准备可调细胞外基质微环境，以评估施万细胞表型规范
June 2nd, 2020
这种方法旨在说明细胞外基质线索（如基板刚度、蛋白质成分和细胞形态）调节Schwann细胞（SC）表型的机制。
该协议提供了一个细胞培养平台，可以以经济高效、简单的方式精确控制细胞外基质（如刚度、蛋白质组成和细胞形态）的特性。该方法具有成本效益，不需要特殊培训或设施。它还与多种细胞定量方法（如免疫荧光染色和西印）兼容。
这项技术提供了对施万细胞生物学的机械理解。通过更深入地了解神经系统再生的生物材料设计，它可以应用于任何锚地依赖细胞。该协议最具挑战性的部分是微联系打印。
在协议开始之前，使用荧光标记的荧光在基材上进行微触觉打印，以直观地验证最终打印到图案。首先，将 PDMS 基质弹性体和固化剂与移液器尖端进行大力混合，直到气泡均匀分散在混合物中。然后用真空干燥去除气泡。
将干燥 PDMS 混合物滴放在方形或圆形盖玻片上，并在转速为 2，500 rpm 的旋转涂装机上旋转盖玻片 30 秒。在60摄氏度的烤箱中孵育盖玻片一至两个小时，或在室温下过夜。要准备微图案基板，请将图案硅晶片放在直径为 150 毫米的圆形 15 毫米高培养皿内，然后将脱气的 PDMS 倒入晶圆上。
将 PDMS 在 60 摄氏度的烤箱中凝固过夜。让 PDMS 冷却到室温。然后使用手术手术刀切割300百分之30毫米的圆章，其中包含正确的图案，注意不损坏硅晶片。
消毒PDMS邮票和可调盖单，浸入70%乙醇30分钟。为了确认微表型的功效，使用过滤的空气流和移液器每毫升 BSA 溶液干燥 PDMS 邮票的表面，以覆盖邮票的整个图案侧。在室温下用 BSA 溶液孵育邮票一小时，以允许蛋白质吸附，然后风干邮票以去除 BSA 溶液。
使用过滤的空气流干燥可调式盖滑的表面。将图带面与可调盖玻片进行一致接触，使 BSA 吸附在盖玻片表面上，然后轻轻地将盖板压在盖玻片上 5 分钟。使用带 FITC 过滤器的荧光显微镜检查显微模式。
打印细胞粘合区域，而不是荧光图案，用层明代替BSA蛋白。从盖单上取下邮票，将盖滑移入消毒的六孔板中。将两毫升0.2%的Pluronic F-127溶液加入到每口井中，覆盖盖滑表面，并在室温下孵育板一小时。
吸气F-127溶液，用PBS洗涤盖滑五次，一次用细胞培养基，然后以每厘米1000个细胞的种子密度播种Schwann细胞。细胞播种后45分钟，取出细胞培养，用PBS洗涤盖滑两次，以防止多个细胞粘附于相同的模式。在定量前，在所需的细胞培养环境中维护细胞48小时。
要创建线型细胞培养基板，用于检查对齐的细胞，请根据手稿方向制作邮票，并将它们切割到所需的尺寸。如前所述，准备两个涂有可调 PDMS 表面的 Petri 盘，并在其中一个盘上进行微接触打印，以打印线型细胞粘合区域。取出邮票后，用四毫升0.2%的普鲁里F-127溶液填充培养皿，并孵育一小时。
用 70% 乙醇冲洗 PDMS 邮票的每一侧三次，然后用空气干燥。旋转 PDMS 图章，并打印第二个 Petri 盘上的未图案细胞粘合区域，如前所述。使用 F-127 溶液孵育菜肴后，取出溶液，用 PBS 洗三次，用新鲜的细胞培养培养本洗一次。
然后在盘子上播种细胞，并在准备落酸之前在所需的条件下保持48小时。要准备裂解物，用冰冷的PBS清洗细胞两分钟，然后根据手稿说明将80微升的RIPA溶液添加到每个细胞粘合区域，并在冰块上孵育细胞25分钟。用细胞刮刀刮取Schwann细胞5分钟，将赖酸盐收集到标有1.5毫升的微离心管中。
在12000°C和4摄氏度下将酸盐离心15分钟。收集上清液，并转移到一个干净的微离心管。与胶原蛋白和纤维素涂层基材相比，层宁涂层基材的增殖率更高。
具有层压涂层和不同模态的基材上的Schwann细胞表明，相对较软的基质降低了细胞增殖率。细胞也分析蛋白质表达。随着基板变软，转录因子c-Jun表达被调高。
然而，在最软的基材上，它受到的调节明显降低。在刚性基材上，胶原蛋白涂层基材产生最高的c-Jun表达，因为基材变软，层压素表现出最高水平的c-Jun。然后，细胞被染色的罗达明-法罗酮，以探索细胞扩散和区域在c-Jun表达中的作用。
在细胞培养基材上创建细胞粘合线时，与未模式基材上细胞相比，在图案基材上播种的细胞的核纵横比有所提高。c-Jun和p75神经营养素受体的表达在扩散面积较小的致密细胞中被调节。与非模式细胞相比，线型细胞还导致c-Jun和p75 NTR的表达更高。
微触觉印刷细胞胶粘剂几何形状被创建，以精确控制细胞的扩散面积和伸长，同时消除细胞与细胞的相互作用。增加细胞长宽比导致核伸长增加。c-Jun的表达通过细胞伸长和细胞扩张抑制作用得到调节。
核和行动素的免疫荧光染色证实，细胞扩散面积和伸长是通过这种微模式方法精确控制的。这项技术为利用我们的可调基板作为机械分析Schwann细胞生物学和再生和癌症背景下信号的方法铺平了道路。
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概览
这种方法说明了细胞外基质提示，包括基底硬度、蛋白质组成和细胞形态如何调控施万细胞表型。该协议以成本效益的方式对这些属性进行精确控制。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 再生医学
背景
- 施万细胞在神经再生中扮演着关键角色。
- 细胞外基质属性影响细胞行为。
- 理解这些机制可以增强生物材料设计。
- 该方法无需专门培训即可使用。
研究目的
- 提供研究施万细胞生物学的平台。
- 探索基质属性对细胞表型的影响。
- 促进神经系统再生的进展。
使用的方法
- 用于控制基质属性的细胞培养平台。
- 用于精确图案化的微接触印刷。
- 用于细胞定量的免疫荧光染色。
- 用于蛋白质表达评估的蛋白质印迹分析。
主要结果
- 证明了基底硬度对施万细胞行为的影响。
- 识别了影响细胞表型的关键蛋白质组成。
- 提供了对施万细胞机制理解的见解。
- 显示与各种细胞定量方法的兼容性。
结论
- 该协议为研究施万细胞提供了可靠的方法。
- 获得的见解可以为神经修复的生物材料设计提供信息。
