诱导作用。在将烧结盘装入吸头时，使用相同的压力非常重要，以确保分析结果具有更好的可重复性。不久之后，阳离子交换色谱可作为替代方法，用于分离富集的磷酸化肽段，从而获得更全面的植物磷酸化蛋白质组覆盖。

phosphoproteomic-strategy-for-profiling-osmotic-stress-signaling

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

分析阿拉伯恐惧症中渗透应激信号的磷蛋白分析策略

本文介绍了一种基于未标记与标记去污剂混合物的植物质膜分馏的稳健方法，可将质膜分离为去污剂抗性膜和去污剂可溶性膜 体内 完全 15N标记 拟南芥...

代谢标记与膜组分分离用于比较蛋白质组学分析 拟南芥 悬浮细胞培养

本文介绍了一种植物蛋白质复合物的纯化与表征实验方案。我们通过免疫沉淀复合物中的单一蛋白质，从而鉴定其翻译后修饰及其相互作用蛋白伙伴。...

植物蛋白质复合物翻译后修饰的鉴定

了解韧皮部汁液的组成及其装载和长距离运输的机制，对于理解植物发育以及胁迫/病原体响应中的长距离信号传导和同化物运输至关重要。本文描述了利用EDTA促进法收集韧皮部渗出物的方法。...

使用 EDTA 促进法收集和分析 Arabidopsis 韧皮部渗出物

靶向蛋白质降解是细胞功能调控的重要机制。它发生于 通过...

在植物无细胞系统中检测蛋白酶体降解

本文介绍了一种在胁迫条件下研究蛋白质导入分离叶绿体的新方法。该方法快速且简便，可用于研究不同胁迫条件对叶绿体蛋白质导入的影响及其相应的调控机制。...

分析蛋白质向胁迫条件下植物分离叶绿体的导入

介绍了一种利用单个样品对生物组织中的脂质、代谢物和蛋白质进行综合提取的实验方案。...

一种用于从单个样品中全面分析代谢物、脂质和蛋白质的简单分级提取方法

一种简单、通用且低成本的体外水培系统已成功优化，可在无菌条件下进行大规模实验。该系统有助于将化学物质以溶液形式施加，并被根系高效吸收，适用于分子、生物化学和生理学研究。...

一种用于在无菌条件下评估植物对小分子响应的灵活低成本水培系统

本文介绍了两种在免疫诱导物处理后定量分析拟南芥（Arabidopsis...

模式触发的氧化爆发与幼苗生长抑制实验 拟南芥

胞外谷氨酸触发的系统性钙信号在植物响应机械损伤和食草动物攻击的防御反应诱导中起关键作用。本文介绍了一种利用表达钙离子和谷氨酸敏感型荧光生物传感器的拟南芥（Arabidopsis...

拟南芥中局部与系统性伤口信号的宽场实时成像

本文介绍了两种无需使用表皮撕取法的表型分析方法，用于鉴定调控气孔发育的基因。第一种方法展示了如何利用甲苯胺蓝O染色的植物表皮来分析气孔表型。第二种方法描述了如何鉴定气孔配体并监测其生物学活性。...

通过表皮表型评分鉴定参与气孔发育的基因 via

本方案通过多聚核糖体分析，将与核糖体结合的转录组（即翻译组）分离为非多聚核糖体RNA和多聚核糖体RNA 拟南芥 通过蔗糖密度梯度离心法。该方法可检测热应激条件下翻译效率 拟南芥.

热应激条件下利用多聚核糖体图谱检测翻译效率

学习基于IMAC阶段吸头的磷酸化蛋白质组学方法，用于分析拟南芥渗透应激信号通路。该技术可实现高通量、深度覆盖的磷酸化肽段富集与分离，助力植物信号转导研究。

磷酸化蛋白质组学策略用于分析渗透压应激信号通路拟南芥

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