Name: 利用两色单分子荧光在原位杂交中Escherichia coli探索大肠杆菌中空间和时间中的 mRNA 动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 探索双色单分子荧光原位杂交技术，用于定量分析大肠杆菌中mRNA转录与降解动力学。该方法可同时处理48个样品，在8小时内完成成像，为细菌基因表达调控研究提供高效工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

该实验方案由 S.K. 在耶鲁大学霍华德·休斯医学研究所及微生物科学研究所 Christine Jacobs-Wagner 博士实验室进行博士后研究期间开发。我们感谢 Jacobs-Wagner 博士及其实验室成员在方法开发过程中提供的各种帮助，以及 Laura Troyer 对稿件的审阅。S.K. 感谢 Searle 学者项目的支持；K.V. 感谢伊利诺伊大学 James Scholar Preble 研究奖的支持。

1. smFISH 探针的制备
注意：若要使用单一荧光染料标记 smFISH 探针，请遵循基于 NHS 酯化学法标记核酸寡核苷酸的标准实验方案21。
<ol>
	<li>设计单分子FISH探针。确定使用“平铺”探针还是“阵列”探针（图1) 用于目的基因。参见 讨论 关于如何做出决策的部分
	<ol>
		<li>对于“拼接”探针（图1A），使用在线探针设计工具（例如，参见 材料表).</li>
		<li>对于“array”探针（图1B），进行BLAST序列比对，以确保探针序列不与其他任何mRNA序列互补。</li>
		<li>为了研究 lacZ mRNA转录与降解动力学，使用两组24个探针，每组分别覆盖转录本的前1 kb和后1 kb区域 lacZ (3,072 bp)19. 
		注意：以下这些探针组分别简称为“5’ mRNA 探针”和“3’ mRNA 探针”。这些探针的序列列于 材料表.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以5’端带有C6氨基连接臂的DNA寡核苷酸形式订购探针序列。将各探针溶于水，配制成1 mM溶液。</li>
	<li>将“5’ mRNA 探针”和“3’ mRNA 探针”组的探针等摩尔量混合。例如，对于5’ mRNA探针组 lacZ，混合 20 µL 每种探针（该组探针共24种）。</li>
	<li>进行乙醇沉淀22 去除混合探针中可能存在的伯胺和仲胺类污染物（如Tris、甘氨酸和铵盐），以免抑制偶联反应。最后，将DNA沉淀溶解于 100 µL 水（得到约 4.5 mM 的 DNA 探针组）。 
	注意：即使探针已由生产商进行标准脱盐纯化，也建议执行此步骤。可使用基于滤膜的标准纯化方法替代或结合乙醇沉淀进行纯化。</li>
	<li>选择两种光谱不同的带有单功能NHS酯基团的荧光染料，以便对5’和3’ mRNA探针组进行差异化标记。例如，使用Cy5 NHS酯标记5’ mRNA探针，使用Cy3B NHS酯标记3’ mRNA探针。将每种荧光染料溶于无水DMSO中，配制成终浓度为20 mg/mL（约25 mM）的溶液。</li>
	<li>每次标记反应前新鲜配制 0.1 M 碳酸氢钠（pH 8.5）。长时间暴露于空气中会降低其 pH 值，从而降低标记效率。</li>
	<li>对于偶联反应，混合以下成分： 15 μL Cy5荧光染料储备液（来自步骤1.5）， 4 μL 来自第1.4步的5’ mRNA探针组 75 μL 碳酸氢钠（来自步骤 1.6），以及 7 μL 加水。用铝箔纸包裹试管，在室温下振荡3-6小时。 
	注意：延长孵育时间并不一定会提高标记效率。此外，只要保持各组分的浓度不变，反应体系可按比例放大或缩小。</li>
	<li>对3’ mRNA探针组及相应的荧光染料（即Cy3B NHS-酯）重复上述步骤。</li>
	<li>进行乙醇沉淀22 以去除未反应的染料分子。将沉淀物溶解于约 ~50 μL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，含1 mM EDTA）</li>
	<li>使用紫外-可见分光光度计估算 DNA 和荧光染料的浓度。
	<ol>
		<li>在 260 nm 以及 559 nm（Cy3B）或 649 nm（Cy5）处测定吸光度。若样品浓度过高导致无法获得准确测量值，可进行稀释 1 µL 样品的 10 µL.</li>
		<li>将吸光度转换为浓度： 
		<img alt="DNA定量公式，260 nm处吸光度，浓度计算方程，分子生物学" src="/files/ftp_upload/61520/61520eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
		<img alt="Cy5浓度方程，649 nm处的吸光度，稀释因子，用于光谱分析。" src="/files/ftp_upload/61520/61520eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"> 
		<img alt="Cy3B 浓度计算公式；分光光度分析图中的吸光度计算" src="/files/ftp_upload/61520/61520eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 3"> 
		εDNA = 0.2 μM-1 （对于20个核苷酸的单链DNA），εCy5 = 0.25 μM-1，和 εCy3B = 0.13 μM-1 
		注意：[DNA] 是指溶液中总探针的浓度，单个探针的浓度约为该浓度的 1/24。此后提及的“探针浓度”均指总探针浓度。若 [DNA] 与 [dye] 的比值为 1，则可省略后续的高效液相色谱（HPLC）步骤23，并将样品稀释至最终 4-5 μM 在TE缓冲液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>（推荐）使用高效液相色谱法（HPLC）将标记的探针与未标记的探针及游离染料分离纯化。 
	注意：尽管此额外纯化步骤将导致样品损失，但有利于后续应用。去除未标记的DNA探针可增强来自mRNA靶标的荧光信号，而去除未反应的染料可降低背景荧光。
	<ol>
		<li>使用标准分析型C18色谱柱，以0.1 M三乙基乙酸铵（TEAA）作为流动相A，乙腈作为流动相B，准备高效液相色谱系统。</li>
		<li>向样品（来自步骤 1.9）中加入 1 M TEAA，使其终浓度为 0.1 M TEAA。</li>
		<li>设置梯度程序如下：0–5 分钟，0% B；5–35 分钟，B 相从 0% 线性梯度升至 30%；35–37 分钟，B 相从 30% 线性梯度升至 100%；37–40 分钟，0% B。保持流速为 0.1 mL/min，并在 260 nm 和 649 nm（适用于 Cy5 标记样品）或 260 nm 和 559 nm（适用于 Cy3B 标记样品）处记录色谱图。</li>
		<li>当DNA和荧光染料通道的吸光度均升高时，收集洗脱的样品。</li>
		<li>使用真空浓缩仪浓缩洗脱的样品，并将沉淀重悬于 50-100 μL TE缓冲液</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用紫外-可见分光光度计检测DNA和荧光染料的浓度（参见步骤1.10）。如有必要，进行稀释，使最终浓度约为4-5 µM-20°C 保存探针20 °C</li>
</ol>
2. 溶液的配制
<ol>
	<li>准备大量经DEPC处理的水和缓冲液（表1）。这些溶液在室温下可保存一年以上。</li>
	<li>配制4倍固定液和洗涤液（表1）。</li>
	<li>配制预杂交液和探针杂交液（表1）。在第5.1步或第6.1步孵育期间配制探针杂交液，随后将溶液置于37 °C台式摇床上，加盖避光孵育20–40分钟。 
	注意：甲酰胺、SSC和探针的浓度已针对lacZ探针组进行优化，以在最大化真实信号的同时尽量减少背景荧光。有关针对不同应用调整这些浓度的详细信息，请参见讨论部分。</li>
</ol>
3. 盖玻片和载玻片的准备
<ol>
	<li>清洗盖玻片和载玻片。
	<ol>
		<li>使用镊子将单个盖玻片和载玻片放入考普林瓶中。确保盖玻片和载玻片彼此分离，不相互接触。</li>
		<li>向瓶中加入100%乙醇并盖上盖子。将瓶子放入水浴超声波清洗机中，超声处理15–20分钟。 
		注意：使用水浴超声波清洗机时，建议关闭加热功能。</li>
		<li>倒出乙醇，并用超纯水冲洗3–4次。使用直接从水纯化系统流出的水。</li>
		<li>倒出瓶中的水，加入70%乙醇。盖上盖子，超声处理15–20分钟，然后用超纯水冲洗。</li>
		<li>向瓶中加入超纯水，并超声处理15–20分钟。 
		注意：盖玻片和载玻片可在装有超纯水的考普林瓶中过夜保存。</li>
		<li>用洁净的镊子从考普林瓶中取出载玻片或盖玻片，并用N2气体吹干。对剩余的载玻片和盖玻片重复此操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将干燥的载玻片放入洁净的储存盒中，待第7.5步使用。将干燥的盖玻片放入一个空的1,000-μL移液器吸头盒中，该盒子将在后续操作中作为“反应室”使用。</li>
	<li>使用疏水性标记笔，根据移液器吸头盒上的圆形孔洞在盖玻片上画圆圈。这些圆圈（直径约0.5 cm）将作为“微孔”。至少等待5–10分钟，使标记笔墨完全干燥。 
	注意：始终确保吸头盒的盖子处于关闭状态。</li>
	<li>向每个微孔中加入20-μL的0.1%多聚赖氨酸（poly-L-lysine）液滴。在室温下孵育10–50分钟。 
	注意：根据微孔大小调整该体积。确保溶液完全覆盖微孔区域。若孵育时间较长，需注意避免蒸发。</li>
	<li>孵育结束后，小心吸除多聚赖氨酸溶液，避免接触表面，以免刮掉涂层。然后向经多聚赖氨酸处理的微孔中加入一滴（约20 μL）DEPC处理水。关闭“反应室”的盖子，防止蒸发，直至第5.1步。</li>
</ol>
4. 时间序列实验与样品固定
<ol>
