Name: 准备可调细胞外基质微环境，以评估施万细胞表型规范 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 学习利用可调细胞外基质微环境评估施万细胞表型规范的方法，通过微接触印刷技术精确控制基质刚度、蛋白组成和细胞形态，为神经再生生物材料设计提供机制性见解。

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作者衷心感谢辛辛那提大学提供的经费支持。作者还感谢辛辛那提大学先进材料表征实验室的 Ron Flenniken 提供的支持。

1. 可调细胞培养基底的制备与表征
<ol>
	<li>基底制备
	<ol>
		<li>使用移液枪头剧烈混合PDMS基础弹性体和固化剂，比例介于10:1至60:1之间，直至气泡均匀分散在混合物中。通过真空干燥去除气泡，直至气泡完全消失。 
		注意：在PDMS聚合过程中，固化剂与基础弹性体交联，赋予最终聚合物所需的机械性能。可通过调整交联比例来改变PDMS的刚度。</li>
		<li>在方形或圆形盖玻片（例如22 mm × 22 mm）上滴加一滴（约0.2 mL）脱气后的PDMS混合物，并在匀胶机上以2500 rpm旋转30秒。</li>
		<li>将盖玻片置于60 °C烘箱中孵育1–2小时，或在室温下过夜，使PDMS固化。</li>
		<li>使用紫外臭氧清洗仪处理盖玻片7分钟（紫外波长：185 nm和254 nm），以提高表面亲水性。随后将其放入已灭菌的6孔板中。</li>
		<li>用于细胞培养前，将基底在70%乙醇中孵育至少30分钟。 
		警告：紫外臭氧清洗仪可能产生对人体有害的臭氧。操作时应在化学通风橱或具备通风条件的环境中进行。</li>
		<li>将盖玻片浸入蛋白溶液（10 µg/mL I型胶原、纤连蛋白或层粘连蛋白）中，在37 °C无菌培养箱中孵育60分钟。 
		注意：经紫外臭氧处理后，PDMS表面可能仍具疏水性。应旋转培养板，确保每个盖玻片均被蛋白溶液覆盖。</li>
		<li>吸除蛋白溶液，并用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗盖玻片3次。</li>
		<li>使用市售EDTA溶液（1×）含2.5%胰蛋白酶，将RT4-D6P2T施万细胞系（SCs）从传代培养皿中重悬，并用血细胞计数板计数细胞。以所需细胞密度将SCs接种于可调PDMS表面。不同应用所需的SC接种密度可能有所不同。</li>
		<li>在实验期间，将细胞维持在所需的培养条件下（90%湿度、5% CO2、37 °C等）。使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）作为细胞培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微图案化基底制备
	<ol>
		<li>使用计算机辅助设计（CAD）软件绘制所需的几何形状和细胞黏附区域（900 µm2、1,600 µm2和2,500 µm2）。根据这些图案从商业供应商处制作铬掩模。</li>
		<li>在洁净室或无尘环境中，采用标准光刻技术制备硅片（具体方案见其他文献31）。本应用的关键参数如下：光刻胶：SU-8 2010；旋涂分散光刻胶的程序：10秒内以100 rpm/s加速度升至500 rpm，随后30秒内以300 rpm/s加速度升至3500 rpm；紫外光曝光能量：130 mJ/cm2。 
		注意：按照上述参数，硅片上图案的高度约为10 µm。在步骤1.2.2之后，可在光学显微镜下观察到矩形或三角形图案外边缘周围可能出现裂纹。将硅片在190 °C下烘烤30分钟有助于消除这些裂纹。</li>
		<li>将带有图案的硅片放入直径150 mm、高15 mm的圆形培养皿中，并将步骤1.1.1制备的脱气PDMS（混合比例10:1）倒入硅片上。 
		注意：为便于后续微接触印刷操作，应确保PDMS厚度至少为5 mm。</li>
		<li>将PDMS覆盖的硅片置于60 °C烘箱中过夜固化。待PDMS冷却至室温后，使用手术刀片从硅片上精确切割出包含正确图案的30 mm × 30 mm正方形印章。注意不要损坏硅片。 
		注意：此时硅片可在用异丙醇清洗后多次重复使用，以制备更多印章。</li>
		<li>将PDMS印章和可调盖玻片（按步骤1.1.1至1.1.3制备）浸入70%乙醇中30分钟进行灭菌。</li>
		<li>为验证微接触印刷后PDMS印章的微图案效果，使用过滤空气流干燥PDMS印章表面，并用移液器加入50 µg/mL BSA（Texas Red标记）溶液，覆盖印章的整个图案面。</li>
		<li>在室温下将PDMS印章与BSA溶液孵育1小时，使蛋白吸附。</li>
		<li>使用过滤空气流干燥可调盖玻片表面，并按步骤1.1.5所述提高其表面亲水性。</li>
		<li>将PDMS印章风干，以去除残留的BSA溶液。 
		注意：务必确保印章上的BSA溶液完全去除，否则残留液体会导致印章在微接触印刷过程中在盖玻片上滑动。</li>
		<li>将印章的图案面与可调盖玻片紧密接触，使BSA吸附到盖玻片表面。轻轻按压印章与盖玻片接触5分钟。 
		注意：不要对印章施加过大力量，以免其弯曲并导致印章与盖玻片之间发生非特异性接触。施加在印章上的适当压力对成功进行微接触印刷至关重要。</li>
		<li>使用配备FITC（异硫氰酸荧光素）滤光片的荧光显微镜观察微图案。</li>
		<li>若需打印细胞黏附区域而非荧光图案，可用层粘连蛋白替代BSA蛋白，并重复步骤1.2.5至1.2.10。</li>
		<li>将印章从盖玻片上移除，将盖玻片转移至已灭菌的6孔板中。每孔加入2 mL 0.2% w/v Pluronic F-127溶液，覆盖盖玻片表面，并在室温下孵育1小时。 
		注意：Pluronic F-127可吸附于PDMS表面，增加其疏水性，从而阻止细胞黏附。</li>
		<li>吸除Pluronic F-127溶液，并用PBS清洗5次，再用细胞培养基清洗1次，然后接种细胞。SCs的典型接种密度为1,000 cells/cm2。</li>
		<li>细胞接种45分钟后，移除细胞培养基，并用PBS清洗盖玻片2次，以防止多个SCs黏附于同一图案。在定量分析前，将细胞在所需培养环境中维持48小时。</li>
		<li>为构建用于观察细胞排列的线性图案化细胞培养基底，执行步骤1.2.1至1.2.4，制备用于微接触印刷的印章。 
		注意：印章上线性图案的沟槽/脊尺寸为50 μm × 50 μm，适用于限定细胞位置。印章的总尺寸为10 mm × 10 mm。</li>
		<li>将印章切割成仅包含所需线性图案的尺寸。 
		注意：在CAD中设计印章时，线性图案周围的无图案区域将在微接触印刷后对应于细胞黏附区域。因此，在切割印章时必须去除无图案区域，以确保接种在表面的每个SC均遵循图案排列。</li>
		<li>执行步骤1.1.1至1.1.3，制备可调PDMS表面，涂覆两个培养皿。 
		注意：此处PDMS将直接覆盖培养皿表面，而非盖玻片。</li>
		<li>执行步骤1.2.5至1.2.10，进行微接触印刷，将线性图案化细胞黏附区域打印至其中一个PDMS涂层的培养皿上。 
		注意：一个60 mm × 15 mm培养皿的表面积可容纳6个PDMS印章的线性图案化区域。</li>
		<li>移除印章后，向培养皿中加入4 mL 0.2% w/v Pluronic F-127溶液，并孵育1小时。</li>
		<li>微接触印刷后，用70%乙醇清洗PDMS印章每面3次，并用空气干燥。旋转PDMS印章，执行步骤1.2.5至1.2.10，利用印章的无图案面在第二个培养皿上打印无图案细胞黏附区域。重复步骤1.2.13。</li>
		<li>吸除培养皿中的F-127溶液，用PBS清洗3次，再用新鲜细胞培养基清洗1次。将SCs接种至培养皿中。 
		注意：线性图案化培养皿的接种密度为5,000 cells/cm2，无图案培养皿的接种密度为10,000 cells/cm2。</li>
		<li>将SCs在所需条件下维持48小时，并按照方案制备SC裂解物32。 
		注意：无图案培养皿的细胞接种密度是线性图案化培养皿的2倍，因为线性图案化培养皿的细胞黏附面积仅为无图案培养皿的一半。
		<ol>
			<li>制备裂解物时，将适量放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液转移至10 mL锥形离心管中。将蛋白酶和磷酸酶抑制剂（100×）按1:100比例稀释于RIPA缓冲液中，用移液器充分混匀。</li>
			<li>用冰浴PBS（1×）清洗细胞2分钟，将步骤1.2.23.1制备的溶液80 µL加入每个细胞黏附区域（即与PDMS印章接触并吸附蛋白的区域）内。将细胞置于冰上孵育15分钟。 
		注意：由于Pluronic F-127在其他区域的吸附具有疏水性，溶液仅保留在细胞黏附区域。该特性可实现对线性图案化SCs的有效且充分的蛋白提取。</li>
			<li>用细胞刮刀刮取SCs 5分钟。将裂解物收集至标记的1.5 mL微量离心管中。</li>
			<li>在4°C下以12,000 x g离心15分钟。用1,000 µL移液器收集上清液并转移至洁净的微量离心管中。将细胞裂解物储存于-20 °C。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基底表征 
	注意：为表征盖玻片上聚合物的力学性能，通常采用多种方法，包括整体压缩测试11,33或原子力显微镜测试34。本方案将介绍整体压缩测试。
	<ol>
		<li>将所需混合比例的PDMS前体（步骤1.1）倒入30 mm培养皿中，确保培养皿内PDMS层厚度至少为20 mm。</li>
