免疫球蛋白A肾病小鼠肾脏中微小RNA表达的检测
2020年7月8日
microRNA 参与了 IgA 肾病的发病机制。我们建立了一种可靠的方法，用于检测 IgA 肾病小鼠模型（HIGA 小鼠）肾脏中 microRNA 的表达水平。这一新方法将有助于验证 miRNA 在 IgA 肾病中的作用。
该方法可利用小型动物模型轻松验证IgA肾病中微小RNA的变化，从而无需进行人体肾活检即可研究IgA肾病。该实验方案可为IgA肾病的遗传学提供新的见解，有望推动该肾病新型诊断和治疗方法的发现。在确认小鼠已适当麻醉后，使用手术剪和镊子在小鼠腹壁做一条3至4厘米的正中切口，并辨认双侧肾脏。
切开肋骨和膈肌以暴露心脏。切开右心房后，向左心室注射PBS，直至肾脏颜色变为浅黄色，表明小鼠全身已用PBS灌注。切断肾动脉、肾静脉和输尿管，然后取出肾脏。
使用硅基匀浆器和700微升基于苯酚胍的裂解试剂，在室温下匀浆30毫克的肾组织样本。将裂解液转移至生物聚合物破碎离心柱中，在室温下以15,000 G离心两分钟。随后按照文稿说明继续进行RBNA纯化。
最后一次洗涤后，向基于二氧化硅膜的离心柱中加入 30 微升无核酸酶水，以 8,000 G 离心一分钟，以洗脱 RNA。进行 cDNA 合成时，每份样品准备一个总体系为 8 微升的预混液，包含 2 微升核酸混合物、2 微升逆转录酶混合物和 4 微升缓冲液。将 8 微升预混液加入八联管条的每个孔中。
将总RNA溶于无核酸酶的水中。然后，取12微升总RNA溶液加入条板的每个孔中。将样品置于热循环仪中，于37摄氏度孵育60分钟，随后在95摄氏度孵育5分钟。
为了进行定量实时 PCR，按照手稿说明配制主混合液，然后向 96 孔反应板的每个孔中加入 22.5 微升主混合液。向每个孔中加入 2.5 微升已制备好的 cDNA。将反应板放入实时 PCR 仪器中。
然后，设置程序：95 摄氏度初始激活 15 分钟，随后进行 40 个循环，每个循环包括 94 摄氏度变性 15 秒、55 摄氏度退火 30 秒、70 摄氏度延伸 30 秒。采用 ΔΔCT 法定量基因表达。本方案用于检测 HIGA 小鼠肾脏中 microRNA 的表达水平，并以 Balb/c 小鼠肾脏作为对照。
检测了三种与IgA肾病相关的microRNA的表达水平。采用T检验比较两组间microRNA的相对表达水平，以P值小于0.05为差异具有统计学意义。与对照组相比，HIGA组中miR-155-5p的表达水平高出3.3倍，miR-21-5p的表达水平高出1.58倍。
miR-1461-5p 的表达在两组之间无显著差异。在实施本方案时，应佩戴口罩、手套和帽子，并保持实验台和实验工具清洁，以防止环境中核酸酶对实验造成影响。本实验方法目前在本实验室中已投入实际应用。
其目标是建立IgA肾病的新型诊断和治疗方法。
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概述
本研究提出了一种在IgA肾病小鼠模型肾脏中检测微小RNA表达水平的可靠方法。该方法可在无需进行人类肾活检的情况下，研究微小RNA在IgA肾病中的参与作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 肾脏病学
- 微小RNA研究
- 动物模型
背景
- IgA肾病是一种以IgA在肾小球沉积为特征的肾脏疾病。
- 微小RNA在多种疾病（包括肾脏疾病）的发病机制中发挥重要作用。
- 了解微小RNA的表达有助于揭示疾病的发病机制。
- 目前研究微小RNA的方法通常需要侵入性操作。
研究目的
- 建立一种在IgA肾病小鼠模型中检测microRNA水平的方法。
- 促进IgA肾病遗传学方面的研究。
- 探索肾脏疾病的潜在诊断和治疗策略。
使用的方法
- 使用HIGA小鼠作为IgA肾病的模型。
- 在手术前对小鼠实施麻醉。
- 进入肾脏的外科手术技术，包括腹中线切口和器官摘除。
- 用PBS灌注小鼠，为肾脏提取做准备。
主要结果
- 该方法可简便地验证IgA肾病中微小RNA的变化。
- 通过该方法获得的见解有助于开发新的诊断工具。
- 有望发现治疗IgA肾病的新治疗策略。
- 在初步研究中无需进行人类肾脏活检。
结论
- 该方法有助于加深对微小RNA在IgA肾病中作用的理解。