	<li>在250 mL三角瓶中，将大肠杆菌（E. coli）细胞接种于约20 mL液体培养基中进行培养。将三角瓶置于30 °C水浴摇床中持续振荡培养，仅在取样时暂停摇动。 
	注意：本文所示结果均来自在M9基本培养基（添加0.2%甘油、0.1%酪蛋白氨基酸和1 mg/L硫胺素）中培养至对数生长期（OD600~0.2）的MG1655细胞。</li>
	<li>在空的1.5 mL离心管中加入250 µL 4倍固定液。根据实验所需取样时间点的数量，重复操作，准备相应数量的离心管。用时间点编号标记各管，并置于室温下备用。</li>
	<li>在开始时间序列实验前，取750 µL细胞培养物（OD600~0.2），加入步骤4.2中标记为“零时”的离心管中。轻轻颠倒混匀，使细胞与固定液充分混合。 
	注意：切勿通过反复吹打、涡旋或剧烈操作来混匀细胞。该样品代表基因抑制状态，将作为对照用于计算单个mRNA的荧光强度（见步骤9.4）。</li>
	<li>向液体培养物中加入0.02–1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），以诱导lacZ基因表达。从此刻起启动计时（t = 0 min），并按预定时间间隔（例如每1分钟）取样。取样时重复步骤4.3操作。</li>
	<li>在时间序列实验的某一时间点（例如t = 1.5 min），向培养物中加入5 mM邻硝基苯-β-D-呋喃半乳糖苷（ONPF）或500 mM葡萄糖24，以重新抑制lacZ基因表达。再次抑制后，继续按步骤4.3取样，以追踪mRNA的降解过程。 
	注意：也可使用约400 µg/mL利福平（一种转录起始抑制剂）实现抑制25。</li>
	<li>进行固定：将含有取样细胞的离心管在室温下孵育15分钟，随后置于冰上孵育30分钟。</li>
	<li>为去除固定剂，将离心管在室温下以4,500 x g离心4分钟，随后用移液器小心吸除上清液。 
	注意：必须按照安全规程将甲醛废液弃置于专用废液容器中。</li>
	<li>加入1 mL DEPC处理的PBS缓冲液重悬细胞。重复离心和重悬操作共3次（包括本步）。 
	注意：固定后的细胞较为脆弱，需轻柔操作。重悬沉淀时应小心，避免产生气泡。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将细胞重悬于约30 µL DEPC-PBS缓冲液中。</li>
</ol>
5. 细胞膜的通透化
<ol>
	<li>将每个时间点的样本分别加入盖玻片的不同孔中（每孔约 30 μL）。室温下静置 10–30 分钟，使细胞贴附于表面。避免各孔之间的液滴合并。</li>
	<li>为洗去未结合的细胞，吸除液体，并向每孔加入约 20 μL DEPC PBS。数分钟内吸除 DEPC PBS。</li>
	<li>向每孔加入 15 µL 70% 乙醇，作用 4 分钟以通透细胞膜。4 分钟后吸除乙醇，并确保各孔完全干燥。 
	注意：乙醇处理时间必须严格控制在 4 分钟。处理时间过长会导致过度通透。</li>
	<li>向每孔加入 30 µL 洗涤液。</li>
</ol>
6. 探针杂交
<ol>
	<li>吸去每孔中的洗涤液。向每孔中加入 30 µL 预杂交溶液。将孵育板置于 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。 
	注意：在孵育板底部加入约 50 mL 水以保持湿度。</li>
	<li>吸去每孔中的预杂交溶液。向每孔中加入约 30 µL 探针杂交溶液。用铝箔包裹孵育板，置于 37 °C 培养箱中孵育 2 小时。 
	注意：请确保探针杂交溶液在操作前已在 37 °C 恒温振荡器中预热。避免不同孔之间的液体交叉污染。如有需要，可减少每孔加样体积。</li>
</ol>
7. 杂交后洗涤及成像前准备
<ol>
	<li>使用多通道移液器，一次性向每个孔中加入约 30 µL 洗涤液。吸去液体并重复洗涤 3–5 次。将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 15–30 分钟。</li>
	<li>再重复步骤 7.1 两次。</li>
	<li>用 DEPC-PBS 洗涤每个孔 5 次。采用步骤 7.1 中使用的方法，但跳过孵育过程。</li>
	<li>吸去盖玻片上的液体。向每个孔中加入 4 µL DEPC-PBS。</li>
	<li>使用镊子将盖玻片提起并翻转，轻轻放置在玻璃载玻片（来自步骤 3.2）上。避免产生气泡。</li>
	<li>用硅胶牙科胶密封盖玻片边缘。</li>
	<li>等待胶体完全固化。此处可暂停操作，并将载玻片在 4 °C 下保存过夜。 
	注意：其他单分子荧光原位杂交（smFISH）方案建议添加氧清除试剂（例如葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶）或使用商用抗荧光淬灭封片介质14,26，以提高荧光染料的光稳定性。</li>
</ol>
8. 成像
<ol>
	<li>使用相差成像的实时模式寻找目标区域。通过操纵载物台操纵杆，在孔内切换视野。选择一个细胞密度适宜的区域（即存在大量且多数相互分离的细胞）。调节 z 轴焦距，使相差成像中的细胞图像清晰对焦。</li>
	<li>按以下顺序拍摄图像：Cy5（4 秒曝光）、Cy3（2 秒曝光）和相差成像（0.2 秒曝光）。 
	注意：Cy3B 染料分子在 Cy3 通道中成像，所得图像称为 Cy3 图像。</li>
	<li>重复步骤 8.1–8.2，以获取孔内约 10 个不同区域的图像。</li>
	<li>将物镜移至另一孔，并重复步骤 8.1–8.3。</li>
	<li>将图像导出为 TIFF 文件。</li>
	<li>（可选）在 Cy5 和 Cy3 通道中对吸附于盖玻片表面的多色荧光微球进行成像，以确定 Cy5 与 Cy3 通道之间的空间偏移，用于图像配准。
	<ol>
		<li>取约 10 µL 多色荧光微球（直径 0.2 µm）滴加于洁净的盖玻片表面，静置 10–30 分钟。用约 50 µL PBS 洗涤后，再加入约 5 µL PBS，将盖玻片与载玻片压合形成封片，密封后安装至显微镜上。</li>
		<li>在 Cy5 和 Cy3 通道中对微球进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 图像分析
注意：本步骤中使用的 Matlab 代码可在以下 GitHub 网站获取：https://github.com/sjkimlab/Code_Publication/tree/master/JoVE_2020。GitHub 文件夹包含图像分析所需的所有内容，包括细胞分割和信号点识别的参数值。本步骤中的流程在主脚本“FISHworkflow.m”中有进一步说明。
<ol>
	<li>打开细胞分割工具（如 microbeTracker27 或 Oufti28），加载相差图像。选择“独立帧”并点击名为“所有帧”的按钮以开始分割过程，系统将识别细胞并计算其轮廓（图3B，C）。 
	注意：这些软件包的详细操作协议可在线获取（例如 oufti.org）。</li>
	<li>在 microbeTracker 或 Oufti 的 spotFinder 功能中加载 Cy5 荧光图像，点击“运行”按钮，基于二维高斯拟合开始荧光点的识别与定量（图3B，C）。对 Cy3 荧光图像重复此步骤，以分析 Cy3 通道中的荧光点。该步骤将生成每个细胞中荧光点的列表，包括其强度和坐标。</li>
	<li>（可选）根据 FISHworkflow.m 文件中的说明，使用阈值过滤掉弱荧光点（假阳性）。 
	注意：检查阴性对照（例如 MG1655 ΔlacZ）中的荧光点，确定用于过滤假阳性的阈值。</li>
	<li>为获得单个 mRNA 的荧光点强度，使用在时间零点（添加 IPTG 前）测得的荧光点强度列表，用包含两个组分的高斯混合模型拟合荧光点强度分布。将第一个高斯群体的峰值位置（图3D，E中的黑线）作为单个 mRNA 的荧光点强度。分别对 Cy5 和 Cy3 荧光点执行此操作，以获得单个 5’ 和 3’ lacZ mRNA 的荧光点强度。 
	注意：每次时间序列实验均需重复此步骤，因为单个 mRNA 的荧光点强度在不同实验中可能略有变化。</li>
	<li>将荧光点的荧光强度除以单个 mRNA 的强度（来自步骤 9.4），以获得该荧光点内 mRNA 的数量。将细胞内归一化的荧光点强度相加，计算每个细胞中 mRNA 的总数（图3F）。分别对 5’ 和 3’ mRNA 执行这些计算。</li>
	<li>计算并绘制每个时间点的每细胞平均 mRNA 数量（例如 图4B），并通过平均 mRNA 水平随时间的变化分析体内转录和 mRNA 降解的动力学（图4B）。
	<ol>
		<li>为获得转录延伸速率，对 5’ 和 3’ mRNA 信号的初始上升阶段进行最小二乘法线性拟合，并确定与基础水平的截距（图4B）。这两个截距之间的差值表示 RNAP 从 5’ 探针区域移动到 3’ 探针区域所需的平均时间。将两个探针组之间的距离（2 kb）除以该时间，得到平均转录延伸速率。</li>
		<li>为获得 mRNA 降解速率，将指数衰减函数 y = A·exp(-t/τ) 拟合到 5’ 和 3’ mRNA 信号的最终衰减区域（例如 图4B）。拟合参数 τ 即为 mRNA 的平均寿命。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>（可选）基于每个细胞中 mRNA 数量的分布（由步骤 9.5 计算得出），分析基因表达的细胞间变异（例如 图4C 所示的细胞水平对诱导的响应）。</li>
	<li>（可选）利用来自步骤 9.2 获得的荧光点在细胞长轴和短轴上的位置信息，分析 mRNA 的定位（图4D，E）。</li>
	<li>（可选）通过比较在 Cy5 和 Cy3 通道中检测到的荧光点的定位，分析 5’ 和 3’ mRNA 的共定位（图5）。
	<ol>
		<li>在 microbeTracker 的 spotFinderF 功能中加载多色微珠图像（步骤 8.6），获取 Cy5 和 Cy3 通道中微珠质心的坐标。利用质心坐标列表计算仿射变换矩阵，该矩阵描述了 Cy5 和 Cy3 通道之间的相对平移和旋转关系29。</li>