		<li>将含固化PDMS的培养皿从60 °C烘箱中取出（1小时后），在室温下冷却。将聚合物切割成10 mm × 10 mm的正方形。使用卡尺测量PDMS厚度。</li>
		<li>将PDMS放置在压缩力测量仪的载物台上。将压缩力传感器（型号：112C）插入传感器接口，并将其固定在测试仪的轴上。</li>
		<li>使用仪器前面板的“jog”控制功能，将传感器高度调整至PDMS印章上方约0.5 cm处。</li>
		<li>打开配套软件，进入“Test Setup”窗口，选择“Servo profile”，并打开“Segment”窗口。在“Segment”窗口中输入测试所需的“Control Rate”和“End Amount”。 
		注意：控制速率决定传感器向PDMS下移的速度，终点量决定传感器移动的总距离。</li>
		<li>使用软件控制面板上的“Z”按钮，在此点重置所有测量值。</li>
		<li>将传感器缓慢下移，轻触PDMS，直至加载1–2牛顿（N）。加载力和传感器移动距离将在软件中显示。</li>
		<li>使用“Z”按钮后，点击“Play”运行测量，并保存记录力和距离的数据文件。</li>
		<li>对每种PDMS实验条件重复步骤1.3.3至1.3.8。</li>
		<li>打开文件，使用以下公式计算每种比例PDMS的杨氏模量（E）。（F = 压缩力，A = PDMS印章面积，∆L = 传感器移动距离，L0 = PDMS印章原始厚度）。 <img alt="弹性模量公式 E=F/A/ΔL/L₀，材料应力-应变关系公式。" src="/files/ftp_upload/61496/61496equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在可调基底上对细胞特性的定量分析
<ol>
	<li>增殖实验
	<ol>
		<li>将施万细胞（SCs）以 5,000 个细胞/cm2 的密度接种于 6 孔板中，基底材料来自步骤 1.1.9 的制备。在标准细胞培养条件下（37 °C 和 5% CO2）孵育 48 小时。</li>
		<li>将 12 µL 的 10 mM 溴脱氧尿苷（BrdU）储存液加入 12 mL 37 °C 的细胞培养基中，用移液器充分混匀，配制成 10 µM 的 BrdU 标记溶液。</li>
		<li>移除细胞培养基，用 PBS 洗涤施万细胞 2 次。</li>
		<li>每孔加入 2 mL BrdU 标记溶液，孵育 2 小时。 
		注意：BrdU 标记溶液的孵育时间取决于特定细胞的增殖速率。RT4-D6P2T 施万细胞系增殖速率较高，因此采用 2 小时孵育。</li>
		<li>移除 BrdU 标记溶液，用 PBS 洗涤施万细胞 3 次（每次 3 分钟）。每孔加入 1 mL 含 3.7% 甲醛的 PBS 溶液，在室温下孵育 15 分钟以固定细胞。 
		警告：甲醛为人类致癌物，所有操作必须在化学通风橱内进行，并采取适当防护措施。 
		注意：使用 PBS 洗涤时，孔内无细胞培养基，因此 PDMS 表面可能具有疏水性。应避免基底表面完全干燥，以防细胞损伤。</li>
		<li>吸除甲醛溶液，用 PBS 洗涤 3 次（每次 3 分钟）。移除 PBS 后，每孔加入 1 mL 含 0.2% Triton X-100 的 PBS 溶液，以通透细胞膜。室温下孵育 20 分钟。</li>
		<li>移除 Triton X-100 溶液，用 PBS 洗涤施万细胞 3 次（每次 3 分钟）。</li>
		<li>每孔加入 1 mL 1 N HCl，冰上孵育 10 分钟。移除 1 N HCl 后，每孔加入 1 mL 2 N HCl，室温孵育 10 分钟。HCl 处理用于 DNA 水解。</li>
		<li>将 182 mL 0.2 mM Na2HPO4 与 18 mL 0.1 mM 柠檬酸混合，制备磷酸盐/柠檬酸缓冲液用于抗原修复。移除 2 N HCl 后，每孔加入 1 mL 磷酸盐/柠檬酸缓冲液，室温孵育 10 分钟。</li>
		<li>用含 0.2% Triton X-100 的 PBS 洗涤施万细胞 3 次。每孔加入 2 mL 含 3% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 溶液，室温孵育 30 分钟，以封闭抗体的非特异性结合。</li>
		<li>将 Alexa Fluor 488 标记的 BrdU 一抗按 1:300 的比例稀释于 3% BSA 溶液中，配制成 BrdU 染色液。将施万细胞与染色液在室温下避光孵育过夜。</li>
		<li>为定量增殖情况，使用荧光显微镜的 FITC 和 DAPI 通道分别成像检测 BrdU 和细胞核。将图像保存为“nd.2”文件。</li>
		<li>打开在相同空间位置拍摄的每张图像的“nd.2”文件。</li>
		<li>启动图像分析软件。右键单击背景，在“分析控制”部分打开“自动测量结果”和“自动测量”窗口。</li>
		<li>在“计数与分类”菜单中选择“计数”。在 FITC 图像上，点击每个显示绿色荧光的细胞核（BrdU 阳性），然后右键单击图像。 
		注意：“自动化与测量”窗口将显示 BrdU 阳性细胞的数量。</li>
		<li>对于 DAPI 图像，重复步骤 2.1.14 以统计总细胞核数量。计算该图像中 BrdU 阳性细胞的百分比。</li>
		<li>为统计目的，重复步骤 2.1.13 至 2.1.16 对其他图像进行分析，并计算每种基底条件下 BrdU 阳性细胞的平均百分比。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过免疫荧光图像分析定量 c-Jun 表达
	<ol>
		<li>来自步骤 1.1.9 和 1.2.23 的 6 孔板中制备的细胞，按照前述方法进行固定和通透处理（步骤 2.1.5–2.1.7）。 
		注意：为在不同细胞外基质（ECM）条件下准确比较细胞间的荧光强度，所有样本应使用相同的相机设置和参数。</li>
		<li>将图像保存为“.nd2”文件。</li>
		<li>启动图像分析软件。右键单击背景，在“分析控制”部分打开“自动测量结果”和“自动测量”窗口。</li>
		<li>在“自动测量结果”中选择“对象数据”，并激活“持续更新测量”按钮。</li>
		<li>在软件顶部面板中，选择“测量”，然后选择“对象特征”。将“平均强度”添加至“选中用于测量”部分。</li>
		<li>打开并合并两个包含 c-Jun 和细胞核图像的“.nd2”文件。</li>
		<li>在顶部面板中选择“ROI”，然后选择“绘制矩形 ROI”。绘制一个包含单个细胞核区域的矩形。 
		注意：c-Jun 表达主要集中于细胞核内35。</li>
		<li>在软件顶部面板中选择“二值化”和“定义阈值”，将弹出一个新窗口，用于精确界定 c-Jun 荧光区域。</li>
		<li>在新窗口中，点击“全图/使用 ROI”，将程序从全图模式切换至 ROI 模式。使用“强度”调节窗口左侧的查找表，以调整矩形 ROI 内高亮区域的大小和形状。 
		注意：应确保高亮区域的大小和形状与细胞核一致。</li>
		<li>点击“确定”按钮，获取“自动测量结果”窗口中的平均 FITC 强度，然后点击“存储数据”。</li>
		<li>在“自动测量”窗口中，选择“删除对象”以移除红色高亮区域。在左侧面板中使用“指针工具”选中矩形 ROI 并删除。</li>
		<li>重复步骤 2.2.6 至 2.2.11，测量每个额外细胞的平均 FITC 强度。</li>
		<li>在“自动测量结果”窗口区域中选择“已存储”，所有已存储的数据将显示出来。使用“导出”功能并选择“数据导出至 Excel”，保存导出的电子表格以进行后续计算。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞核伸长程度的定量
	<ol>
		<li>对来自步骤 1.2.22 制备的施万细胞，按照步骤 2.1.5–2.1.7 进行固定和通透处理。使用含 DAPI 的封片剂进行细胞核染色。</li>
		<li>使用 DAPI 通道和 40 倍物镜采集样本图像，并保存为“.nd2”文件。</li>
		<li>按照步骤 2.2.3 和 2.2.4，在图像分析软件中打开“自动测量结果”和“自动测量”窗口。</li>
		<li>在“自动测量结果”中，使用“选项”功能，然后选择“选择对象特征”。在“特征”列中选择“伸长度”，并将其添加至“选中用于测量”列。启用“持续更新测量”以激活该功能。</li>
		<li>打开包含细胞核图像的“nd.2”文件。在“自动测量”窗口中选择“自动检测”功能并选中一个细胞核。右键单击图像，“自动测量结果”窗口将显示测得的细胞核长宽比。</li>
		<li>重复步骤 2.3.5，对图像中其他细胞核的长宽比进行定量。在“自动测量结果”窗口中选择“存储数据”。</li>
		<li>对更多图像重复步骤 2.3.5 至 2.3.6。按照步骤 2.2.13 的方法将数据导出至电子表格文件进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 Western 印迹定量蛋白表达
	<ol>
		<li>遵循其他文献中详述的标准 Western 印迹分析流程32。本研究中所用抗体的稀释比例如下：兔抗 c-Jun 1:2,000；鼠抗 β-actin 1:1,000；兔抗 p75NTR 1:1,000；兔抗髓鞘碱性蛋白 1:1,000；抗鼠/兔 IgG HRP 标记二抗 1:10,000。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无潜在利益冲突。

