Name: 检测免疫球蛋白A肾病小鼠肾脏中的microRNA表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: 了解检测免疫球蛋白A肾病小鼠肾脏中microRNA表达的方法。该技术使用HIGA小鼠模型，通过定量实时PCR分析miRNA水平，为研究IgA肾病遗传机制及开发新诊断和治疗方法提供可靠途径。

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我们感谢 Edanz Group（www.edanzediting.com）的 Sarah Williams 博士对本稿件初稿进行的编辑。

动物实验已获日本医科大学动物伦理委员会批准，并符合《日本医科大学实验动物使用与护理指南》中关于实验动物使用与护理的指导原则。
1. 获取HIGA小鼠的肾脏样本
注意：HIGA 小鼠在 25 周龄后表现出稳定的 IgA 肾病表型8,9,10,11。应选择 Balb/c 小鼠作为对照组8,9,10,11。获取 25 周龄的雌性 HIGA 小鼠（n = 10）和 25 周龄的雌性 Balb/c 小鼠（n = 10）。实验前需预先确定所需小鼠数量。此步骤针对 10 只 HIGA 小鼠和 10 只 Balb/c 小鼠的样本量，大约需要 7–8 小时。
<ol>
	<li>准备以下物品：HIGA 小鼠（25 周龄，雌性）、Balb/c 小鼠（25 周龄，雌性）、吸入式麻醉装置、异氟烷、软木板、大头针、磷酸盐缓冲液（PBS）、注射器、针头、手术剪和镊子。</li>
	<li>使用 4%–5% 异氟烷通过吸入式麻醉装置对 HIGA 小鼠进行麻醉，并用大头针将其固定于软木板上，呈仰卧位。诱导麻醉后，将异氟烷浓度调整至 2%–3% 作为维持剂量。 
	注意：麻醉深度应维持在完全消除侵入性操作相关疼痛的水平。特别是在切除胸腔等组织时，异氟烷浓度应调整至 4–5%。脱毛和眼部软膏并非必需。若操作可快速完成，则无需将小鼠置于加热垫上。</li>
	<li>用手术剪和镊子在小鼠腹壁做一条 3–4 cm 的正中切口，并仔细辨认双侧肾脏。</li>
	<li>用手术剪和镊子切开肋骨和膈肌以暴露心脏。切开右心房后，从左心室注入 PBS，直至肾脏颜色变为淡黄色（此步骤表明小鼠全身已灌注 PBS）。</li>
	<li>切断肾动脉、肾静脉和输尿管，取出肾脏。将肾脏切成每份 30 mg 的组织块，用于后续步骤。 
	注意：IgA 肾病的病理变化主要累及肾皮质（肾脏外层）的肾小球。尽管在肉眼下难以完全区分皮质与髓质，但应主要采集肾脏外层部分。这些样本可在 –80 °C 下保存数月。</li>
</ol>
2. 从肾脏样本中纯化总RNA
注意：此步骤使用市售的miRNA提取试剂盒来提取总RNA。此外，还需使用生物聚合物破碎离心柱。更多细节请参见材料表。miRNA提取试剂盒包含基于二氧化硅膜的离心柱、苯酚/胍基裂解液、胍基/乙醇洗涤缓冲液（洗涤缓冲液1）、乙醇洗涤缓冲液（洗涤缓冲液2）以及无核酸酶水。此步骤处理10只HIGA小鼠和10只对照小鼠样本约需3小时。
<ol>
	<li>准备以下物品：1.5 或 2.0 mL 收集管、100% 乙醇、氯仿、硅胶匀浆器、微量移液器、移液枪头、离心机、生物聚合物破碎离心柱、基于硅胶膜的离心柱、酚/胍裂解试剂、胍/乙醇洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 1）、乙醇洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 2）以及无核酸酶水。</li>
	<li>使用硅胶匀浆器和 700 µL 酚/胍裂解试剂在室温下匀浆 30 mg 肾脏样本。 
	注意：样本中的 miRNA 在接触酚/胍裂解试剂前非常不稳定，因此这些步骤应尽快完成。</li>
	<li>将裂解液转移至生物聚合物破碎离心柱中，并在室温下以 15,000 x g 离心 2 分钟。</li>
	<li>向滤液中加入 140 µL 氯仿，剧烈混匀 15 秒。静置 2–3 分钟，然后在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟。</li>
	<li>小心地将澄清的上清液转移至新的收集管中，避免接触中间层，并加入确定体积（见下文）的 100% 乙醇。涡旋振荡 5 秒。 
	注意：需加入相当于所得上清液体积 1.5 倍的 100% 乙醇。</li>
	<li>将样品（上限 700 µL）转移至基于硅胶膜的离心柱中，并在室温下以 8,000 x g 离心 15 秒。离心后弃去滤液。</li>