		<li>将仿射变换矩阵应用于 Cy5 和 Cy3 的 FISH 图像，将 Cy3 图像转换至 Cy5 坐标系。判断一个通道中的荧光点是否与另一通道中的荧光点共定位。例如，若 Cy5 通道中某荧光点与 Cy3 通道中另一荧光点的质心距离小于 150 nm，则认为二者共定位（图5）。</li>
		<li>分析在每个时间点有多少 Cy5 荧光点被归类为与 Cy3 荧光点“共定位”。同时分析共定位荧光点的强度（图5）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bervoets, I., Charlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+versatility+and+complexity+of+bacterial+gene+regulation+mechanisms%3A+opportunities+and+drawbacks+for+applications+in+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 304-339 (2019).</li>
<li>Epshtein, V., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+RNA+polymerase+molecules+in+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation.</a> Science. 300 (5620), 801-805 (2003).</li>
<li>Vogel, U., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+chain+elongation+rate+in+Escherichia+coli+depends+on+the+growth+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 2807-2813 (1994).</li>
<li>Tennyson, C. N., Klamut, H. J., Worton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+dystrophin+gene+requires+16+hours+to+be+transcribed+and+is+cotranscriptionally+spliced%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced.</a> Nature Genetics. 9, 184(1995).</li>
<li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16, 1128(2009).</li>
<li>Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+RNA+Half-Life+Analysis+in+Escherichia+coli+Reveals+Positional+Patterns+of+Transcript+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation.</a> Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).</li>
<li>Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. -H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+decay+and+abundance+in+Escherichia+coli+at+single-gene+resolution+using+two-color+fluorescent+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).</li>
<li>Pérez-Ortín, J. E., Medina, D. A., Chávez, S., Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+you+mean+by+transcription+rate%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">What do you mean by transcription rate.</a> BioEssays. 35 (12), 1056-1062 (2013).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li>
<li>Kuchina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+single-cell+RNA+sequencing+by+split-pool+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding.</a> BioRxiv. , 869248(2019).</li>
<li>Blattman, S. B., Jiang, W., Oikonomou, P., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotic+single-cell+RNA+sequencing+by+in+situ+combinatorial+indexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing.</a> Nature Microbiology. , (2020).</li>
<li>Femino, A., Fay, F., Fogarty, K., Singer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Montero Llopis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466 (7302), 77-81 (2010).</li>
<li>So, L. -h, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+properties+of+transcriptional+time+series+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">General properties of transcriptional time series in Escherichia coli.</a> Nature Genetics. 43 (6), 554-560 (2011).</li>
<li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li>
<li>Jones, D. L., Brewster, R. C., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+architecture+dictates+cell-to-cell+variability+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promoter architecture dictates cell-to-cell variability in gene expression.</a> Science. 346 (6216), 1533-1536 (2014).</li>
<li>Iyer, S., Park, B. R., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantitative+measurement+of+transcriptional+kinetic+parameters+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Absolute quantitative measurement of transcriptional kinetic parameters in vivo.</a> Nucleic Acids Research. 44 (18), 142(2016).</li>
<li>Kim, S., Beltran, B., Irnov, I., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Distance+Cooperative+and+Antagonistic+RNA+Polymerase+Dynamics+via+DNA+Supercoiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Distance Cooperative and Antagonistic RNA Polymerase Dynamics via DNA Supercoiling.</a> Cell. 179 (1), 106-119 (2019).</li>
<li>Wang, M., Zhang, J., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+transcription+at+a+single+gene+copy+reveals+hidden+drivers+of+bacterial+individuality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Measuring transcription at a single gene copy reveals hidden drivers of bacterial individuality.</a> Nature Microbiology. 4 (12), 2118-2127 (2019).</li>
