糖精中遗传链接调控时间寿命的抑制 器屏幕

衰老的特点是多个细胞过程的时间依赖性恶化，最终增加机体死亡的概率。在种群中，这个过程是可变的，许多遗传和环境因素都会影响它。研究和理解的变量之一是饮食对寿命的作用。

饮食限制是一种干预，最终延缓衰老和衰老相关变化的开始。这增加了生物体的寿命和健康跨度，或生物体有正常、健康寿命的时间长度。我们目前的理解已经导致识别一组独特的细胞变化，这些变化被称为衰老的标志，如突变的积累、端粒的失调、蛋白质平衡的丧失、呼吸问题和活性氧物种等。

现在，这种理解大部分来自使用许多不同的模型生物体的研究。有许多基因筛选已经确定了既缩短又延长寿命的基因。其中包括在萌芽酵母糖精，这是这种方法的重点的研究，以及研究更复杂的多细胞生物，如C.elegans和穆林系统。

其中，初露头角的酵母特别适合衰老研究，因为它的自然寿命短，并且有许多基因方法可以解开复杂的遗传关系，因此它成为衰老遗传学功能解剖的极佳系统。酵母可用于研究衰老的几个不同方面。我们将专注于时间寿命，这是细胞可以生存的持续时间。

这项工作的目的是提出一个直接的遗传方法，以执行一个过度表达抑制器屏幕。我们将利用一个遗传背景，导致异常缩短的时间寿命。我们将利用有针对性的方法来识别能够挽救或抑制缩短寿命表型的基因，尝试识别能够恢复正常寿命的基因。

第一个遗传背景是酵母的自噬缺陷菌株。自噬，松散地转化为自食，是一个细胞内降解系统，提供细胞类产品，如蛋白质和细胞器，到叶索体。这有助于通过消除受损的蛋白质以及那些已经过活的蛋白质来维持细胞平衡。

我们将与一个突变菌株，有一个删除的A8G1基因。ATG1 编码为蛋白质丝氨酸/三环蛋白激酶，是囊泡形成和自噬在细胞质到囊体靶向途径中所需的。ATG1 空突变体具有异常短的时间寿命的表型。

在这个老化的实验室中，我们将设计和测试能够挽救或抑制 ATG1 空突变体异常缩短寿命特性的遗传因子。然而，这也可以扩展到其他短命的遗传背景。这个过程的第一步是确定一个与延长寿命相关的基因。

我们将特别关注那些过度表达时延长时间寿命的基因。为此，我们将使用可从酵母基因组数据库中访问的公共数据。我们要上前

按表型搜索。中途下来，我们将看到我们可以选择按时间顺序排列的寿命。为了寻找能延长寿命的基因，你可以看到大量数据，这些数据与这个特殊的表型有关。

今天，我们将研究S SIR2，一种组蛋白Lysine去乙酰酶，当它被过度表达时，它与延长的时间寿命有关。我们将要做的第一件事是访问编码区域的DNA序列，以及该基因两侧的调控区域。我们将采取400个基地对上游和下游，以确保我们涵盖所有监管区域。

我们将使用此DNA序列设计PCR底基因，使我们能够克隆这个基因到我们的质粒载体。我们将使用PCR来放大我们的基因，并克隆到pRS315载体。为此，我们将设计包含包含 HindIII 和 SacII 限制站点的限制消化站点的底像。

如您所看到的，质粒包含两个限制站点，HindIII 和 SacII，这将促进我们的克隆。您应该将 PCR 底转器设计成包含大约 21 或 22 个序列核苷酸，以补充要放大的区域。除了序列之外，您将在五个素端添加适当的限制位点，无论是前底上是 HindIII，还是反向底像上的 SacII，分别以红色和紫色显示，然后进一步上游，添加几个核苷酸，允许限制酶结合，以更高的效率创建限制消化位点。

在丰富的介质中，如YPAD中，一夜之间将野生型酵母培养成五毫升的培养， 以后日志阶段。使用专用于真菌基因组分离的商用试剂盒收获基因组DNA。重要的是，该套件是特定的酵母，因为他们有一个非常僵硬和艰难的细胞壁渗透。

Zymolyase治疗在消化细胞壁方面是有效的，大大提高了基因组产量。使用分光光度计确定DNA的数量和质量。为了产生适合克隆的安培，有必要利用高保真PCR聚合酶来避免在扩增过程中发生突变。

有许多不同的高保真PCR套件，是市售。为了便于优化反应，我们建议选择一个提供多个缓冲系统的套件，一个是标准高保真度缓冲器，一个针对复杂安普利孔中的高GC含量进行了优化。我们将添加200纳米的基因组DNA。

我们将添加五微升的缓冲器。我们将添加 2 1/2 微升的前锋和反向底数。我们将添加一个微升的聚合酶，两个微升的DNTP。

最后，我们将对50微升与无菌蒸馏水的整个反应进行QS。我们将根据我们使用的酶以及我们在这个实验中设计的底向器的特定协议运行反应。清理并浓缩 PCR 反应。

在选择性培养下一夜之间种植五毫升大肠杆菌。通过离心来培养文化，摒弃上经剂。在提供的超热带缓冲液中重新填充和细胞的 5 分钟。

中和反应，通过反转混合两者五、六次。以最高速度将样品离心10分钟。将上流液转移到二氧化硅柱上，然后用提供的缓冲液清洗。

丢弃流经，用其他适当的缓冲器重复洗涤，在两者之间进行 30 秒离心，在每次缓冲后丢弃流。最后，多离心机两分钟，取出任何残留乙醇，将质粒洗入20微升洗脱缓冲液，然后通过分光光度计确定数量和质量。现在是设置向量和插入的限制消化的时间。