施万细胞（SCs）在神经损伤后可通过表型转化和再生潜能促进神经再生。然而，细胞外基质（ECM）信号如何调控这种再生能力在很大程度上仍不清楚，这可能不仅会阻碍旨在促进神经再生的生物材料的开发，也会影响对神经再生机制的理解。为了初步探究这种相互作用，研究人员构建了细胞培养基底，在其中可控制ECM信号，如刚度、蛋白包被和黏附拓扑结构。在本方案中，微图案化黏附拓扑结构的能力是一个关键特征，采用的是常见的微接触印刷技术。然而，该基底与玻璃不同之处在于，施加到聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章上的压力必须控制在适当水平，才能在细胞培养基底上获得理想形状的细胞黏附区域。利用荧光标记的牛血清白蛋白（fBSA）作为模型蛋白来可视化细胞黏附区域，并调节PDMS印章上的压力，最终可解决这一问题。另一个与玻璃基底的不同之处在于需要去除过量的Pluronic F-127，该试剂用于使基底其余部分不具备黏附性。处理后，细胞培养基底具有高度疏水性，使得在洗涤过程中维持基底湿润变得困难，而保持湿润对于微图案化蛋白结构的完整性至关重要37。因此，建议使用多个移液器几乎同时进行吸液和加液操作，以防止基底完全脱水。
<p ...