<li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJoo%2C+C+%22Labeling+DNA+%28or+RNA%29+for+single-molecule+FRET%22">Labeling DNA (or RNA) for single-molecule FRET</a>. 2012 (9), Cold Spring Harbor. 1005-1008 (2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Standard+Ethanol+Precipitation+of+DNA+in+Microcentrifuge+Tubes%22">Standard Ethanol Precipitation of DNA in Microcentrifuge Tubes</a>. 2006 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 4456(2006).</li>
<li>Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li>
<li>Adesnik, M., Levinthal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+and+degradation+of+lactose+operon+messenger+RNA+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">The synthesis and degradation of lactose operon messenger RNA in E. coli.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 35, 451-459 (1970).</li>
<li>Campbell, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+for+rifampicin+inhibition+of+bacterial+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase.</a> Cell. 104 (6), 901-912 (2001).</li>
<li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaj%2C+A+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Walter, N. G. 472, Academic Press. 365-386 (2010).</li>
<li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput%2C+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Molecular Microbiology. 80 (3), 612-627 (2011).</li>
<li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oufti%3A+an+integrated+software+package+for+high-accuracy%2C+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).</li>
<li>Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoffitt%2C+JR+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Filonov, G. S., Jaffrey, S. R. 572, Academic Press. 1-49 (2016).</li>
<li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+gene+expression+in+live+cells%2C+one+protein+molecule+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time.</a> Science. 311 (5767), 1600-1603 (2006).</li>
<li>Chen, H., Shiroguchi, K., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+study+of+mRNA+degradation+and+transcript+elongation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide study of mRNA degradation and transcript elongation in Escherichia coli.</a> Molecular Systems Biology. 11 (1), 781(2015).</li>
<li>Vogel, U., Sørensen, M., Pedersen, S., Jensen, K. F., Kilstrup, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreasing+transcription+elongation+rate+in+Escherichia+Coli+exposed+to+amino+acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Decreasing transcription elongation rate in Escherichia Coli exposed to amino acid starvation.</a> Molecular Microbiology. 6 (15), 2191-2200 (1992).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+and+translation+contribute+to+gene+locus+relocation+to+the+nucleoid+periphery+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcription and translation contribute to gene locus relocation to the nucleoid periphery in E. coli.</a> Nature Communications. 10 (1), 5131(2019).</li>
<li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li>
<li>Fontenete, S., Guimarães, N., Wengel, J., Azevedo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+melting+temperatures+in+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+procedures+using+thermodynamic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Prediction of melting temperatures in fluorescence in situ hybridization (FISH) procedures using thermodynamic models.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 36 (3), 566-577 (2016).</li>
<li>Sepúlveda, L. A., Xu, H., Zhang, J., Wang, M., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+gene+regulation+in+individual+cells+reveals+rapid+switching+between+promoter+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Measurement of gene regulation in individual cells reveals rapid switching between promoter states.</a> Science. 351 (6278), 1218-1222 (2016).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+shapes+the+turnover+of+a+bacterial+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome.</a> eLife. 5, 13065(2016).</li>
<li>Fei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+in+vivo+target+search+kinetics+of+regulatory+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA.</a> Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