	<li>向基于硅胶膜的离心柱中加入 700 µL 洗涤缓冲液 1，并在室温下以 8,000 x g 离心 15 秒。离心后弃去滤液。</li>
	<li>向基于硅胶膜的离心柱中加入 500 µL 洗涤缓冲液 2，并在室温下以 8,000 x g 离心 15 秒。离心后弃去滤液。</li>
	<li>再次向基于硅胶膜的离心柱中加入 500 µL 洗涤缓冲液 2，并在室温下以 8,000 x g 离心 15 秒。离心后弃去滤液。</li>
	<li>再次在不添加任何液体的情况下对基于硅胶膜的离心柱进行离心，以去除残留的乙醇，在室温下以 15,000 x g 离心 1 分钟。离心后弃去滤液。</li>
	<li>将离心柱连接的收集管更换为新的收集管。</li>
	<li>向基于硅胶膜的离心柱中加入 30 µL 无核酸酶水，并在室温下以 8,000 x g 离心 1 分钟。 
	注意：所得 30 µL 溶液含有高浓度的总 RNA。该样品可在 –80 °C 下保存数月。</li>
</ol>
3. 从总RNA合成cDNA
注意：本步骤使用 commercially available 的反转录试剂盒。详见材料表中的更多细节。该试剂盒包含核酸混合液、反转录酶混合液和缓冲液。为防止反应提前进行，此操作必须在冰上进行。以10只HIGA小鼠和10只对照小鼠的样本量计算，该步骤约需3小时。
<ol>
	<li>准备以下物品：1.5 mL 收集管、八联管、微量移液器、移液器吸头、分光光度计、无核酸酶水、冰、核酸混合液、逆转录酶混合液、缓冲液和热循环仪。</li>
	<li>使用分光光度计测定总 RNA 的浓度。然后计算所需无核酸酶水的体积，使 12 µL 溶液中含有 1 µg 总 RNA。</li>
	<li>配制主混合液，每份样品包含以下组分：2.0 µL 核酸混合液、2.0 µL 逆转录酶混合液和 4.0 µL 缓冲液，总体积为 8.0 µL。</li>
	<li>将 8 µL 主混合液加入八联管的每个孔中。</li>
	<li>用步骤 3.2 中计算出体积的无核酸酶水稀释总 RNA。然后，将 12 µL 总 RNA 溶液（含 1 µg 总 RNA）加入八联管的每个孔中。</li>
	<li>将八联管中的样品在热循环仪中于 37 °C 孵育 60 分钟，随后在热循环仪中于 95 °C 孵育 5 分钟。 
	注意：孵育后的溶液含有高浓度的 cDNA。</li>
	<li>将该溶液转移至 1.5 mL 管中，并加入 200 µL 无核酸酶水。 
	注意：最终得到的 200 µL 溶液可作为模板 cDNA 用于 qRT-PCR。该样品可在 –80 °C 下保存约 1 年。</li>
</ol>
4. miRNA 的 qRT-PCR
注意：本步骤使用市售的PCR试剂盒。详见材料表中的更多信息。该试剂盒包含PCR混合液、通用引物和无核酸酶水。样品应设置重复孔，且每种情况均需考虑结果的准确性。miRNA的表达水平通过ΔΔCT法进行定量。当样本量为10只HIGA小鼠和10只对照小鼠时，此步骤约需4小时。
<ol>
	<li>准备以下物品：1.5 mL 收集管、96 孔反应板、96 孔反应板用粘性封膜、微量移液器、移液器吸头、PCR 混合液、通用引物、无核酸酶水、miRNA 特异性引物以及实时 PCR 仪。</li>
	<li>按如下成分配制主混合液：每孔加入 12.5 µL PCR 混合液、2.5 µL 通用引物、1.25 µL 5 µM miRNA 特异性引物以及 6.25 µL 无核酸酶水。 
	注意：本实验中使用了针对 miRNA [RNA, U6 小核 2 (RNU6-2)、miR-155-5p、miR-146a-5p 和 miR-21-5p] 的特异性引物。RNU6-2 作为内参对照14。</li>
	<li>向 96 孔反应板的每个孔中加入 22.5 µL 主混合液。</li>
	<li>向 96 孔板的各个孔中加入在步骤 3.7 中制备的 2.5 µL cDNA。</li>
	<li>用粘性封膜覆盖 96 孔反应板，然后在 1,000 x g 条件下离心 30 秒。</li>
	<li>运行实时 PCR 仪。PCR 程序设置如下：95 °C 初始激活 15 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 15 秒、55 °C 退火 30 秒以及 70 °C 延伸 30 秒。</li>
	<li>采用 ΔΔCT 法定量基因表达。相对表达水平计算为 2–ΔΔCT。 
	注意：异常的 PCR 扩增曲线应考虑从结果中剔除。</li>
</ol>