周围神经系统（PNS）损伤在临床上仍是医疗领域的一大挑战，不仅影响患者的生活质量，还通过多种社会经济因素造成显著影响1,2。施万细胞（SC）作为PNS中的主要胶质细胞，能够提供必要的分子和物理信号，促进PNS再生，并在短距离神经缺损损伤中帮助实现功能恢复。这得益于施万细胞从髓鞘形成表型或Remak表型去分化为一种“修复”细胞表型的显著能力3。修复型施万细胞在多个方面具有独特的细胞表型。损伤发生后，施万细胞通过重新进入细胞周期而增殖加快，并开始表达多种转录因子以促进再神经支配。这些因子（如c-Jun和p75 NTR）表达上调，而髓鞘形成施万细胞的标志物（如髓鞘碱性蛋白（MBP））则表达下调4,5。此外，施万细胞形态发生改变，变得细长并相互排列，形成跨越损伤部位的 Büngner 带6。这为轴突向正确的远端靶点延伸提供了物理导向机制7。然而，尽管施万细胞具备促进短距离缺损神经再生的能力，但在严重损伤中，功能恢复的效果仍然不佳。部分原因在于细胞外基质（ECM）导向信号的缺失，以及施万细胞无法长期维持其再生表型8。
神经再生与恢复过程与损伤后基底膜的状态密切相关。基底膜是神经周围的一层细胞外基质（ECM），当其在损伤后仍保持完整时，可为轴突和施万细胞（SCs）提供引导作用以及与ECM结合的信号提示9。细胞外基质的状态及其向细胞传递基质结合信号的能力至关重要，此前已在多种不同背景下被广泛研究10,11,12,13,14。例如，已有研究表明，ECM的刚度可引导细胞功能，如增殖和分化11,15,16。ECM的组成成分也可引发特定的细胞反应，并通过细胞内信号通路调控细胞行为，如迁移和分化17,18。此外，细胞形态（包括铺展面积和细胞伸长程度）在调控细胞功能方面发挥重要作用，并可由ECM结合的信号所调控19,20。以往许多研究集中于干细胞向特定谱系的分化，然而施万细胞同样具备表型转换的能力——从健康神经中维持稳态的成熟施万细胞，转变为具有修复功能的施万细胞，后者可在神经损伤后分泌蛋白质和生长因子，并重塑ECM5,21。因此，明确施万细胞内在再生能力与ECM结合信号之间关系的潜在机制尤为关键，这对于最终利用该能力促进神经再生具有重要意义。
为解决这一问题，我们开发了一种详细的方法，用于制备一种细胞培养基质，其机械刚度和配体类型可在生理相关范围内轻松调节。选择聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为基质材料，是因为与聚丙烯酰胺凝胶相比，PDMS具有更高的力学可调性；聚丙烯酰胺凝胶的最大杨氏模量约为12 kPa，而PDMS的杨氏模量可达约1000 kPa22,23,24。这一点对当前研究具有重要意义，因为近期研究表明，兔坐骨神经在发育过程中其杨氏模量可超过50 kPa，提示周围神经系统（PNS）内神经的刚度范围比以往研究认为的更广。不同的蛋白质能够吸附到PDMS基质上，从而分析力学特性与配体对施万细胞（SC）行为的联合调控作用。这使得研究人员能够探究PNS再生过程中存在的多种微环境信号，并将该体系的高度可调性与仅关注基质刚度的研究进行比较25。此外，这些工程化的细胞培养基质可兼容多种定量分析方法，如免疫组织化学、蛋白质印迹（western blot）和定量聚合酶链式反应（q-PCR）。
由于该工程化细胞培养平台对每种与细胞外基质（ECM）结合的信号均具有高度独立可调性，因此非常适合用于分析其作用机制。此外，可在该基底上实现包括微接触印刷在内的常用细胞微图形化技术，从而控制细胞黏附，以研究细胞形态与其他ECM结合信号之间的关系24。这一点至关重要，因为条带状图案化的基底可促进细胞群体的伸长，为模拟和研究神经再生过程中Büngner带内伸长且具有再生能力的施万细胞（SCs）提供了有效工具。此外，细胞形态是多种细胞功能的强有力调控因素，若不加以控制，可能引入干扰性的实验结果26,27。目前，研究者正日益关注由ECM信号调控的施万细胞再生表型的潜在机制28,29,30。这对于指导可用于周围神经系统（PNS）神经再生的神经引导导管等生物材料的设计具有重要意义。这些详细的实验方案最终可作为潜在工具，用于解析施万细胞及其他细胞类型在ECM结合信号调控下的功能机制。