在此，我们介绍了一种用于测量mRNA动力学的smFISH实验方案 E. coli在先前发表的用于细菌的smFISH方案中23，细胞在实验全程始终保留在离心管中，直至准备成像时才进行转移。尽管该方法具有诸多优势，例如可显著减少荧光探针在盖玻片表面的非特异性结合23，当存在这些协议时，遵循它们是困难的&#160;许多样品&#160;来自时间过程实验。首先，取相对较大体积的细胞（&#62;1 mL）需要在固定前进行取样甚至收获。其次，在杂交步骤之后，细胞样品需要经过多次离心以更换溶液并进行洗涤。在本方案中，使用小体积（&#60;1 mL 培养物直接与固定液在 1.5 mL 离心管中混合，有助于在取样瞬间快速“冻结”细胞状态。此外，细胞在整个操作过程中始终保持附着在表面，通过真空过滤系统吸除液体，并使用多通道移液器一次性加入溶液液滴，可实现不同溶液的快速更换。这一差异使得本方案在需要同时处理大量样本时具有显著优势。采用本方案，可同时处理 12–48 个样本，整个 FISH 操作可在约 8 小时内完成，与处理少量样本所需时间相近图2）。尽管我们使用了表达 lacZ 在 E. coli 例如，该方案经过下文讨论的若干考虑后，可广泛适用于不同基因和细菌种类。
对于不同的基因，首先需要考虑的是smFISH探针。可以设计覆盖目标mRNA的寡核苷酸探针图1A)13在这一“平铺”探针方法中，每个探针长约20个碱基，并在5’或3’末端标记有荧光染料。该策略无需进行基因操作，使用方便。或者，可采用串联重复序列&#160;约20 bp长度的序列，且该序列在基因组序列中不存在（例如，一段阵列） lacO 序列在 Caulobacter crescentus14），可插入目的基因的非翻译区，并使用一条与重复单元互补的单探针来标记mRNA（“阵列”方法； 图 1B在这两种情况下，多个荧光基团标记同一条mRNA，产生放大的荧光信号，可轻松将其与单个探针在细胞内的非特异性结合区分开来。
选择“拼接”（tiling）还是“阵列”（array）方法取决于阴性对照，即不含目标mRNA、用于检测探针非特异性结合的样本。对于拼接探针（图1A），缺乏目的基因的突变菌株或目的基因不转录的条件（例如，lacZ基因的抑制）可作为检测探针非特异性结合的阴性对照。对于基于阵列的单分子FISH（smFISH）（图1B），不含阵列的野生型菌株可作为阴性对照，因为其基因组中不存在探针的结合位点。
最佳杂交条件可能取决于探针序列，甚至荧光染料的选择。我们通过将杂交温度保持在 37 °C，并测试杂交溶液中不同浓度的探针组和甲酰胺，对 lacZ 探针组的杂交条件进行了优化。较高浓度的甲酰胺倾向于降低非特异性和特异性结合26,35。我们建议在保持杂交时间和温度不变的前提下，系统性地改变杂交及其洗涤条件。随着条件变得更加严格，非特异性和特异性结合均会下降（图 6）。关键是要找到一个临界点，使非特异性结合降至可接受阈值以下，同时又不进一步损害特异性结合。例如，我们将未添加任何探针时获得的信号水平（“无探针”）作为阈值（图 6）。
双色smFISH方法通过标记mRNA的两个不同区域，仅适用于较长的基因。为了&#160;测量&#160;转录延伸速率，我们利用了lacZ基因较长（3075 bp）且其表达可由IPTG诱导的特性。当基因较短时，难以设计两组分别靠近5’端和3’端的平铺探针，并分辨5’与3’ mRNA区域出现之间的时间延迟。在此情况下，可通过smFISH在稳态下计数新生mRNA，并使用将转录延伸速率作为拟合参数的解析模型分析其分布20。此外，当目标基因不可诱导时，可在时间零点用利福平处理细胞，并测量5’和3’ mRNA亚区域随时间的变化。随后，可根据5’ mRNA信号下降到3’ mRNA信号下降之间的延迟来计算转录延伸速率，该方法此前已有应用31。
最后，smFISH 实验方案具有良好的通用性，可与其他标记方法联用。此前，通过将 mRNA FISH 与 DNA FISH14 或荧光报告-操纵子系统20相结合，可实现 DNA 位点与 mRNA 的共可视化。通过将免疫荧光与 mRNA FISH 联用，还可&#160;对蛋白质产物进行可视化观察14,36。此外，该方法还可与三维超分辨率显微镜技术37相结合，实现 mRNA 在三个维度上的可视化38,39。&#160;