<ol><li>Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgA+Nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">IgA Nephropathy.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).</li>
<li>Szeto, C. C., Li, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in IgA nephropathy.</a> Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).</li>
<li>Wyatt, R. J., Julian, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">IgA nephropathy.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).</li>
<li>Vishnoi, A., Rani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA+Biogenesis+and+Regulation+of+Diseases%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).</li>
<li>Rupaimoole, R., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+therapeutics%3A+towards+a+new+era+for+the+management+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).</li>
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<li>Serino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+a+retrospective+international+study%2C+circulating+miR-148b+and+let-7b+were+found+to+be+serum+markers+for+detecting+primary+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy.</a> Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).</li>
<li>Muso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+production+of+glomerular+extracellular+matrix+in+a+new+mouse+strain+of+high+serum+IgA+ddY+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice.</a> Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).</li>
<li>Kurano, M., Yatomi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+gas+chromatography+mass+spectrometry+to+elucidate+metabolites+predicting+the+phenotypes+of+IgA+nephropathy+in+hyper+IgA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice.</a> Plos One. 14 (7), 0219403(2019).</li>
<li>Hyun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+improve+renal+function+in+a+mouse+model+of+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy.</a> Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).</li>
<li>Katsuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+a+mouse+model+of+immunoglobulin+A+nephropathy+reveals+an+enhanced+PDGF-EDG5+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22The+Pharmacogenomics+Journal%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade.</a> The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).</li>
<li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li>
<li>Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evidence+based+strategy+for+normalization+of+quantitative+PCR+data+from+miRNA+expression+analysis+in+forensic+organ+tissue+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification.</a> Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+miR-146a+and+miR-155+in+kidney+biopsy+and+urine+from+patients+with+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Markers%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy.</a> Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).</li>
<li>Hennino, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-21-5p+renal+expression+is+associated+with+fibrosis+and+renal+survival+in+patients+with+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy.</a> Scientific Reports. 6, 27209(2016).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22How+to+Win+the+Battle+with+RNase%22">How to Win the Battle with RNase</a>. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

我们利用这一新方法成功测定了IgA肾病小鼠模型（HIGA小鼠）肾脏中miRNA的表达水平。IgA肾病是一种病因未明的疾病，仍需进一步研究以阐明其发病机制和治疗靶点1,3。然而，获取人类肾脏样本具有高度侵入性。该新技术的优势在于可利用小型动物开展IgA肾病的研究，有望推动未来对IgA肾病及miRNA的深入探索。在后续研究中，该方法可应用于探索用于治疗IgA肾病的新型miRNA。在HIGA小鼠中对miRNA进行人工调控可能影响IgA肾病的表型表现，在此情况下，该方法可用于验证miRNA的变化。本方法并非用于分析血清中的miRNA，但通过修改实验方案，或许也可实现该用途。
该方法的原理基于以往的报道。我们采用生物聚合物破碎离心柱来破坏样本中的生物聚合物，此前已有研究证明这是一种有效的技术12。以往的研究还表明，以总RNA为模板通过逆转录合成cDNA，并以所获得的cDNA为模板进行PCR扩增，具有较高的准确性<sup clas...