<table><tbody><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）Texas Red 标记物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A23017</td><td>用于显示微图案的 BSA 染色</td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG，HRP 标记抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7076S</td><td>用于 Western 印迹分析的抗体</td></tr><tr><td>抗兔 IgG，HRP 标记抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7074S</td><td>用于 Western 印迹分析的抗体</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B23151</td><td>用于测量细胞增殖的试剂</td></tr><tr><td>与 Alexa Fluor 488 标记的 BrdU 一抗</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B35130</td><td>用于在细胞增殖检测中可视化 BrdU</td></tr><tr><td>胶原蛋白 I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10483-01</td><td>用于包被盖玻片的蛋白质</td></tr><tr><td>压缩力测试仪</td><td>TestResources</td><td></td><td>用于量化聚合物机械性能的仪器</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>细胞培养基补充物</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33010-018</td><td>用于包被盖玻片的蛋白质</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2</td><td>荧光显微镜</td></tr><tr><td>Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（100X）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78440</td><td>蛋白酶和磷酸酶抑制剂</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23017015</td><td>用于包被盖玻片的蛋白质</td></tr><tr><td>含 DAPI 的封片剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36971</td><td>盖玻片封固剂及细胞核染色</td></tr><tr><td>小鼠 c-Jun 一抗</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>711202</td><td>用于可视化 c-Jun 蛋白的一抗</td></tr><tr><td>小鼠 &amp;beta;-肌动蛋白一抗</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3700S</td><td>Western 印迹实验的上样对照</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>细胞培养基补充物</td></tr><tr><td>光刻胶 SU 2010</td><td>KAYAKU</td><td>SU8-2010</td><td>光刻胶</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-2443</td><td>阻断非特异性蛋白结合</td></tr><tr><td>兔 c-Jun 一抗</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9165S</td><td>用于可视化 c-Jun 蛋白的一抗</td></tr><tr><td>兔髓鞘碱性蛋白一抗</td><td>Abcam</td><td>ab40390</td><td>用于可视化 MBP 的一抗</td></tr><tr><td>兔 p75NTR 一抗</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8238S</td><td>用于可视化 p75NTR 的一抗</td></tr><tr><td>罗丹明鬼笔环肽</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R415</td><td>细胞骨架可视化</td></tr><tr><td>RIPA 缓冲液</td><td>Abcam</td><td>ab156034</td><td>细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>RT4-D6P2T 施万细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-2768</td><td>实验中使用的细胞系</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 PDMS 基料与固化剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761036</td><td>用于包被盖玻片的可调聚合物</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15090-046</td><td>细胞解离试剂</td></tr><tr><td>紫外臭氧清洗仪</td><td>Novascan</td><td></td><td>提高 PDMS 的亲水性</td></tr><tr><td>Versene (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td>细胞解离试剂</td></tr></tbody></table>