遗传信息从DNA流向mRNA和蛋白质是细胞中最基本的生命过程之一，其调控对细胞的适应性至关重要1。细胞中mRNA的数量由两个动态过程决定：转录和mRNA降解。然而，转录和mRNA降解在单个细胞的时间和空间上的调控机制仍不完全清楚，这主要由于缺乏能够在活体内对这些动力学过程进行定量测量的实验方法。
基于从细胞群体中提取的总mRNA的方法，例如Northern印迹、RT-PCR、RNA测序和基因表达微阵列，可用于测量mRNA水平的相对差异，并已被广泛用于分析转录延伸速率2,3,4,5或mRNA降解速率6,7。然而，这些方法无法提供每个细胞中mRNA的绝对数量，因此不适合用于研究转录起始速率8。此外，由于mRNA是从细胞群体中提取的，因此无法检测单个细胞内mRNA的空间分布以及细胞间mRNA拷贝数的变异情况。
单细胞下一代RNA测序（scRNAseq）可以在基因组水平上定量每个细胞中的mRNA数量9。然而，由于样品制备的挑战和高昂的成本，利用该技术测量转录动力学仍然存在困难。特别是，由于mRNA丰度较低，将scRNAseq应用于细菌在技术上尤为困难10,11。
单分子荧光原位杂交（smFISH）基于使用荧光标记的单链探针与目标 mRNA 序列进行杂交，这些探针的序列与所关注的目标 mRNA 互补12,13。这种序列特异性杂交的概念与 Northern 印迹或 RT-PCR 中所用的原理相似，但杂交过程在固定细胞内原位进行，以保持 mRNA 的天然定位。通过多个长约 ~20 个核苷酸（nt）的探针结合到单个 mRNA 的不同区域，从而放大单个 mRNA 的信号（图 1A）13。在这种“平铺”探针策略中，检测单个 mRNA 所需的探针数量决定了可检测 mRNA 长度的下限。另一种方法是将目标 mRNA 在转录水平上融合至一段非编码的串联 Lac 操纵子序列阵列，使得多个荧光标记的 lacO 探针可结合到&#160;单个 mRNA 上（图 1B）14。
smFISH 已被用于定量稳态下每个细胞中的 mRNA 拷贝数（即合成与降解处于平衡状态时），并分析细菌细胞间 mRNA 的平均值及其变异性15,16,17。最近，smFISH 还被应用于非稳态条件下 mRNA 拷贝数的定量，例如在大肠杆菌（E. coli）基因表达诱导或抑制后立即进行检测18,19,20。通过绝对 mRNA 拷贝数随时间的变化，可进一步计算转录起始、延伸和终止速率，以及 mRNA 降解速率。对于此类时间序列研究，传统的 smFISH 操作流程可能较为繁琐，因为需要处理大量代表不同时间点的样本，且每个样本均需经历多次缓冲液更换步骤（如离心和洗涤）。本文介绍了一种简化的 smFISH 实验方案，通过将细胞固定在盖玻片表面，并使用真空过滤系统抽吸液体，显著简化了样品处理流程14,19。以大肠杆菌（E. coli）中 lacZ 基因的表达为例，本文展示了完整的实验流程（图 2），包括图像分析（图 3），从而获得体内转录动力学（起始、延伸和终止）和 mRNA 降解、细胞间 mRNA 表达的异质性以及 mRNA 定位信息。我们预期该方案可广泛适用于多种细菌物种中其他 mRNA 的体内动力学与定位研究。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细菌菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌 MG1655</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学品、多肽及其他&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td>UPLC 缓冲液 B</td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Fisher Chemical</td><td>A661-500</td><td>用于配制 M9 培养基</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2518</td><td>探针杂交</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Acros Organics</td><td>349610250</td><td>用于配制 M9 培养基</td></tr><tr><td>酪蛋白氨基酸</td><td>BD Difco</td><td>223050</td><td>用于配制 M9 培养基</td></tr><tr><td>Cy3B NHS 酯</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>PA63101</td><td>FISH 探针用荧光染料</td></tr><tr><td>Cy5 NHS 酯</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>PA15101</td><td>FISH 探针用荧光染料</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖</td><td>Millipore</td><td>S4030</td><td>探针杂交</td></tr><tr><td>右旋葡萄糖</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16</td><td>用于抑制 lacZ 表达</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>用于溶解荧光染料</td></tr><tr><td>大肠杆菌 tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td>探针杂交</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>用于 DNA 纯化、裂解及盖玻片清洗</td></tr><tr><td>FISH 探针</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>序列见参考文献 #16</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Ladd Research Industries</td><td>20295</td><td>固定</td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>American Bio</td><td>AB00600</td><td>探针杂交、预杂交及洗涤</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Americanbio</td><td>AB00751-01000</td><td>用于配制 M9 培养基</td></tr><tr><td>异丙基硫代-&amp;beta;-半乳糖苷（IPTG）</td><td>Invitrogen</td><td>15529019</td><td>诱导 lacZ 表达</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Fisher Chemical</td><td>M65-500</td><td>用于配制 M9 培养基</td></tr><tr><td>2-硝基苯基 &amp;beta;-D-呋喃糖苷（ONPF）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-216258</td><td>抑制 lacZ 表达</td></tr><tr><td>Picodent twinsil 22</td><td>Picodent</td><td>1300 1000</td><td>密封剂</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>用于处理盖玻片表面</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-500</td><td>用于配制 PBS</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP362-500</td><td>用于配制 PBS 和 M9 培养基</td></tr><tr><td>利福平</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td>终止转录起始</td></tr><tr><td>氯化钠-柠檬酸钠缓冲液（SSC）</td><td>Invitrogen</td><td>AM9763</td><td>探针杂交、预杂交及洗涤</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP328-500</td><td>荧光染料-探针偶联</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-1</td><td>用于 DNA 纯化、PBS 及 M9 培养基</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP332-500</td><td>用于配制 PBS 和 M9 培养基</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP329-500</td><td>用于配制磷酸钠缓冲液</td></tr><tr><td>Super PAP Pen</td><td>Invitrogen</td><td>8899</td><td>盖玻片用疏水标记笔</td></tr><tr><td>TetraSpek 微球</td><td>Invitrogen</td><td>T7280</td><td>多通道图像配准对照</td></tr><tr><td>硫胺素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td>用于配制 M9 培养基</td></tr><tr><td>三乙基乙酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90358</td><td>UPLC 缓冲液 A</td></tr><tr><td>钒酰核糖核苷复合物（VRC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94742</td><td>探针杂交和预杂交</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 柱</td><td>Waters</td><td>Acquity BEH C18 柱</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>台式孵育器</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer F1.5</td><td></td></tr><tr><td>孵育箱（烘箱）</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030514</td><td>重力对流式</td></tr><tr><td>水纯化系统</td><td>Millipore</td><td>Milli-Q Reference</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td></td></tr><tr><td>氮气</td><td>建筑物供气</td><td></td><td>用于吹干盖玻片和载玻片</td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Waters</td><td>Acquity UPLC 系统</td><td></td></tr><tr><td>真空泵与抽滤装置</td><td>建筑物供气</td><td></td><td>抽滤装置由带侧臂的过滤瓶构成</td></tr><tr><td>真空浓缩仪</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td>Centrivap；用于干燥 UPLC 收集的样品</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries</td><td>Genie-2 SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>摇床水浴</td><td>New Brunswick</td><td>Innova 3100</td><td>对时间进程实验至关重要</td></tr><tr><td>超声水浴</td><td>VWR</td><td>97043-960</td><td>用于清洗盖玻片和载玻片</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;工具&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td>DNA 低吸附管</td></tr><tr><td>1000 µL 吸头盒</td><td>Denville Scientific</td><td>P1126</td><td>使用完所有吸头后的空盒</td></tr><tr><td>柯普林瓶</td><td>SPI</td><td>01240-AB</td><td>用于清洗盖玻片和载玻片</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-230</td><td>24×60 No1</td></tr><tr><td>带滤芯吸头</td><td>Denville Scientific</td><td>P1121, P1122, P1126</td><td>SHARP&amp;reg; 精密屏障吸头</td></tr><tr><td>镊子</td><td>SPI</td><td>K35a</td><td>用于夹取洁净的盖玻片和载玻片</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>手套</td><td>Microflex</td><td>MK-296-M</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td>2231300045</td><td>用于洗涤步骤（#7）</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Gilson</td><td>P1000, P200, P20</td><td></td></tr><tr><td>试剂储液槽</td><td>MTC Bio</td><td>P8025-1S</td><td>用于洗涤步骤（#7）</td></tr><tr><td>注射器滤器（0.22 µm）</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>计时器</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件与算法&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013 及以上版本</td><td>https://www.mathworks.com</td></tr><tr><td>MicrobeTracker 或 Oufti</td><td></td><td></td><td>https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker</td></tr><tr><td colspan="4">https://oufti.org/</td></tr><tr><td>Stellaris 探针设计软件</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>Orca-II-ER</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 滤光片组</td><td>Chroma</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 