免疫球蛋白A（IgA）肾病是一种原发性肾小球肾炎，其特征是IgA在肾小球系膜区异常沉积1,2。它是原发性肾小球肾炎中最常见的类型，可导致20%–40%的患者进展至终末期肾功能衰竭2。该病病因尚不明确，但持续性黏膜感染被认为与其发病相关1,3。糖皮质激素、免疫抑制剂以及肾素-血管紧张素系统抑制剂已被提出作为治疗手段1,3，但其疗效尚未完全确立3。因此，仍需进一步研究以明确IgA肾病的病因及有效的治疗方法。
microRNAs（miRNAs）是一类小分子非编码RNA，在基因表达调控中发挥重要作用4,5。已有研究表明，miRNAs参与多种疾病的发病机制，其中一些已被鉴定为疾病生物标志物或治疗靶点4,5。近年来，miRNAs与IgA肾病发病机制之间的关联也相继被报道2,6,7。例如，miR-148b被证实参与IgA肾病患者IgA结构异常的过程2,6,7，而miR-148b和let-7b则被记录为检测IgA肾病的新型生物标志物7。尽管深入了解miRNAs对IgA肾病的影响有助于进一步阐明其病因及治疗方法2，但目前尚未建立利用小型动物模型对IgA肾病中miRNAs进行谱型分析的标准方法2。
本文建立了一种简单且可靠的检测IgA肾病小鼠模型（HIGA小鼠）肾脏中miRNA表达水平的方法。HIGA小鼠是一种特征性的ddY品系，其血清IgA水平显著升高，并在肾小球中出现IgA的异常沉积8,9,10,11。因此，HIGA小鼠可作为IgA肾病的小鼠模型8,9,10,11。本方法包括四个主要步骤：首先，通过手术获取HIGA小鼠的肾脏样本；其次，将样本匀浆并利用基于硅胶膜的离心柱法提取总RNA；第三，通过逆转录反应由总RNA合成互补DNA（cDNA）；第四，采用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miRNA的表达水平。该方法的理论依据及结果的可靠性基于既往研究报道12,13。我们证明，该技术可用于在IgA肾病小鼠模型中准确测定miRNA的表达水平，并有望推动未来关于IgA肾病中miRNA的研究。

<table><tbody><tr><td>BALB/cCrSlc（25周龄，雌性）</td><td>Japan SLC, Inc.</td><td>无</td><td>对照小鼠</td></tr><tr><td>HIGA/NscSlc（25周龄，雌性）</td><td>Japan SLC, Inc.</td><td>无</td><td>IgA肾病小鼠模型</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学 96 孔反应板（用于 qRT-PCR）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>96 孔反应板</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学粘性封膜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>96 孔反应板用粘性封膜</td></tr><tr><td>miScript II RT 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>cDNA 合成实验试剂盒</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>总 RNA 提取实验试剂盒</td></tr><tr><td>miScript 引物检测（RNU6-2）</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>miRNA 特异性引物</td></tr><tr><td>miScript 引物检测（miR-155-5p）</td><td>Qiagen</td><td>MS00001701</td><td>miRNA 特异性引物</td></tr><tr><td>miScript 引物检测（miR-146a-5p）</td><td>Qiagen</td><td>MS00001638</td><td>miRNA 特异性引物</td></tr><tr><td>miScript 引物检测（miR-21-5p）</td><td>Qiagen</td><td>MS00009079</td><td>miRNA 特异性引物</td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>实时 PCR 实验试剂盒</td></tr><tr><td>QIA shredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>生物大分子剪切离心柱</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>实时荧光定量 PCR 仪器</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex 软件版本 1.2.1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>实时荧光定量 PCR 仪器配套软件</td></tr><tr><td>takara biomasher standard</td><td>Takara Bio</td><td>9790B</td><td>硅基匀浆器</td></tr></tbody></table>