可调细胞外基质微环境的制备用于评估施万细胞表型特化

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

目前，创伤性周围神经系统（PNS）损伤尚缺乏能够实现完全功能恢复的有效治疗方法。施万细胞（SCs）作为周围神经系统的主要胶质细胞，在损伤后通过去分化为具有再生能力的细胞表型，在促进周围神经再生过程中发挥关键作用。然而，去分化状态的施万细胞难以在神经再生所需的时间内维持，且易受到周围细胞外基质（ECM）变化的影响。因此，明确施万细胞与不同细胞外基质之间的复杂相互作用，以提供反映施万细胞再生潜能的信号线索，具有重要意义。为解决这一问题，本研究建立了一种策略：将不同的ECM蛋白吸附到可调节的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上，从而构建一个可调控刚度和蛋白成分的实验平台。将施万细胞接种于这些可调基底上，并检测代表施万细胞表型动态变化的关键细胞功能。为阐明施万细胞蛋白表达与细胞形态之间的相互关系，采用了不同接种密度的施万细胞，并结合微接触印刷的单细胞图案，通过免疫荧光染色和蛋白质印迹法进行表征。结果表明，细胞铺展面积较小、细胞伸长程度较高的施万细胞表现出更高水平的再生表型标志物。该方法不仅初步揭示了细胞外基质与施万细胞功能之间的显著关联，也为未来周围神经修复中生物材料的优化提供了指导依据。

为分析和量化基底刚度与蛋白质组成对干细胞表型的相互影响，开发了一种可调节的PDMS细胞培养基底（图1A）。通过在不同基础组分与固化剂比例下对聚合物进行压缩测试，以量化基底的杨氏模量（E）图1B）。所得的模量值范围代表了生理上相关的基质条件。基质制备完成后，将干细胞（SCs）培养于可调控的微环境中，并分析其细胞特性。首先分析了不同蛋白质成分基质上干细胞的增殖速率。结果显示，在层粘连蛋白包被的基质上，干细胞的增殖速率高于吸附胶原Ⅰ和纤连蛋白的基质，所有条件均在 10 µg/mL (图2A，B）。在具有层粘连蛋白涂层且模量不同的基底上培养的SCs显示，相对较软的基底（E=3.85 kPa）在所有条件下均会降低细胞增殖速率图2C，D）。然而，刚性基底（E=1119kPa）与相对较软的基底（E=8.67kPa）之间的差异无统计学意义（<stro...