- 它为肾脏疾病遗传学的研究开辟了新的途径。
- 该方法可能对未来诊断和治疗的发展产生重大影响。
常见问题
行业重要性概述
本方案使生物制药研发团队能够在经过验证的IgA肾病小鼠模型中分析microRNA表达谱，从而支持肾脏疾病项目中的靶点验证和作用机制去风险化。该方法提供了一种可重复的技术，用于检测miRNA水平的变化，无需依赖人体活检，有助于更早地发现具有更高预测可信度的生物标志物和治疗靶点。该策略与发现阶段的研究工作相一致，可用于探究疾病机制，并优先筛选候选分子进入临床前开发。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过量化HIGA小鼠与对照组之间疾病相关miRNA表达变化，可验证治疗假设。
- 操作价值：提供了一种可靠的qRT-PCR功能靶点验证工作流程，用于检测miR-155-5p、miR-21-5p和miR-146a-5p的表达水平。
- 预测价值：通过识别具有统计学显著性倍数变化的miRNA（例如miR-155-5p变化3.3倍），支持项目组合的优先筛选，作为潜在生物标志物或靶点。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：提供适用于发现性筛选实验中检测标准化的定量、可重复的miRNA表达数据。
- 操作价值：建立与高通量qRT-PCR平台兼容的标准化RNA纯化和cDNA合成流程。
- 检测就绪性：采用ΔΔCT法生成归一化的CT值，实现样本间的比较与阳性结果的确认。
转化与临床前研究
- 转化价值：采用与疾病相关的HIGA小鼠模型，将miRNA介导通路的发现结果与临床前验证相衔接。
- 机制去风险化：可评估与IgA沉积相关的miRNA表达变化，从而在先导化合物确定前降低靶点机制的不确定性。
- 临床前连续性：通过对各研究组间肾组织提供一致且可量化的读数，支持基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
该方法适用于早期发现阶段，可支持靶点验证中的假设检验，并为筛选和分析工作流程提供定量输出，从而为先导化合物的识别决策提供依据。
- 发现生物学：利用遗传性小鼠模型，通过检测与IgA肾病发病机制相关的miRNA表达变化，阐明疾病通路。
- 筛选：生成标准化、定量的miRNA数据，可用于在下游实验中评估化合物对靶向通路的影响。
- 分析：提供ΔΔCT值和倍数变化指标，使研究团队能够比较不同实验条件并使用T检验评估统计学显著性。
- 转化研究：通过使用经验证且具有表型相关性的IgA肾病模型，将发现阶段的miRNA研究成果与临床前研究衔接起来。
- 企业级复用：建立可重复使用的RNA提取和qRT-PCR实验流程，适用于多个肾脏疾病项目中的不同miRNA靶点研究。
运营与企业影响
- 科学价值：通过在疾病模型中直接检测miRNA的异常表达，减少机制上的不确定性，从而提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过明确的RNA纯化、cDNA合成和qRT-PCR参数（例如8,000 G离心、37°C孵育）确保实验的可重复性和标准化。
- 战略价值：提供具有统计学显著性的表达数据（p<0.05），有助于优先选择与疾病关联性强的靶点，从而优化“继续/终止”决策。
- 项目组合影响：根据表达倍数变化幅度和可重复性，实现对基于miRNA的生物标志物或治疗靶点的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 需要具备啮齿类动物手术、RNA 操作和定量反转录 PCR（qRT-PCR）的专业技能，以防止核酸酶降解并确保样本完整性。
- 依赖于组织匀浆设备、离心机、热循环仪以及配备荧光检测功能的实时 PCR 仪器的可用性。
- 需要在不同实验团队之间对 RNA 加样量（30 mg 肾脏组织）、试剂体积（700 μL 裂解试剂）和扩增循环条件（95°C 激活，40 个循环）进行标准化。
- 需要针对特定 miRNA 目标调整引物序列，同时保持退火温度（55°C）和延伸温度（70°C）的一致性。
- 仅限于终点 RNA 分析；若无其他附加技术，无法在肾脏组织中提供空间定位或单细胞分辨率信息。