- 该方法适用于其他依赖锚定的细胞。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise control of extracellular matrix properties to mechanistically dissect Schwann cell phenotype specification, a critical step in peripheral nerve regeneration. By decoupling substrate stiffness, protein composition, and cell morphology, it provides a tunable platform for target validation in neuroregenerative drug discovery. The approach supports predictive confidence in lead identification by linking ECM cues to regenerative phenotypic markers such as c-Jun and p75 neurotrophin receptor expression.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how ECM stiffness and protein composition regulate Schwann cell dedifferentiation and regenerative phenotype.
- Operational Value: Provides a reproducible system to assess target engagement of compounds aimed at modulating Schwann cell plasticity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of cellular morphology and protein expression under defined ECM conditions.
- Operational Value: Compatible with immunofluorescence and western blot, enabling standardized assay development for high-content screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by elucidating how biomaterial properties influence Schwann cell behavior relevant to nerve repair.
- Operational Value: Facilitates preclinical model development using tunable substrates to mimic injury microenvironment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of ECM-targeted modulators of Schwann cell phenotype prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating the effects of stiffness and ligand composition on c-Jun and p75 NTR signaling.
- Screening: Delivers assay-ready platforms with controlled cell spreading and elongation for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variables including nuclear aspect ratio, cellular elongation, and protein expression levels for statistical comparison.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by informing biomaterial design for peripheral nerve regeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability across anchorage-dependent cell types, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in ECM-cell signaling.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility across labs through defined microcontact printing and substrate tuning protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of compound effects on Schwann cell regenerative state.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neuroregenerative candidates based on phenotypic modulation in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microcontact printing and PDMS handling for pattern fidelity.
- Depends on access to spin coaters, vacuum desiccators, and fluorescence microscopy for substrate preparation and validation.
- Necessitates cross-team standardization of seeding densities, incubation times, and quantification methods to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when extending to other cell types or ECM proteins beyond laminin, collagen, and fibronectin.
- Limited by the technical challenge of microcontact printing, which affects throughput and pattern consistency.