滤光片组</td><td>Chroma</td><td>49006</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td>用于相差与落射荧光成像</td></tr><tr><td>荧光激发光源</td><td>Lumencor</td><td>SOLA-E</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Elements 软件</td><td>Nikon</td><td></td><td>控制显微镜系统的软件</td></tr><tr><td>相差 100× 物镜</td><td>Nikon</td><td>Plan Apochromat（NA 1.45）</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;探针序列&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5' 端带有 C6 氨基修饰的 DNA 寡核苷酸</td><td>Biosearch Technologies Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lacZ1</td><td></td><td>GTGAATCCGTAATCATGGTC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ2</td><td></td><td>TCACGACGTTGTAAAACGAC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ3</td><td></td><td>ATTAAGTTGGGTAACGCCAG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ4</td><td></td><td>TATTACGCCAGCTGGCGAAA</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ5</td><td></td><td>ATTCAGGCTGCGCAACTGTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ6</td><td></td><td>AAACCAGGCAAAGCGCCATT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ7</td><td></td><td>AGTATCGGCCTCAGGAAGAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ8</td><td></td><td>AACCGTGCATCTGCCAGTTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ9</td><td></td><td>TAGGTCACGTTGGTGTAGAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ10</td><td></td><td>AATGTGAGCGAGTAACAACC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ11</td><td></td><td>GTAGCCAGCTTTCATCAACA</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ12</td><td></td><td>AATAATTCGCGTCTGGCCTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ13</td><td></td><td>AGATGAAACGCCGAGTTAAC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ14</td><td></td><td>AATTCAGACGGCAAACGACT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ15</td><td></td><td>TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ16</td><td></td><td>ATCTTCCAGATAACTGCCGT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ17</td><td></td><td>AACGAGACGTCACGGAAAAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ18</td><td></td><td>GCTGATTTGTGTAGTCGGTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ19</td><td></td><td>TTAAAGCGAGTGGCAACATG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ20</td><td></td><td>AACTGTTACCCGTAGGTAGT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ21</td><td></td><td>ATAATTTCACCGCCGAAAGG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ22</td><td></td><td>TTTCGACGTTCAGACGTAGT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ23</td><td></td><td>ATAGAGATTCGGGATTTCGG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ24</td><td></td><td>TTCTGCTTCAATCAGCGTGC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ25</td><td></td><td>ACCATTTTCAATCCGCACCT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ26</td><td></td><td>TTAACGCCTCGAATCAGCAA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ27</td><td></td><td>ATGCAGAGGATGATGCTCGT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ28</td><td></td><td>TCTGCTCATCCATGACCTGA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ29</td><td></td><td>TTCATCAGCAGGATATCCTG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ30</td><td></td><td>CACGGCGTTAAAGTTGTTCT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ31</td><td></td><td>TGGTTCGGATAATGCGAACA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ32</td><td></td><td>TTCATCCACCACATACAGGC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ33</td><td></td><td>TGCCGTGGGTTTCAATATTG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ34</td><td></td><td>ATCGGTCAGACGATTCATTG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ35</td><td></td><td>TGATCACACTCGGGTGATTA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ36</td><td></td><td>ATACAGCGCGTCGTGATTAG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ37</td><td></td><td>GATCGACAGATTTGATCCAG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ38</td><td></td><td>AAATAATATCGGTGGCCGTG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ39</td><td></td><td>TTTGATGGACCATTTCGGCA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ40</td><td></td><td>TATTCGCAAAGGATCAGCGG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ41</td><td></td><td>AAGACTGTTACCCATCGCGT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ42</td><td></td><td>TGCCAGTATTTAGCGAAACC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ43</td><td></td><td>AAACGGGGATACTGACGAAA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ44</td><td></td><td>TAATCAGCGACTGATCCACC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ45</td><td></td><td>GGGTTGCCGTTTTCATCATA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ46</td><td></td><td>TCGGCGTATCGCCAAAATCA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ47</td><td></td><td>TTCATACAGAACTGGCGATC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ48</td><td></td><td>TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ49</td><td></td><td>ACGGAACTGGAAAAACTGCT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ50</td><td></td><td>TATTCGCTGGTCACTTCGAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ51</td><td></td><td>GTTATCGCTATGACGGAACA</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ52</td><td></td><td>TTTACCTTGTGGAGCGACAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ53</td><td></td><td>GTTCAGGCAGTTCAATCAAC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ54</td><td></td><td>TTGCACTACGCGTACTGTGA</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ55</td><td></td><td>AGCGTCACACTGAGGTTTTC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ56</td><td></td><td>ATTTCGCTGGTGGTCAGATG</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ57</td><td></td><td>ACCCAGCTCGATGCAAAAAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ58</td><td></td><td>CGGTTAAATTGCCAACGCTT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ59</td><td></td><td>CTGTGAAAGAAAGCCTGACT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ60</td><td></td><td>GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ61</td><td></td><td>TACGCCAATGTCGTTATCCA</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ62</td><td></td><td>TAAGGTTTTCCCCTGATGCT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ63</td><td></td><td>ATCAATCCGGTAGGTTTTCC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ64</td><td></td><td>GTAATCGCCATTTGACCACT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ65</td><td></td><td>AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ66</td><td></td><td>ATGTCTGACAATGGCAGATC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ67</td><td></td><td>ATAATTCAATTCGCGCGTCC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ68</td><td></td><td>TGATGTTGAACTGGAAGTCG</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ69</td><td></td><td>TCAGTTGCTGTTGACTGTAG</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ70</td><td></td><td>ATTCAGCCATGTGCCTTCTT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ71</td><td></td><td>AATCCCCATATGGAAACCGT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ72</td><td></td><td>AGACCAACTGGTAATGGTAG</td><td>3' mRNA</td></tr></tbody></table>