免疫球蛋白a肾病小鼠肾脏中微小rna表达的检测

Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

IgA 肾病是一种以 IgA 异常沉积为特征的原发性肾小球肾炎，可导致终末期肾功能衰竭。近年来，已有研究报道微小 RNA（miRNA）参与了 IgA 肾病的发病机制。然而，目前尚无利用小型动物模型对 IgA 肾病中 miRNA 进行谱型分析的成熟方法。因此，我们建立了一种可靠的分析 IgA 小鼠模型（HIGA 小鼠）肾脏中 miRNA 的方法。本实验方案的目标是检测 HIGA 小鼠肾脏中 miRNA 表达水平的变化，并与对照组小鼠肾脏中的表达水平进行比较。简而言之，该方法包括四个步骤：1）获取 HIGA 小鼠的肾脏样本；2）从肾脏样本中纯化总 RNA；3）以总 RNA 为模板合成互补 DNA；4）对 miRNA 进行定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）。利用该方法，我们成功检测了 HIGA 小鼠肾脏中多种 miRNA（miR-155-5p、miR-146a-5p 和 miR-21-5p）的表达水平。这一新方法可应用于其他针对 IgA 肾病中 miRNA 谱型分析的研究。

我们检测了HIGA小鼠（n=10）肾脏中miRNA的表达水平，该结果完全基于所述实验方案获得。选择Balb/c小鼠的肾脏作为对照组（n=10）。两组均选择25周龄的小鼠。供应商仅能提供雌性HIGA小鼠。检测了三种miRNA（miR-155-5p、miR-146a-5p和miR-21-5p；图1）的表达水平，这些miRNA此前已被报道与IgA肾病相关15,16。采用t检验比较两组间的miRNA相对表达水平，以P &lt; 0.05为差异具有统计学意义。与对照组相比，HIGA组中miR-155-5p的表达水平高出3.3倍（P &lt; 0.001），miR-21-5p的表达水平高出1.58倍（P = 0.007）。miR-146a-5p在两组间的表达水平无显著差异。
<img alt="比较 Balb/c 和 HIGA 小鼠中 miRNA 表达（...

microRNA 参与了 IgA 肾病的发病机制。我们建立了一种可靠的方法，用于检测 IgA 肾病小鼠模型（HIGA 小鼠）肾脏中 microRNA 的表达水平。这一新方法将有助于验证 miRNA 在 IgA 肾病中的作用。

免疫球蛋白A肾病小鼠肾脏中微小RNA表达的检测

IgA 肾病是一种以 IgA 异常沉积为特征的原发性肾小球肾炎，可导致终末期肾病……

该方法可利用小型动物模型轻松验证IgA肾病中微小RNA的变化，从而无需进行人体肾活检即可研究IgA肾病。该实验方案可为IgA肾病的遗传学提供新的见解，有望推动该肾病新型诊断和治疗方法的发现。在确认小鼠已适当麻醉后，使用手术剪和镊子在小鼠腹壁做一条3至4厘米的正中切口，并辨认双侧肾脏。切开肋骨和膈肌以暴露心脏。切开右心房后，向左心室注射PBS，直至肾脏颜色变为浅黄色，表明小鼠全身已用PBS灌注。切断肾动脉、肾静脉和输尿管，然后取出肾脏。使用硅基匀浆器和700微升基于苯酚胍的裂解试剂，在室温下匀浆30毫克的肾组织样本。将裂解液转移至生物聚合物破碎离心柱中，在室温下以15,000 G离心两分钟。随后按照文稿说明继续进行RBNA纯化。最后一次洗涤后，向基于二氧化硅膜的离心柱中加入 30 微升无核酸酶水，以 8,000 G 离心一分钟，以洗脱 RNA。进行 cDNA 合成时，每份样品准备一个总体系为 8 微升的预混液，包含 2 微升核酸混合物、2 微升逆转录酶混合物和 4 微升缓冲液。将 8 微升预混液加入八联管条的每个孔中。将总RNA溶于无核酸酶的水中。然后，取12微升总RNA溶液加入条板的每个孔中。将样品置于热循环仪中，于37摄氏度孵育60分钟，随后在95摄氏度孵育5分钟。为了进行定量实时 PCR，按照手稿说明配制主混合液，然后向 96 孔反应板的每个孔中加入 22.5 微升主混合液。向每个孔中加入 2.5 微升已制备好的 cDNA。将反应板放入实时 PCR 仪器中。然后，设置程序：95 摄氏度初始激活 15 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环包括 94 摄氏度变性 15 秒、55 摄氏度退火 30 秒、70 摄氏度延伸 30 秒。采用 ΔΔCT 法定量基因表达。本方案用于检测 HIGA 小鼠肾脏中 microRNA 的表达水平，并以 Balb/c 小鼠肾脏作为对照。检测了三种与IgA肾病相关的microRNA的表达水平。采用T检验比较两组间microRNA的相对表达水平，以P值小于0.05为差异具有统计学意义。与对照组相比，HIGA组中miR-155-5p的表达水平高出3.3倍，miR-21-5p的表达水平高出1.58倍。miR-1461-5p 的表达在两组之间无显著差异。在实施本方案时，应佩戴口罩、手套和帽子，并保持实验台和实验工具清洁，以防止环境中核酸酶对实验造成影响。本实验方法目前在本实验室中已投入实际应用。其目标是建立IgA肾病的新型诊断和治疗方法。