该方法旨在阐明细胞外基质信号（如基质刚度、蛋白质组成和细胞形态）调控施万细胞（SC）表型的机制。

目前，创伤性周围神经系统（PNS）损伤尚无有效的治疗方法以实现完全功能恢复。施万细胞（SCs）作为……

本方案提供了一种细胞培养平台，可经济、便捷地精确控制细胞外基质的特性，如刚度、蛋白质组成以及细胞形态。该方法成本较低，无需特殊培训或设备，且与多种细胞定量方法兼容，例如免疫荧光染色和蛋白质印迹（western blot）。该技术为施万细胞生物学提供了机制层面的理解。结合对神经系统再生相关生物材料设计的进一步认识，该方法可应用于任何依赖贴壁生长的细胞。本实验方案中最具挑战性的部分是微接触印刷技术。在开始实验方案之前，使用荧光标记蛋白质在基底上进行微接触印刷，以直观验证最终印刷图案。首先用移液管尖剧烈混合PDMS基础弹性体与固化剂，直至气泡均匀分散在混合物中。然后通过真空干燥去除气泡。在方形或圆形盖玻片上滴加一滴干燥的PDMS混合物，将盖玻片置于匀胶机上以2,500 rpm转速旋转30秒。将盖玻片置于60摄氏度的烘箱中孵育一至两小时，或在室温下过夜。为制备微图案化基底，将带有图案的硅片放入一个直径150毫米、高15毫米的圆形培养皿中，并将脱气后的PDMS倒入硅片上。将PDMS在60摄氏度的烘箱中固化过夜。让PDMS冷却至室温。然后使用外科手术刀切割出30毫米×30毫米的方形印章，其中包含正确的图案，注意不要损坏硅片。将PDMS印章和可调盖玻片浸入70%乙醇中30分钟以进行灭菌。为验证微图案的效果，使用过滤的气流吹干PDMS印章表面，并用移液器将15微克/毫升的BSA溶液滴加至印章的整个图案面。在室温下孵育印章与BSA溶液1小时，使蛋白质吸附，随后将印章置于空气中干燥，以去除BSA溶液。使用过滤后的气流干燥可调盖玻片表面。将印章的图案面与可调盖玻片紧密贴合，使BSA在盖玻片表面吸附，并轻轻按压印章与盖玻片接触5分钟。使用配备FITC滤光片的荧光显微镜观察微图案。为了打印细胞黏附区域而非荧光图案，需用层粘连蛋白（laminin）替代BSA蛋白。将印章从盖玻片上取下，然后将盖玻片转移至已灭菌的六孔板中。每孔加入2毫升0.2% Pluronic F-127溶液，确保溶液覆盖盖玻片表面，并在室温下孵育1小时。吸弃F-127溶液，用PBS洗涤盖玻片5次，再用细胞培养基洗涤1次，随后以每平方厘米1000个细胞的接种密度接种施万细胞。细胞接种45分钟后，移除培养基并用PBS洗涤盖玻片2次，以防止多个细胞黏附于同一图案。将细胞在所需的培养环境中维持48小时后进行定量分析。为了制备用于观察排列细胞的线性图案化细胞培养基底，按照文稿中的说明制备印章，并将其切割至所需尺寸。准备两个如前所述涂有可调谐PDMS表面的培养皿，对其中一个培养皿进行微接触印刷，以印制出具有线性图案的细胞黏附区域。移除印章后，向培养皿中加入4毫升0.2% Pluronic F-127溶液，孵育1小时。用70%乙醇将PDMS印章每面冲洗三次，并用空气吹干。旋转PDMS印章，按照先前所述方法，将未图案化的细胞黏附区域打印到第二个培养皿上。在培养皿中加入F-127溶液孵育后，移除溶液，并用PBS洗涤三次，再用新鲜细胞培养基洗涤一次。然后将细胞接种到培养皿中，并在制备裂解液前于所需条件下培养48小时。制备裂解液时，先用预冷的PBS洗涤细胞2分钟，然后按照文稿说明配制RIPA溶液，每块细胞贴壁区域加入80 µL，并将细胞置于冰上孵育25分钟。用细胞刮板刮取许旺细胞5分钟，收集裂解液至预先标记的1.5 mL微量离心管中。在 12,000 × g 和 4 °C 条件下离心裂解液 15 分钟。收集上清液并转移至洁净的微量离心管中。与胶原蛋白和纤连蛋白包被的基质相比，层粘连蛋白包被的基质可实现更高的增殖速率。在具有层粘连蛋白涂层且模量不同的基质上培养的施万细胞显示，相对较软的基质会降低细胞增殖速率。同时还分析了细胞的蛋白质表达情况。随着基质变软，转录因子c-Jun的表达上调。然而，在最柔软的基质上，其表达显著下调。在较硬的基质上，胶原包被的基质导致c-Jun表达最高；随着基质变软，层粘连蛋白则表现出最高的c-Jun水平。随后，细胞经鬼笔环肽-罗丹明染色，以探究细胞铺展和面积在c-Jun表达中的作用。当在细胞培养基底上构建细胞黏附线条时，接种于图案化基底上的细胞其核长宽比相较于无图案基底上的细胞有所增加。在铺展面积较小的密集细胞中，c-Jun 和 p75 神经营养因子受体的表达均上调。与无图案细胞相比，线条图案化细胞中 c-Jun 和 p75 NTR 的表达水平也更高。通过微接触印刷技术构建细胞黏附几何图案，以精确控制细胞铺展面积和伸长程度，同时消除细胞间的相互作用。随着细胞长宽比的增加，细胞核的伸长程度也随之增加。c-Jun的表达水平因细胞伸长和细胞铺展受限而上调。针对细胞核和肌动蛋白的免疫荧光染色证实，通过该微图形化方法可精确控制细胞铺展面积和伸长程度。该技术为利用可调基底作为研究施万细胞生物学及其在再生和癌症背景下信号转导机制的分析方法奠定了基础。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