加入625纳米的DNA，无论是载体还是插入物，5微升的切智能缓冲液，一个Saki的微升，一个HindIII的微升，和QS与水的反应，使最终反应量达到50微升。在37摄氏度下孵育约束消化液3小时，然后孵育80摄氏度20分钟加热和激活酶。此时，在进入下一步之前，摘要可以存储四度。

接下来，我们将使用我们消化的基因组片段以及我们刚刚完成的载体建立一个15微升的结扎。我们先加六小升水。我们将添加两个微升的消化载体。

这是我们的pRS315质粒。我们将添加四个微升的插入物，SIR2基因。我们将添加两个微升的连体缓冲器，大小写为 10X 缓冲器。

最后，我们要添加一个微升的连体。我们要在一夜之间在16度孵化，然后在80摄氏度下加热杀死酶20分钟。为了筛选我们成功创建的质粒，我们将将其转换为大肠杆菌。

我们将使用50微升的化学能力细胞。我们将在冰上解冻它们，一旦它们解冻，我们将添加我们的结扎反应，我们将添加它的全部内容。因此，我们将添加15微升的连接与插入，我们将添加15微升的不插入控制，以及一个单独的反应。

添加后，轻拂管子几次以混合。我们要在冰上孵化这个在完成30分钟的冰上孵育后，我们将将样品加入一个42度的加热块，在那里我们将孵育和热冲击20秒，这一点我们将把它们拿出来，我们将添加恢复介质。

热休克后，我们将允许一个恢复期。我们将采取我们的样本，我们将添加450微升的S一种S、100微升的S、1。。我们将在37摄氏度下孵育这些质粒，让质粒被拾起，并允许安西林抗性基因开始表达。

我们将允许这些样品在37度恢复45分钟。孵育后，我们设置了一系列的稀释，一到十，一到一百，我们将板这些在LB/Amp介质，让细胞在一夜之间成长。我们将用无菌技术来镀制它们。

我们将采取适当的板，我们已经相应地标记，并包含我们的可选标记。我们将采取150微升我们改造的大肠杆菌。使用无菌接种循环，然后我们将轻轻地将细胞在整个和整个板中传播，这样我们就会获得一个很好的均匀分布。

一旦我们完成了所有稀释的电镀，我们将在37摄氏度的温度下孵育这些板，看看生长什么。大约一天后， 我们应该看到殖民地长大， 希望包含我们试图创造的质粒。他们应该看起来像这样。

使用无菌技术，接种潜在的转化剂，从您的转化为五毫升LB加安西林后，前面概述的程序。将质粒与每一个潜在的转化剂隔离，并运行如前所述的限制消化。在阿加罗斯凝胶上运行反应产品，将潜在的转化剂与空向量进行比较。

保存任何导致切除适当尺寸的刀片的转化剂，以便进一步研究。成功创造了我们的质粒，我们将把它转换成 ATG1 空酵母背景。我们要取出15密耳的细胞，然后把它们打下，我已经在这里做了。

颗粒化后，取出它们生长的YPAD介质，用蒸馏水清洗细胞。之后，我们将采取细胞，我们将重新暂停在100毫摩尔锂醋酸锂。我们将重新暂停200微升。

通过轻轻的上下移液重新暂停细胞颗粒。将细胞分成单独的微模糊管，用于每次转换的50微升。对于每个变换，您需要添加 240 微升 50% PEG。

PEG是非常粘稠的，移液器和测量非常仔细。添加PEG后和每个附加组件后通过移液混合。接下来加入36微升的一摩尔醋酸锂，五微升的鲑鱼精子DNA，或其他载体DNA，已经煮了五分钟，放在冰上，最后五微升质粒的质粒，你将执行每次转换。

涡流每个管彻底混合。在30摄氏度下孵育样品45分钟。热在42摄氏度时加热10分钟，然后在无菌水中清洗细胞一次，最后在200微升无菌水中重新吸收。

将酵母和板 150 微升的每个转化菌株的稀释 1 到 10 和 1 到 100 稀释到 SC 减 leu 板上，为质粒选择。均匀地均匀地分布细胞，让细胞在倒置和孵育30摄氏度之前干燥，使它们生长48至72小时。一旦我们成功克隆了我们的基因进行测试，我们将测试对生物体时间寿命的影响。

我们将种植酵母，监测存活的菌落形成单位的数量，这些单位仍作为时间函数。首先在SC减去李氨酸液体介质中种植酵母72小时，在30摄氏度下摇动。使用血细胞计，确定所需的稀释，以便允许您板500个细胞。

使用无菌技术，将细胞板到SC减去leu板上，使其在30摄氏度下干燥和孵育三天，此时它们就会长大，你可以得分的菌群生长并记录这个时间点。制作板后，继续孵育酵母在30摄氏度，没有颤抖。最初，我们每周重复电镀，如果我们的初步数据表明抑制老化的表型，则采取更频繁的时间点。

为了确定可行性百分比，我们规范化到分析的第一天时间点。确保在每个间隔进行相同的稀释。继续这个过程，直到你不再看到任何殖民地成长。

将您的信息输入 Excel 电子表格会很有帮助。这将允许您在实验结束时快速确定每种菌株的可行性。