在 escherichia coli 中利用双色单分子荧光原位杂交技术研究 mrna 的时空动力学

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

单分子荧光原位杂交（smFISH）可用于计数单个细胞中mRNA的绝对数量。本文介绍了一种将smFISH应用于大肠杆菌（Escherichia coli）中转录速率和mRNA降解速率测定的方法。由于smFISH基于固定细胞，因此我们在时间进程实验中的多个时间点进行smFISH检测，即在基因表达被诱导或抑制后细胞发生同步变化的过程中。在每个时间点，通过光谱区分mRNA的不同亚区域，以检测转录延伸和提前终止情况。本实验方案的结果还可用于分析mRNA在细胞内的定位以及细胞间mRNA拷贝数的异质性。使用该方案可在8小时内处理大量样本（约50个），而以往处理少量样本即需耗费相同时间。我们讨论了如何应用该方案研究细菌细胞中不同mRNA的转录与降解动力学。

本方案描述了单分子荧光原位杂交（smFISH）技术的一种应用，用于测量体内mRNA合成与降解的动力学过程。

在 Escherichia coli 中利用双色单分子荧光原位杂交技术研究 mRNA 的时空动力学

单分子荧光原位杂交（smFISH）可实现对单个细胞中mRNA绝对数量的计数。本文中，我们描述了一种……

smFISH 以其能够测量 mRNA 的绝对数量及其亚细胞定位而著称。我们的双色 smFISH 方案进一步具备测量转录动力学和 mRNA 降解速率的能力。利用该方法，可同时处理大量样本，而无需额外的时间或操作步骤。例如，八小时内可完成包含48个样本的四组时间序列实验的成像处理。本方案适用于多种基因和细菌种类。实验前需准备盖玻片和载玻片。使用镊子将盖玻片和载玻片放入盛有100%乙醇的考普林瓶中，并将瓶子置于水浴超声波清洗器中处理15至20分钟。超声处理结束后，用超纯水将载玻片和盖玻片清洗三到四次，然后重新加入70%乙醇至瓶中，再次进行超声处理。完成所有超声步骤后，用氮气吹干盖玻片和载玻片。将盖玻片放入一个空的1000微升枪头盒中，将载玻片放入干净的载玻片盒中。然后，根据枪头盒上的孔位，使用疏水性标记笔在盖玻片上画出圆圈，并向每个圈内加入20微升0.1%多聚赖氨酸溶液。为了设置时间进程实验，从20毫升处于对数生长期的大肠杆菌（E.coli）培养物中取出750微升，加入标记为“零时”的1.5毫升培养管中。立即倒置离心管。加入0.2至1毫摩尔的IPTG以诱导lacZ表达，并启动计时器。根据计时器提示，按照前述方法依次在各连续实验时间点收集细胞培养物。在实验的适当时间点，向烧瓶中加入 5 毫摩尔的 ONPF 以抑制 lac Z 表达，并继续取样培养物以追踪 mRNA 的降解情况。在完成时间过程取样后，将样品在室温下孵育 15 分钟，随后在冰上孵育 30 分钟。孵育结束后，离心样品以去除固定剂，并用移液器吸除上清液。将细菌重新悬浮于 1 毫升 DEPC PBS 中，并用每份 1 毫升的新鲜 DEPC PBS 再洗涤细胞两次。最后一次洗涤后，将细胞重新悬浮于 30 微升新鲜 DEPC PBS 中。用于细胞的通透处理。首先，将每个时间点的样品分别加入经乙醇灭菌的玻璃盖玻片上的各个疏水孔中，并在室温下孵育10至30分钟，使细胞贴附于盖玻片上。孵育结束后，向每个孔中加入15 µL 70%乙醇。四分钟后，吸去每个孔中的乙醇，使孔完全干燥。洗涤后，向各孔的透化细胞中加入30 µL预杂交溶液，并在37°C培养箱中孵育30分钟。用约30 µL的探针杂交溶液替换每个孔中的预杂交溶液。用铝箔覆盖培养板，在37摄氏度的培养箱中孵育2小时。孵育结束后，使用多通道移液器，每孔每次加入30微升洗涤液，每孔清洗3至5次。最后一次清洗后，在37摄氏度下将细胞再孵育15至30分钟，随后每孔每次加入30微升新鲜DEPC处理的PBS，清洗5次。最后一次洗涤后，吸尽盖玻片上的所有液体。向每个孔中加入四微升新鲜的DEPC PBS。用镊子小心地将盖玻片有样本的一面朝下放置在经乙醇灭菌的玻璃载片上，并用硅胶牙科胶密封盖玻片的边缘。为了定位目标区域，选择相差成像的实时模式，并操作载物台操纵杆以改变孔内的视野。找到细胞密度理想的区域，并调节Z轴聚焦，使相差图像中的细胞清晰对焦。随后，对每孔大约10个不同区域，依次采集一张曝光时间为4秒的C5图像、一张曝光时间为2秒的C3图像，以及一张曝光时间为0.2秒的相差图像。或者，可运行一种NDI采集程序，依次获取C5、C3和相差图像。当所有孔均已成像后，打开合适的细胞分割工具，取消勾选“stack”。加载感兴趣的相差图像，选择独立帧，然后点击“compute phase profile as zero”。开始分割过程，在此过程中将识别细胞并计算其轮廓。加载 GitHub 文件夹中提供的参数，然后点击所有帧。处理结束后，选择“轮廓”以可视化网格。接下来，在点状信号检测选项卡下，取消勾选“stack”，勾选“meshes”，然后点击“rub”以基于二维高斯拟合开始点状信号的识别与定量。选择包含荧光图像的文件夹以及刚刚由细胞检测流程计算得到的网格文件，并指定用于保存点状信号检测结果的文件名。随后，使用 GitHub 上提供的图像分析工作流程来分析荧光图像。在此完整视野中，可观察到约 500 个大肠杆菌细胞，其密度适合进行细胞分割。用于分割时，相差图像中细胞的形态应与活细胞保持相似。若细胞通透化过度，其形态将不再适合分割。在诱导前，lac Z mRNA 斑点强度的分布由于存在高强度斑点，与正态分布或泊松分布均不吻合。当 lac Z 表达被诱导时，五端 lac Z mRNA 信号先于三端 lac Z mRNA 信号增加。如果 lac Z 表达受到抑制，则五端和三端 lac Z mRNA 信号均下降。为了获得转录延伸速率，需对五端和三端信号的上升阶段进行直线拟合。而mRNA降解速率则通过将衰减区域拟合为指数函数来确定。由于单分子FISH是一种单细胞技术，因此还可以分析细胞间转录的异质性。此外，通过分析五端和三端 lac Z mRNA 的共定位，可以定量测定 lac Z 基因上 RNA 聚合酶的密度。由于该实验过程中需同时处理来自不同时间点的样品，因此在样品处于离心管和盖玻片上时，必须保持各样品相互分离。利用这种单分子单细胞显微技术，研究人员现在可以探究转录和 mRNA 降解动力学如何与 mRNA 的绝对数量或亚细胞定位相关联。

probing-mrna-kinetics-space-time-escherichia-coli-using-two-color

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

利用两色单分子荧光在原位杂交中Escherichia coli探索大肠杆菌中空间和时间中的 mRNA 动力学

我们介绍一种荧光显微镜方法——翻译偶联切割激活法（Co-Translational Activation by Cleavage, CoTrAC），可在不干扰蛋白质功能的前提下，以单分子精度对活细胞中蛋白质分子的生成进行成像。该方法已被用于追踪转录因子λ阻遏蛋白CI 1...

基因调控的单分子成像 在体 利用共翻译切割激活（CoTrAC）

本方案描述了一种进行荧光检测的实验操作流程 原位...

mRNA分子的荧光可视化与分析 原位 杂交在 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

生物分子研究 体内 对于理解生物体系中分子功能至关重要。本文描述了一种新方法，可实现荧光生物分子（如 DNA 或蛋白质）向活体微生物内部的导入。对 体内...

通过电穿孔法将荧光生物分子导入活体微生物并进行观察

本文介绍了一种直接测定纯化的大肠杆菌（Escherichia...

Escherichia coli中转运RNA丰度及其荷载水平的定量分析

本文描述了一种利用荧光标记的DNA探针对单个信使RNA（mRNA）转录本进行标记的方法，用于大肠杆菌（E.

单个细胞中转录本标记方法 大肠杆菌 用于单分子荧光的细胞 原位 杂交实验

该单分子荧光原位杂交实验方案经过优化，可用于定量营养生长和减数分裂期间芽殖酵母中的RNA分子数量。...

单分子荧光 原位 芽殖酵母营养生长与减数分裂过程中的杂交（smFISH）分析

定点突变是一种用于在脱氧核糖核酸（DNA）中引入特定突变的技术。本实验方案介绍了基于两步法和三步法聚合酶链式反应（PCR）的定点突变操作方法，该方法适用于任何感兴趣的DNA片段。...

位点定向诱变在体外和体内实验中的应用——以大肠杆菌（Escherichia coli）中的RNA相互作用为例

追踪单个翻译事件可实现对帽依赖性翻译机制的高分辨率动力学研究。本文中我们展示了一种 体外 基于荧光标记抗体与表位标记新生肽段之间相互作用成像的单分子检测方法。该方法可实现对活性翻译过程中起始及肽链延伸动力学的单分子表征 体外...

一个 体外 单分子成像分析帽依赖性翻译动力学实验方法

单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）是一种用于在单细胞水平上精确定量特定RNA表达水平及其定位的方法。本文中，我们报告了经过验证的实验室操作流程，包括湿实验处理、成像以及针对特定RNA的单细胞定量图像分析方法。...

通过单分子荧光原位杂交对转录活性等位基因进行单细胞分析

单分子荧光能量转移是一种用于追踪核糖体蛋白质合成过程中tRNA动态变化的方法。通过追踪单个核糖体，可以识别出非均质的群体，从而揭示其作用机制。该方法也可广泛用于追踪生物分子的构象变化，以阐明多种复杂生物系统中动态特性与功能之间的关系。单分子方法能够观测到传统系综方法因平均效应而无法捕捉的非限速步骤以及低丰度的关键中间态。...

单分子荧光能量转移研究核糖体蛋白质合成

肠道微生物，包括胞外细菌以及奥尔赛病毒和微孢子虫（真菌）等胞内病原体，常与野生Caenorhabditis线虫相关。本文介绍了一种用于检测和定量定植和/或感染C.

RNA荧光 原位 杂交（FISH）技术用于可视化微生物定植与感染 秀丽隐杆线虫 肠道

探索双色单分子荧光原位杂交技术，用于定量分析大肠杆菌中mRNA转录与降解动力学。该方法可同时处理48个样品，在8小时内完成成像，为细菌基因表达调控研究提供高效工具。

在 Escherichia coli 中利用双色单分子荧光原位杂交技术研究 mRNA 的时空动力学

探索更多视频