准备可调细胞外基质微环境，以评估施万细胞表型规范

我们演示了如何分离和培养鸡胚第4天的前庭耳蜗神经节以及第6天的脊髓外植体。外植体在无血清条件下于三维胶原凝胶中培养24小时。通过添加生长因子的培养基以及包被蛋白质的微珠来检测神经突的反应性。...

鸡胚前庭耳蜗神经节和脊髓组织块在胶原凝胶中的分离培养及其用于神经突起生长实验

本文描述了一种组合功能性筛选方法，用于深入了解微环境分子组成对细胞功能的影响。该方法利用现有的基于微阵列的技术，构建支持细胞黏附和功能分析的、具有明确组合特征的微环境阵列。...

微环境微阵列（MEArrays）的制备与应用

本视频展示了一种从多能骨髓基质细胞（BMSCs）获取类似施万细胞的方法。首先，BMSCs接受低氧处理，随后定向分化为神经前体细胞。接着，采用特定的培养基和培养条件，诱导这些前体细胞转化为类似施万细胞的细胞。...

由骨髓基质细胞生成施万细胞样细胞

该视频展示了背根神经节（DRG）神经元与施万细胞的共培养过程。首先将DRG神经元培养在预先拉伸的膜上，以促进轴突的定向生长。随后引入施万细胞，这些细胞会附着在轴突上，起到绝缘作用，并促进神经细胞的存活与功能维持。...

在预拉伸膜上进行施万细胞与背根神经节神经元的共培养

该视频介绍了用于研究细胞表型特化的微图形基底的制备方法。使用蛋白质包被的微图形PDMS印章，将微图形转移至PDMS包被的盖玻片上。随后用表面活性剂处理盖玻片，以抑制细胞在非目标区域的黏附。然后加入细胞，使其沉降并附着于图形区域，再进行培养以供后续分析。...

制备微图形化基底以研究施万细胞表型

本文介绍了一种施万细胞（SC）迁移实验方法，其中施万细胞能够沿着延伸的轴突进行迁移和发育。...

分析沿生长轴突的小鼠许旺细胞发育

上皮-间质转化（EMT）使癌症细胞获得侵袭能力。为研究EMT，可采用基于神经干细胞（NSC）的方法 体外...

一种适用于药物发现的无酶无血清神经干细胞培养模型用于EMT研究

本方案描述了从大鼠分离背根神经节（DRG）神经元，并在静态预拉伸细胞培养系统上培养DRG神经元以增强轴突排列，随后与施万细胞（SCs）共培养以促进髓鞘形成的实验方法。...

一种增强背根神经节神经元轴突排列与髓鞘形成的方法

骨髓中存在具有神经潜能的骨髓基质细胞（MSCs）。本方案通过低氧预处理富集此类细胞群体，随后诱导其分化为成熟的施万细胞。...

骨髓来源祖细胞的缺氧预处理作为生成成熟施万细胞的来源

本文描述了制备用于高通量操控模拟物理与化学信号的多重人工细胞微环境（MACME）阵列的详细方法 体内...

构建多重人工细胞微环境阵列

本文提供了一种在三维基质中分析生长轴突行为的方法，以模拟其自然发育过程。...

生成基于三维胶原的水凝胶以分析神经系统发育过程中的轴突生长与行为

学习利用可调细胞外基质微环境评估施万细胞表型规范的方法，通过微接触印刷技术精确控制基质刚度、蛋白组成和细胞形态，为神经再生生物材料设计提供机制性见解。

可调细胞外基质微环境的制备用于评估施万细胞表型特化

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