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检测免疫球蛋白A肾病小鼠肾脏中的microRNA表达

MicroRNA 原位 福尔马林固定肾脏组织的杂交检测

本方案描述了应在肾小球疾病小鼠模型中进行的完整肾脏检查。这些方法可对肾小球功能进行详细的功能性、结构性和机制性分析，适用于所有肾小球疾病的小鼠模型。...

肾小球疾病小鼠模型中肾功能的评估

本文介绍了一种利用生物素对小鼠肾小球细胞表面蛋白进行体内标记的实验方案。该方案包含小鼠肾脏灌注、肾小球分离以及目标蛋白内源性免疫沉淀的操作方法。...

肾小球的分离与 体内 肾小球细胞表面蛋白标记

本文介绍了一种利用实时定量反转录聚合酶链式反应检测急性肾损伤小鼠模型肾脏中微小RNA表达水平的实验方案。该方案重点针对缺血性肾损伤小鼠模型，并强调微小RNA样本的精细提取过程。...

一种用于缺血性肾损伤小鼠模型肾脏中 microRNA 定量检测的方法

我们描述了一种通过定量反转录聚合酶链式反应检测单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠肾脏中microRNA表达水平的方法。该方案适用于研究UUO小鼠以及其他病理条件下小鼠肾脏microRNA的表达谱。...

小鼠单侧输尿管梗阻模型中microRNA表达的定量实时PCR分析

我们介绍了一种通过定量反转录聚合酶链式反应来评估伴有年龄依赖性肾功能损伤的小鼠肾脏及血清中微小RNA表达水平的方法。...

基于年龄相关性肾功能损伤小鼠肾脏与血清中微小RNA表达的定量实时聚合酶链式反应检测

在此，我们将外源性人工合成的miRNA模拟物递送至肾脏 通过 在多种肾脏疾病小鼠模型中，通过尾静脉注射非病毒载体和聚乙烯亚胺纳米颗粒，导致肾脏中靶向miRNA显著过表达，从而抑制了多种小鼠模型中肾脏疾病的进展。...

利用聚乙烯亚胺纳米颗粒在多种肾病小鼠模型中向肾脏递送外源性人工合成的miRNA模拟物

本实验方案描述了一种在小鼠中追踪狼疮进展的方法。另外提供了两种实验程序，用于通过肾脏中的细胞浸润和蛋白质沉积来表征狼疮性肾炎。...

狼疮易感型MRL/lpr小鼠蛋白尿、肾脏白细胞浸润及肾脏蛋白沉积的分析

本研究提供了使用薯蓣皂苷（Dioscin, DIO）治疗免疫球蛋白A肾病（IgAN）的实验数据，DIO是某些植物中的活性成分 穿山龙 丹参根茎（DNR），以及研究中药作用及其潜在机制的范式 体内 和 体外.

薯蓣皂苷通过抑制B细胞活化缓解IgA肾病 在体实验 并减少半乳糖缺陷型IgA1的产生 体外

本方案描述了一种在小鼠中诱导单侧输尿管梗阻（UUO）的方法，用于研究梗阻性肾病中组织纤维化的进展。内容包括手术操作、术后护理以及纤维化评估方法。...

单侧输尿管梗阻模型用于研究肾间质纤维化

了解检测免疫球蛋白A肾病小鼠肾脏中microRNA表达的方法。该技术使用HIGA小鼠模型，通过定量实时PCR分析miRNA水平，为研究IgA肾病遗传机制及开发新诊断和治疗方法提供可靠途径。

免疫球蛋白A肾病小鼠肾脏中微小RNA表达的检测

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